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要約

挑戦している宿主細胞に細菌によって分泌されるエフェクターを監視する蛍光タンパク質ベースのアプローチ。これは蛍光タンパク質とタイプ III の分泌システムとの互換性がないのためにです。ここでは、最適化された分割 superfolder GFP システムはホスト植物の細胞に細菌によって分泌されるエフェクターの可視化に使用されます。

要約

菌は, 各種の植物病害の最も重要な病原は、植物の免疫システムを破壊する宿主植物細胞にエフェクターのセットを分泌します。感染時に細胞質のエフェクターはタイプ III の分泌システム (T3SS) を介してホスト細胞質に配信されます。植物細胞には、出産後、effector(s) は生存と病原体のレプリケーションのためのホスト細胞プロセスを調整する特定の区画を対象します。蛍光タンパク質を用いた病原性でその機能を理解する宿主細胞のエフェクター蛋白質の局在や細菌から直接注入されるエフェクターのダイナミクスの解明に関するいくつかの研究があったもののT3SS と蛍光タンパク質との間の非互換性のためにチャレンジしております。

ここでは、エフェクター細胞内細菌 T3SS を介して配信の局在に最適化された分割 superfolder 緑の蛍光蛋白質システム (sfGFPOPT) の最新手法について述べる。SfGFP11 (11th β 鎖の sfGFP)-サイトで蛍光発光するターゲット特定のオルガネラ sfGFP1 10OPT (1-10th β 鎖 sfGFP の) リード、T3SS から分泌されるタグのエフェクターを組み立てることができます。このプロトコルは、シロイヌナズナとベンサミアーナ タバコ植物の特定の細胞小器官の腐からエフェクター蛋白質と再構成された sfGFP 蛍光信号を視覚化するための手順を提供します。

概要

植物は、細菌、真菌、ウイルス、昆虫、線虫のライフ サイクル全体を含む多数の侵入病原体が発生する付着生物です。病菌属やシュードモナス属などのグラム陰性の細菌性病原体、植物の中で傷や気孔、イネなどの自然開口部を介して入力することによって宿主植物に感染する1。正常にホスト植物を植民地化、細菌性病原体は様々 な病原性因子2を開発する進化しています。細菌には、宿主の植物が侵入する、彼らは病原性タンパク質のシリーズを注入-エフェクターとして知られている-病原性を促進するために植物細胞に直接。これらのエフェクターを抑制する植物の免疫を調節するや細菌生存3が発生するホストの細胞プロセスを操作します。

病原細菌は、主にホスト セル4に直接エフェクタータンパク質を提供するのに、T3SS を使用します。T3SS ホスト細胞5の注射部位に内側と外側の細菌膜足場タンパク質の構造から接続する針のようなチャネルを持つ分子注射器に似ています。この T3SS を介したエフェクター (T3E) 分泌メカニズムが人間と同様に植物の様々 なグラム陰性細菌病原体でよく保存されています。代表的な植物病原体、 P. 腐pv の一つ。トマト欠陥 T3SS の通常ある DC3000 hrcC変異は、この突然変異体植物 (エフェクター蛋白質を注入する) による免疫6を完全に抑制するのことができない可能性があります植物の成長を制限しています。宿主細胞への移行、時にエフェクター対象植物防御反応、遺伝子の転写、細胞死、プロテアソーム、小胞の売買、およびホルモン経路7を含め、ホスト細胞システムにとって重要な様々 なホスト蛋白質,8,9,10します。 したがって、宿主細胞のエフェクター蛋白質の局在の追跡は植物の免疫系の変調に関してその機能を理解するための魅力的なターゲットです。

T3Es の局在論のほとんどは、アグロバクテリウム-仲介されたホスト植物9に大きな蛍光タンパク質の過剰発現を採用しています。ただし、他の種で導入された遺伝子の異種表現方法は誤ってローカライズ済みまたは時折機能的な11,12,13に示されています。さらに、いくつかの研究は、細菌のエフェクターがホスト細胞報14,15,16,17の適切なターゲットのための変更を受けることを明らかにしました。したがって、一過性細胞は機能的または定量的病原体感染18時 T3SS によって配信されるエフェクターと同じかもしれない植物の細胞質内のエフェクタを表明しました。また、適切なエフェクターの配信と可視化18,19を破壊するエフェクタータンパク質に大きな蛍光タグ融合かもしれない。したがって、完全に T3E 関数を試金するこれらのアプローチは T3SS 分泌エフェクタのネイティブのローカライズを反映可能性があります。

緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発色団20含まれています中央の鎖を囲む 11 鎖 β バレルで構成されます。ワルドら小さな部品で構成される新規分割 GFP システムを報告 (GFP β ストランドの 11;GFP11) と大規模な相補的なフラグメント (GFP β ストランド 1-10;GFP1-10)21。フラグメント自ら発するかないが、両方のフラグメントは、互いに近接するとき自己集合時に蛍光を発する。蛋白質折りたたみ効率の最適化のため、GFP、すなわちsfGFP と sfGFPOPT、堅牢な折りたたみ変形後分割 GFP システム20,21,22 のため開発されました。最近では、単一のアミノ酸変異亜種 sfGFP1 10 のOPT- sfYFP1 10OPTと sfCFP1 10OPT- をそれぞれ sfGFP11 フラグメントとを黄色とシアン蛍光再構成することができます, 生成された23.さらに、sfCherry、mCherry の派生物を裂くことができる sfGFP23と同じ方法で sfCherry1 10 と sfCherry11 の断片に。

このシステムは、ラベルおよびサルモネラ24.からエフェクタを使用して感染中に HeLa 細胞における T3SS エフェクタを追跡に適応されています。ただし、それは以前最適化されていないホスト植物細菌病原体システムのため。最近では、我々 は植物細胞25にP. 腐から配信される T3Es の細胞内分布を監視する改良された sfGFP1 10OPTに基づく分割 GFP システムを最適化しました。様々 な細胞内コンパートメントに sfGFP1 10OPTを表現する生成された植物形質転換シロイヌナズナの植物細胞で異なる細胞内コンパートメントに T3Es の局在論を容易にするには、25です。 また、さまざまなを運ぶプラスミッド オルガネラ sfGFP1 10オプトインターゲットを絞ったアグロバクテリウム-仲介された一時的な過剰発現と T3SS ベース エフェクター配信用タグ付きの sfGFP11 ベクトルが生成されたも。様々 な形質転換シロイヌナズナラインと関心の T3Es を表現するプラスミッドの種子は、材料表26,27に記載されているソースから取得できます。

次のプロトコルの分割 sfGFP システムを用いたホスト細胞内の細菌によって配信エフェクタの原動力を監視する最適化されたシステムについて述べる.組換え sfGFP11 プラスミドを運ぶ遺伝子組換え菌と sfGFP1 10OPTを発現する植物の感染結果 sfGFP11 タグ エフェクタの宿主細胞に緑膿菌からの配信。したがって、これらの蛋白質は再構成された、特定対象区画に若し。腐の pv。トマトCUCPB5500 ひずみ 18 エフェクタが削除されますは、この株はシロイヌナズナと(名) ベンサミアーナs28低またはない細胞死を示したので使用されました。ただし、すべての材料とここで説明する手順、交換または他の生物学的質問や与えられた実験室の条件の最適化の調査の分割 sfGFP システムに適応するように変更できます。

プロトコル

注: 特に明記しない限り、すべての手順が常温で実行をされます。

1. 植物材料 (4 週間) の準備

  1. (名) 形質転換植物のための準備
    1. 各ポットの土の表面に(名) ベンサミアーナの 2 種をまく、プラスチック製のドームを持つトレイを蓋をして 25 ° C、16/8 h/暗日長サイクル 60% 湿度成長室で発芽する種子を許可します。
    2. 2 週間後を選ぶと各ポットに小さな芽を破棄し、ステップ 1.1.1 の発芽の同じ成長の条件の下で植物を成長を続けます。2 日毎トレイあたりの水の 1 リットルを追加します。
      注: ラボ間植物の成長の条件が異なる場合があります。したがって、健全な状態で植物を育てる正規の水まきプロトコルに従います。
    3. 週に新しいトレイに植物を転送し、さらなる成長のための十分なスペースを配置します。4 週齢に潜入する準備ができるまで、手順 1.1.1 で説明した条件の下で植物の成長を維持します。
      注: 植物の成長は、ラボ間成長条件によって異なる場合があります。通常、我々 は 4 週齢を見つける(名) 形質転換植物負担約六つの葉。
  2. シロイヌナズナ形質転換植物のための準備
    1. 材料表を参照し、形質転換シロイヌナズナ種子の注文します。
    2. 1 mL の蒸留水に 50 ~ 100 形質転換シロイヌナズナ種子を浸漬し、発芽の発症を同期する暗闇の中で 3 日間の 4 ° C で保存します。
    3. プラグ工場トレイの土壌表面に 2 ~ 3 種をまくし、プラスチック製のドームとトレイをカバーします。23 ° C、10/14 h/暗日長サイクル 60% 湿度で発芽する種子を許可します。
      注: 種子についてをする必要があります。ただし、バッチ内の遺伝子の存在を再確認をお勧めします。この場合、70% エタノール、50% の漂白剤の 2 分間洗浄することにより種子を殺菌する (約 2% 次亜塩素酸) 0.05% を含む 5 分トリトン X-100 に従う二重滅菌蒸留水 (ddH2O) で 5-6 回を洗浄します。滅菌後、3 日間の 4 ° C で分類や形質転換植物を選択する hygromycin B の 25 μ g/L を含む植物発芽メディアにそれらを板します。
    4. 週後に、プラグあたり 1 つだけの工場を残して、ステップ 1.2.3 の使用同じ成長の条件の下で植物の成長を続けます。
      注: 4 週古い植物は、 P. 腐感染に使用されました。水植物は植物を健康に保つために毎日。

2.緑膿菌文化 (〜 1 週) の準備

  1. 緑膿菌の変換のプラスミドの建設
    1. 材料表を参照し、T3SS ベース エフェクター配信システム ベクター25の目的の vector(s) を注文します。
    2. 25をクローニング部位特異的組換えを使ってエフェクタ配信ベクトルに興味のエフェクター遺伝子を挿入します。
      メモ: フルレングス エフェクター蛋白質の細胞内局在を監視する場合は、pBK-GW-1-2 または pBG-GW-1-2 にフルレングスの遺伝子を置きます。PBK-GW-1-4 を選択するもまたは pBG GW 1 4 2 を含む x sfGFP11 の蛍光信号を増加しました。シグナルペプチドを欠けている部分的なエフェクター、場合 pBK-GW-2-2 または pBK-GW-2-4 を使用します。公園らエフェクター配信ベクトル25の詳細についてを参照してください。
  2. P. 腐pv sfGFP11 タグに融合したエフェクターを運ぶプラスミッドを変換します。トマト(Pst)CUCPB5500 標準エレクトロポレーション29を使用します。
    注: 必要な場合は、他の緑膿菌種を使用できます。広範囲なベクトル30 sfGFP11 タグのシステムを構築し、エフェクターの遺伝子発現は、緑膿菌などのfluorescens (イーサン)31に匹敵する AvrRpm1 のプロモーターによって規制されています。
  3. 変形菌を 25 μ G/ml ゲンタマイシンや 25 μ G/ml カナマイシン 100 μ g/mL リファンピシンを含む王の B 寒天の表面に優しく します。2 日間の 28 ° C の孵化させなさい。
  4. 使用すると、ベクトルの適切な抗生物質で王の B 液体メディアに 1 つのコロニーを接種して 200 rpm で振とうしながら一晩で 28 ° C 細胞の成長します。
  5. グリセロール ストックを作る。オートクレーブのグリセロールを最終濃度 50%、-80 ° C でストアに追加します。

3. (名) ベンサミアーナ(4 日間) で細胞小器官をターゲットとした sfGFP1 10OPTの一過性発現

  1. アグロバクテリウム文化の準備
    1. (材料の表を参照してください) の細胞小器官をターゲットとした sfGFP1 10OPT plasmid(s) の目的の vector(s) を注文します。
    2. アグロバクテリウムひずみ GV3101 細胞32plasmid(s) に変換します。2 日間の 50 μ g/mL カナマイシンと 28 ° C で 50 μ g/mL リファンピシン ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天培に細胞を成長します。
    3. LB 寒天培地の単一コロニーから 5 mL の液体 LB 培地 50 μ G/ml カナマイシンおよび 50 μ G/ml のリファンピシンに細胞を接種します。200 rpm で振とうしながら一晩で 28 ° C 細胞を成長します。
    4. 3,000 x g で 10 分間の遠心分離によって細胞培養上清中のメディアを注ぐし、たての 1 mL にペレットを再懸濁します収穫した浸潤バッファーです。
    5. 600 の吸光度で光学濃度 (OD) の値を取得することによってアグロバクテリウムの量を測定 (Abs 600 nm) の nm。浸潤バッファーと 0.5 に細菌の OD600を調整します。
      注: 懸濁液の 1 mL は、2 つのスポットに潜入するのに十分です。
    6. 常温浸透前に 1-5 h の穏やかなロッカーに文化を残します。
    7. 10 μ L チップと潜入する葉の中心に穴を突きます。アグロバクテリウムの懸濁液に潜入するのに 1 mL の無針注射器を使用します。慎重に、ゆっくりと注入する注射器を介して葉の向軸側にステップ 3.1.5 から調製した懸濁液の約 500 μ L。実験的複製に対して、少なくとも 3 つの異なる植物に浸透を繰り返します。
      注: 保健及び安全性の理由から、眼の保護は浸透中に着用する必要があります。
    8. 葉の残りの細菌懸濁液を拭き取るし、浸透した領域の境界をマークします。
    9. 2 日間ステップ 1.1.1 の使用同じ成長の条件の下で浸透した植物を保ちます。

4.膿(4 日間) の接種

  1. 2 日間の 28 ° C で適切な抗生物質で王の B 寒天にステップ 2.5 のグリセロール ストックから変換された緑膿菌のひずみを連勝します。
    注:緑膿菌の健康は非常に重要です。植民地にもなっていない場合、セルを再び連勝または進む前に王の液体培地における細胞に伝達します。
  2. マンニトール グルタミン酸 (MG) 一晩 200 rpm で振とうしながら 28 ° C で液体培地における緑膿菌細胞の loopful を接種します。
  3. 3,000 x g で 10 分間の遠心分離によって細胞を培養上清中のメディアを注ぐ収穫 10 mM MgCl2でペレットを再懸濁し、0.02 (1 x 107 cfu/mL) に外径600を調整(名) ベンサミアーナ葉と 0.002 (1 x 106cfu/mL)シロイヌナズナの葉.の
  4. (名) ベンサミアーナ、sfGFP1 10OPTコンストラクトを運ぶアグロバクテリウムが以前 (ようにステップ 3.1.7) 2 日浸透していた葉の領域に緑膿菌懸濁液を浸透します。SfGFP1 10OPT形質転換シロイヌナズナ、2 つ 4 週齢短い日成長して葉に緑膿菌懸濁液を浸透します。
    注: 少なくとも 3 つの植物実験複製が必要です。

5. sfGFP 共焦点顕微鏡 (1 日) を介して信号の観測

  1. 緑膿菌からリーフ ディスクをカット-の葉を接種しました。緑膿菌を浸潤した特定の時間ポイントで画像 40 X を用いた共焦点走査型レーザーによる単一の植物からの 2 つの 2 cm2リーフ ディスク/1.2 NA C アポクロマート水浸対物レンズまたは 63 X/0.8 NA C アポクロマート油浸漬目的。負傷によって殺される死んだ細胞を避けるためには、浸透孔から細胞を観察します。
  2. 488 nm アルゴン レーザーの低消費電力設定で観察を開始します。SfGFP を検出するレーザー力を高めます。
    注:、蛍光シグナルを検出するのにレーザー強度の 2-15% を通常使用します。ただし、レーザーの出力と検出設定調整してくださいユーザーの顕微鏡システムに基づいて。ここでは、放出フィルターは 520-550 nm に設定されました。死んだ細胞はしばしば 488 nm レーザー励起下における自動蛍光を発する。したがって、ネガティブ コントロールとして sfGFP11 タグなし同じエフェクターを浸透し、同じ観測条件下で観察する必要があります。さらに、高いレーザー励起はクロロフィルの自家蛍光を引き起こすことができます。したがって、クロロフィルの自家蛍光を誘発しないようにコントロール植物細胞を用いたレーザー光源の強度を調整します。
    1. 細胞壁の counterstaining の 20 mM propidium ヨウ化 (PI) を観測する前に 5-10 分でリーフ ディスクに潜入させます。
    2. 核染色、水で洗浄後 5 分 0.1% パラホルムアルデヒドにリーフ ディスクが水没します。その後、顕微鏡観察の前に 5-10 分でリーフ ディスクに 10 mM PI に潜入します。少なくとも 3 回実験を繰り返します。
      注: この手順は重要な膜や核でエフェクターのローカリゼーションを定義する役に立つです。関心のエフェクターは、特定の細胞小器官の局在を示した場合は、エフェクターの局在を確認する特定の細胞小器官のマーカーを使用します。

結果

GFP の β バレル構造は 11 β ストランドの構成され、2 つのフラグメント、1 10thストランド (GFP1 10OPT) および 11th (GFP11) 繊維に分けることができます。どちらも 2 つのフラグメントを自分で蛍光の自己組織化 sfGFP は近接 (図 1 a) 2 つのフラグメントが存在するとき蛍光を生成できます。このシステムは、sfGFP1 10OPTで-?...

ディスカッション

ここで説明したプロトコルを使用して、感染にホスト植物細胞注入の細菌 T3SS エフェクタータンパク質の正確な局在を監視するため。以前は、分割 GFP システムは哺乳類タンパク質23,36の内局、サルモネラT3E ローカリゼーション、アグロバクテリウムVirE2 配信に T4SS を通じて研究するツールとして使用された、植物は細胞...

開示事項

著者はある利益相反を開示します。

謝辞

この研究は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省、ICT および DC の将来計画 (NRF 2018R1A2A1A05019892)、(植物分子育種センターからの助成金を資金によって支えられました。PMBC) の EP に農村開発局 (PJ013201) の次世代 Biogreen 21 プログラムの撮影のための共焦点顕微鏡を提供する環境管理センター計装のイメージング センターに感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis transgenic linesPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmidPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery systemPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination mediaAdd 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitaminsDuchefa BiochemieM0222Store at 4 °C.
SucroseDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB mediaAdd 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
TryptoneBD Bioscience211705
Yeast extractBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
Micro agarDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptoneBD Bioscience212120
Anhydrous K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
GlycerolDuchefa BiochemieG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Bioscience214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
MannitolDuchefa BiochemieM0803
L-glutamic acidDuchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
Infiltration buffer10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MESDuchefa BiochemieM1503Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2Sigma-AldrichM8266Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal systemCarl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscopeCarl Zeiss
Propidium iodideThermoFisherP1304MP

参考文献

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