JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

Abstract

חיידקים, אחד מסוכני סיבתי החשוב ביותר של מחלות שונות, מפרישים קבוצת אפקטור חלבונים בתא צמח המארח כדי לערער את המערכת החיסונית של הצמח. במהלך זיהום cytoplasmic effectors מועברות ציטוזול מארח דרך סוג מערכת הפרשת השלישי (T3SS). לאחר הלידה בתא צמח, effector(s) מטרות של compartment(s) ספציפיים כדי לווסת את תהליכי התא מארח עבור הישרדות, שכפול של המחלה. אמנם יש כבר כמה מחקרים לוקליזציה subcellular אפקטור חלבונים בתאי המארח כדי להבין את תפקידם בפתוגניות באמצעות חלבונים פלורסנט, חקירה של הדינמיקה של effectors מוזרק ישירות מחיידקים מאתגרת בשל בעיית אי התאימות בין T3SS לבין חלבונים פלורסנט.

כאן, אנו מתארים את השיטה האחרונה שלנו מפוצל ממוטב superfolder חלבון פלואורסצנטי ירוק במערכת (sfGFPהכבושים) לדמיין הלוקליזציה של effectors באמצעות T3SS חיידקי התא המארח. SfGFP11 (11ה β-גדיל של sfGFP)-אפקטור מתויג מופרש דרך T3SS יכול להיות שהתכנסה עם אברון ספציפי ממוקד sfGFP1-10OPT (1-10בתאנון β-גדיל של sfGFP) מוביל פליטת קרינה פלואורסצנטית באתר. פרוטוקול זה מספק הליך להמחיש את האות זריחה sfGFP משוקם עם חלבון אפקטור מ Pseudomonas syringae אברון מסוים את הצמחים תודרנית , טבק benthamiana .

Introduction

צמחים הם אורגניזמים sessile המפגש פתוגנים פולשים רבים, כולל חיידקים, פטריות, וירוסים, חרקים, נמטודות לאורך כל מחזור החיים שלהם. בקרב phytopathogens, פתוגנים חיידקי גראם שליליים כגון Pseudomonas spp. ו- Ralstonia spp., להדביק צמחים פונדקאים שלהם על-ידי הזנת דרך פצעים או פתחים טבעיים, כגון הפיוניות, hydathode1. ליישב בהצלחה צמחים פונדקאים, פתוגנים חיידקיים התפתחו לפתח מגוון של גורמים התקפה אלימה2. כאשר חיידקים לפלוש צמח המארח, הם מזריקים סדרה של התקפה אלימה חלבונים – המכונה effectors — ישירות לתוך תאי צמחים כדי לקדם פתוגניות שלהם. Effectors האלה לדכא או לווסת את הצמח מולדת חסינות ולטפל התהליכים הסלולר מארח את התוצאה הישרדות חיידקי3.

חיידקים פתוגניים להשתמש בעיקר של T3SS כדי לספק אפקטור חלבונים ישירות לתוך התאים מארח4. T3SS דומה מזרק מולקולרית עם ערוץ דמוי מחט, התחברות של מבנה החלבון לגרדום מעבר הפנימי, החיצוני חיידקית בקרום ההזרקה של התא המארח5. מנגנון הפרשת זה אפקטור בתיווך T3SS (T3E) הוא שנשמרת היטב ב פתוגנים חיידקיים גראם שליליים שונים של הצמח, כמו גם בני אדם. אחד פתוגנים צמח נציג, pv syringae פ . עגבניות מוטציה hrcC DC3000 אשר כולל בדרך כלל T3SS פגומים, הגביל צמיחת צמחים ככל הנראה בגלל חוסר יכולת זו מוטציה לדכא לגמרי את הצמח חסינות (באמצעות הזרקת אפקטור חלבונים)6. על טרנסלוקציה לתוך התאים מארח, effectors מטרה שונים המארח חלבונים חשובים עבור מערכת התא המארח, לרבות תגובות הגנה צמח, שעתוק גנים, מוות של תאים, פרוטאוזום, שלפוחית סחר הורמון מסלולים7 , 8 , 9 , 10. לפיכך, מעקב של לוקליזציה הסלולר של החלבונים אפקטור בתאי המארח הוא ליעד אטרקטיבי כדי להבין את הפונקציות שלהם ביחס אפנון של החסינות הצמח.

רוב המחקרים לוקליזציה של T3Es המועסקים Agrobacterium -מתווכת ביטוי עם חלבון גדול זריחה ב צמח מארח9. עם זאת, שיטת heterologous ביטוי גנים אשר הציג בחיות אחרות הוכח להיות מותאם בצורה שגויה או מדי פעם שאינם פונקציונליים11,12,13. בנוסף, מספר מחקרים חשף כי חיידקי effectors עוברים שינוי עבור פילוח הנכונה המארחת תאים14,15,16,17. לכן, transiently הביע effectors ב ציטוזול של הצמח תאים לא יכול להיות פונקציונלית או באופן כמותי זהה effectors אשר מועברים על ידי T3SS על הפתוגן זיהום18. יתר על כן, היתוך גרעיני גדול תגים פלורסנט אפקטור חלבונים עלולות לשבש אפקטור נאות משלוח והדמיה18,19. לכן, אלה גישות assay הפונקציה T3E עשוי משקף באופן מלא לוקליזציה מקורית של effectors T3SS-מופרש.

חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מורכב של גדילי 11 β-חבית תוחמת חוט מרכזי הכולל כרומופור20. וולדו. et al. דיווח מערכת פיצול הרומן-GFP מורכב מרכיב קטן (GFP β לנטישה של 11; GFP11), קטע משלימים גדולים (GFP β סטרנד 1-10; GFP1-10)21. השברים לא לזרוח בכוחות עצמם אך לזרוח על שיוכם עצמית כאשר שני קטעים נמצאים קרוב מאוד אחד עם השני. עבור אופטימיזציה של יעילות קיפול החלבון, חזקים מתקפלים גרסאות של ה-GFP, קרי, sfGFP, sfGFPהכבושים, לאחר מכן פותחו עבור פיצול GFP מערכת20,21,22. לאחרונה, חומצה אמינית בודדת מוטציה וריאציות של sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT ו sfCFP1-10OPT- זה יכול לשקם עם פרגמנט sfGFP11 וחדר קרינה פלואורסצנטית, צהוב, ציאן, הצג בהתאמה, היו שנוצר23 . יתר על כן, sfCherry, נגזרת של mCherry, יכול להתפצל לחלקים sfCherry1-10 ו- sfCherry11 באותו אופן כמו sfGFP23.

מערכת זו כבר מותאם תווית ולעקוב אחר את effectors T3SS בתאים הלה במהלך זיהום באמצעות את effectors של סלמונלה24. עם זאת, זה היה בעבר לא אופטימיזציה עבור מערכת צמח-בקטריאלי הפתוגן המארחת. לאחרונה, אנחנו אופטימיזציה מערכת ה-GFP פיצול בהתבסס על sfGFP1-10OPT משופרת כדי לפקח לוקליזציה subcellular של T3Es העבירה של syringae פ . תאי הצמח25. כדי להקל על לימודי הסבת T3Es כדי שונים subcellular תאים בתאי הצמח, קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה צמחים נוצרו להביע sfGFP1-10OPT בתאים subcellular שונים 25. יתר על כן, פלסמידים נושא מגוון של אברון-שמיועד sfGFP1-10בשטחים הכבושים Agrobacterium-ביטוי ארעי בתיווך, הווקטורים מתויג sfGFP11 למסירה מבוססי T3SS אפקטור נוצרו גם. הזרעים של קווים שונים תודרנית הטרנסגניים של פלסמידים לבטא את T3Es של עניין ניתן לקבל ממקורות הזכיר את הטבלה של חומרים26,27.

בפרוטוקול הבא, נתאר מערכת אופטימיזציה כדי לנטר את הדינמיקה של effectors מועברים על ידי חיידקים בתאי המארח באמצעות מערכת sfGFP מפוצל. זיהום של הצמחים לבטא sfGFP1-10בשטחים הכבושים עם הטרנסגניים Pseudomonas נושאת sfGFP11 רקומביננטי פלסמיד תוצאות משלוח של אפקטור מתויג sfGFP11 של Pseudomonas לתוך התא הפונדקאי. כתוצאה מכך, חלבונים אלה הם מחדש, translocate כדי compartment(s) היעד אפקטור ספציפיים. Pv Pseudomonas syringae . עגבניות זן CUCPB5500 שבו יימחקו 18 effectors, שימש כי זן זה הראה נמוך או ללא מוות תאי s לבנה א ו- benthamiana (ש ע)28. עם זאת, כל החומרים ו השלבים המתוארים כאן ניתן להחליף או שונה כדי להתאים את המערכת sfGFP פיצול לחקירה של שאלות ביולוגיות נוספות או אופטימיזציה בתנאי המעבדה נתונה.

Protocol

הערה: כל הפעולות מבוצעות בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

1. הכנה של חומרים צמח (4 שבועות)

  1. הכנה הצמחים benthamiana ש
    1. לזרוע 2 זרעי benthamiana (ש ע) על פני אדמת כל הסיר, מכסים את המגש עם כיפה פלסטיק, ולאפשר הזרעים לנבוט ב- 25 ° C, 60% לחות הצמיחה קאמרית עם מחזור 16/8-h/כהה photoperiod.
    2. אחרי שבועיים, לבחור למחוק שתיל הקטן ביותר בכל סיר ו להמשיך לגדל צמחים בתנאים צמיחה אותו כפי שהוא מיושם עבור הנביטה בשלב 1.1.1. להוסיף 1 ליטר של מים למגש כל יומיים.
      הערה: תנאי גידול הצמחים עשויים להשתנות על פני מעבדות. לכן, לפי התקנון השקיה רגיל כדי לגדל את הצמח במצב בריא.
    3. בעוד שבוע, להעביר את הצמחים למגש חדש ולסדר אותם עם מרחב הולם לצמיחה נוספת. לשמור על גידול הצמחים בתנאים המתוארים שלב 1.1.1 עד שהם יהיו מוכנים להיות חדרו רוב בגיל 4 שבועות.
      הערה: צימוח עשויות להשתנות בהתאם התנאי צמיחה על פני מעבדות. בדרך כלל, אנו מוצאים את השבוע בת 4 benthamiana ש צמחים לשאת 6 עלים.
  2. הכנה הצמחים הטרנסגניים לבנה א
    1. עיין בטבלה של חומרים , להזמין את הזרעים תודרנית מהונדס.
    2. להשרות זרעי תודרנית הטרנסגניים ~ 50-100 מ של מים מזוקקים ואחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים בחושך כדי לסנכרן את התחלתה של נביטה.
    3. לזרוע זרעים ~ 2-3 על פני אדמת מגש צמח הכנס ולכסות את המגש עם כיפה פלסטיק. לאפשר הזרעים לנבוט ב 23 ° C, 60% לחות עם מחזור 10/14-h/כהה photoperiod.
      הערה: הזרעים צריך להיות homozygotes. עם זאת, אנו ממליצים reconfirming על הימצאות transgene באצווה. במקרה זה, לעקר את הזרעים בשטיפה עם אתנול 70% למשך 2 דקות, 50% מלבין (תת-2% על כלורי) המכילה 0.05% טריטון X-100 עבור 5 דק בעקבות כביסה 5 - 6 פעמים עם מים מזוקקים זוגי סטרילי (ddH2O). לאחר עיקור, stratify ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים, צלחת אותם במדיה נביטת הצמח המכיל 25 µg/L של hygromycin B כדי לבחור את הצמחים הטרנסגניים.
    4. לאחר שבוע, להשאיר צמח אחד בלבד לכל הכנס והמשך גידול הצמחים בתנאים הצמיחה באותו המשמש שלב 1.2.3.
      הערה: בן בשבוע-4 צמחים שימשו את הזיהום syringae פ . מים צמחים בכל יום נוספים כדי לשמור על הצמחים בריא.

2. הכנת Pseudomonas תרבות (~ 1 לשבוע)

  1. בניית פלסמיד לשינוי Pseudomonas
    1. עיין בטבלה של חומרים , להזמין את vector(s) הרצוי של וקטור מערכת משלוח25אפקטור מבוסס T3SS.
    2. הכנס את הגן אפקטור עניין הווקטור משלוח אפקטור באמצעות רקומבינציה בייעודי לאתר שיבוט25.
      הערה: בעת פיקוח על לוקליזציה subcellular של חלבון אפקטור באורך מלא, למקם את הגן באורך מלא לתוך pBK-GW-1-2 או זה פשוט-GW-1-2. זה גם אפשרי לבחור pBK-GW-1-4 או זה פשוט-GW-1-4 המכיל 2 x sfGFP11 עבור גדל פלורסצנטיות אות. במקרה של אפקטור חלקית חסר אות פפטיד, השתמש pBK-GW-2-2 או pBK-GW-2-4. עיין פארק ואח . לקבלת מידע מפורט אודות אפקטור משלוח וקטורים25.
  2. להפוך את פלסמיד נושא של אפקטור דבוקה תג sfGFP11 פ syringae pv. עגבניות (Pst) CUCPB5500 באמצעות אלקטרופורציה תקן29.
    הערה: זנים Pseudomonas אחרים ניתן להשתמש במידת הצורך. מערכת תג sfGFP11 נבנית עבור מגוון רחב של וקטורים30 , בביטוי הגן של אפקטור מוסדר על ידי האמרגן AvrRpm1, אשר הוא דומה, למשל, Pseudomonas fluorescens (איתן)31.
  3. להפיץ את התאים חיידקי טרנספורמציה בעדינות על-פני B אגר צלחות המלך המכיל 100 µg/mL ריפאמפיצין ו 25 kanamycin µg/mL או 25 gentamycin µg/mL. דגירה-28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
  4. לחסן מושבה אחת לתוך המדיה נוזלי B של המלך עם אנטיביוטיקה מתאימה הווקטור המשמש ולהגדיל את התאים בן לילה ב 28 ° C ברעידות-200 סל ד.
  5. הופכים מניה גליצרול. להוסיף גליצרול בלוק ריכוז סופי של 50% והחנות-80 מעלות צלזיוס.

3. ארעי ביטוי של אברון, ממוקדות sfGFP1-10הכבושים ב benthamiana ש (4 ימים)

  1. הכנה של תרבות Agrobacterium
    1. סדר vector(s) הרצוי של אברון, ממוקדות sfGFP1-10הכבושים plasmid(s) (עיין טבלה של חומרים).
    2. להפוך את plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 תאים32. לגדל את התאים באמצעי אגר לוריא-Bertani (LB) בתוספת 50 µg/mL kanamycin, ריפאמפיצין µg/mL 50-28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
    3. ממושבה בודדת על המדיום אגר ליברות, לחסן את התאים לתוך 5 מ של מדיה LB נוזלי בתוספת 50 kanamycin µg/mL ו- 50 ריפאמפיצין µg/mL. לצמוח התאים בן לילה ב 28 ° C ברעידות-200 סל ד.
    4. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את התקשורת supernatant, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של טרי עשוי מאגר הסתננות.
    5. למדוד את כמות Agrobacterium על ידי קבלת הערך צפיפות אופטית (OD) ספיגת של 600 nm (Abs 600 ננומטר). התאם את יתר600 של החיידקים כדי 0.5 עם חדירה מאגר.
      הערה: 1 מ"ל של השעיה זה מספיק כדי לחדור על שני מקומות.
    6. להשאיר את התרבות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עדין עבור h 1-5 לפני חדירה.
    7. דקרו לתוך המרכז של העלים ועמדו להסתנן עם טיפ µL 10. השתמש מזרק needleless 1-mL כדי לחדור את המתלים Agrobacterium . לאט ובזהירות להזריק µL כ-500 של המתלים שהוכנו מ שלב 3.1.5 לתוך הצד adaxial עלה דרך המזרק. חזור על החדירה לפחות שלושה צמחים משכפל ניסיוני.
      הערה: בשל סיבות בטיחות וגהות, הגנה העין יש ללבוש במהלך חדירה.
    8. . נגבי את המתלים חיידקי הנותרת על העלים ולסמן את הגבול של האזור הסתנן.
    9. שמור את הצמחים הסתנן תחת באותם התנאים לצמיחה המשמש שלב 1.1.1 במשך יומיים.

4. חיסון של Pseudomonas (4 ימים)

  1. פס המתח Pseudomonas טרנספורמציה מן המלאי גליצרול בשלב 2.5 במדיה של המלך B אגר עם האנטיביוטיקה המתאימה ב- 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
    הערה: הבריאות של Pseudomonas הוא מאוד קריטי. אם המושבות לא בצורת. ובכן, צובעות את התאים שוב או להפיץ את התאים בתקשורת נוזלי של המלך, לפני שתמשיך.
  2. לחסן loopful של תאים Pseudomonas מניטול-גלוטמט (מ ג) בתקשורת נוזלי ב 28 ° C ברעידות-200 סל"ד נלון.
  3. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g עבור 10 דקות יוצקים את התקשורת supernatant, resuspend בגדר ב- 10 מ מ MgCl2ולהתאים את יתר600 עד 0.02 (1 x 107 cfu/mL) עלים benthamiana ש וכדי 0.002 (1 x 106 cfu/mL) עבור תודרנית עלים.
  4. עבור benthamiana ש, לחדור את המתלים Pseudomonas האזור של העלים איפה Agrobacterium נושא sfGFP1-10OPT לבנות חדרו יומיים קודם לכן (כמו שלב 3.1.7). עבור sfGFP1-10OPT הטרנסגניים תודרנית, לחדור את המתלים Pseudomonas שני בת 4 שבוע קצר תוצרת יום עלים.
    הערה: לפחות שלושה צמחים יש צורך משכפל ניסיוני.

5. התבוננות sfGFP אות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (יום 1)

  1. לגזור את הדיסק עלה מ Pseudomonas-מחוסן עלים. בנקודות זמן מסוים לאחר חדירה של Pseudomonas, תמונת שני דיסקים עלה 2-ס מ2 מצמח יחיד באמצעות לייזר קונפוקלי מערכת עם 40 X סריקה / 1.2 נה ג-עדשה אפוכרומטית מים טבילה אובייקטיבית או 63 X / 0.8 נה ג-עדשה אפוכרומטית שמן טבילה המטרה. כדי להימנע תאים מתים נהרג מירי ופצעו, לבחון את התאים מן החור הסתננות.
  2. התחל את ההתבוננות בקביעה צריכת חשמל נמוכה 488 ננומטר ללייזר. להגביר את עוצמת הלייזר כדי לזהות sfGFP.
    הערה: בדרך כלל נשתמש 2-15% של עוצמת לייזר כדי לזהות את האות זריחה. עם זאת, עוצמת הלייזר ואת הגדרת זיהוי צריך להיות מותאם על פי המערכת מיקרוסקופיה של המשתמש. . הנה, המסננים פליטה מוגדר על 520-550 ננומטר. התאים המתים פולטים לעיתים קרובות אוטומטי-זריחה תחת עירור 488 ננומטר לייזר. לכן, כפקד שלילי, אפקטור אותו ללא תג sfGFP11 צריך להיות חדרו, שנצפו תחת השגחה באותם התנאים. בנוסף, עירור גבוהה לייזר יכול לגרום autofluorescence כלורופיל. לכן, להתאים את עוצמת לייזר באמצעות תאי צמחים הבקרה כדי לא לגרום autofluorescence כלורופיל.
    1. עבור counterstaining של דופן התא, לחדור יודיד propidium 20 מ מ (PI) הדיסק עלה ב 5-10 דקות לפני התצפית.
    2. עבור גרעין מכתים, להטביע את הדיסקים עלה לתוך paraformaldehyde 0.1% למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים. לאחר מכן, לחדור את 10 מ מ PI קסרתהל עלה ב 5-10 דקות לפני תצפית מיקרוסקופית. חזור על הניסויים לפחות שלוש פעמים.
      הערה: השלב זה לא קריטי אבל מועיל להגדרת לוקליזציה אפקטור קרום פלזמה או לגרעין. אם effectors עניין הראה לוקליזציה שלהם אברון ספציפי, השתמש סמן אברון נתון כדי לאשר הלוקליזציה של אפקטור.

תוצאות

המבנה β-חבית של GFP מורכב של קווצות β 11 ואת ניתן לחלק שני קטעים, 1-10בתאנון סטראנד (GFP1-10OPT) ומלון סטראנדth (GFP11) 11. למרות של פלורסנט בכוחות עצמם שני קטעים, sfGFP עצמית שהורכב שמתרגל את זריחה כאשר קיימים שני קטעים בסמיכות (איור 1 א'). במערכת זו, sfGFP1-10O...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן משמש לניטור לוקליזציה מדויק של החלבונים אפקטור מוזרק על ידי רופא חיידקי T3SS לתוך התא הפונדקאי צמח על זיהום. בעבר, מערכת ה-GFP פיצול שימש ככלי ללמוד את subcellular לוקליזציה של יונקים חלבונים23,36, סלמונלה T3E לוקליזציה ומסירת Agrobacterium VirE2 ד...

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר מדע בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, ICT תכנון עתידי (ה-NRF-2018R1A2A1A05019892) הבירה ועל ידי מענק של מרכז רבייה מולקולרית של צמחים ( PMBC) של התוכנית 21 Biogreen ' הדור הבא ' של המינהל לפיתוח כפרי (PJ013201) כדי EP. אנו מודים למרכז הדמיה של המרכז הלאומי מכשור לניהול סביבתי לספק מיקרוסקופ קונפוקלי לצלם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Arabidopsis transgenic linesPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10ABRCCS69831
NU-sfGFP1-10ABRCCS69832
PT-sfGFP1-10ABRCCS69833
MT-sfGFP1-10ABRCCS69834
PX-sfGFP1-10ABRCCS69835
ER-sfGFP1-10ABRCCS69836
GO-sfGFP1-10ABRCCS69837
PM-sfGFP1-10ABRCCS69838
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmidPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10Addgene97387
NU-sfGFP1-10Addgene97388
PT-sfGFP1-10Addgene97389
MT-sfGFP1-10Addgene97390
PX-sfGFP1-10Addgene97391
ER-sfGFP1-10Addgene97392
GO-sfGFP1-10Addgene97393
PM-sfGFP1-10Addgene97394
ER-sfCherry1-10Addgene97403
ER-sfYFP1-10Addgene97404
CYTO-sfCFP1-10Addgene97405
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery systemPark, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2Addgene98250pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-1-4Addgene98251pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-2Addgene98252pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBK-GW-2-4Addgene98253pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-2Addgene98254pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-1-4Addgene98255pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-2Addgene98256pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
pBG-GW-2-4Addgene98257pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)
Bacterial strains
Agrobacterium tumefaciens GV3101Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)
Media components
Plant germination mediaAdd 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.
Murashige & Skoog medium including vitaminsDuchefa BiochemieM0222Store at 4 °C.
SucroseDuchefa BiochemieS0809
PhytagelSigma-AldrichP8169
LB mediaAdd 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.  Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed.
TryptoneBD Bioscience211705
Yeast extractBD Bioscience212750
NaClDuchefa BiochemieS0520
Micro agarDuchefa BiochemieM1002
King's B media10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed.
Proteose peptoneBD Bioscience212120
Anhydrous K2HPO4Sigma-Aldrich1551128 USP
GlycerolDuchefa BiochemieG1345
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Bacto AgarBD Bioscience214010
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7
MannitolDuchefa BiochemieM0803
L-glutamic acidDuchefa BiochemieG0707
KH2PO4Sigma-AldrichNIST200B
Infiltration buffer10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.
MESDuchefa BiochemieM1503Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.
MgCl2Sigma-AldrichM8266Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406Prepare 150 mM stock in DMSO.
Confocal microscope equipments/materials
710 laser scanning confocal systemCarl Zeiss
Axio observer Z1 inverted microscopeCarl Zeiss
Propidium iodideThermoFisherP1304MP

References

  1. Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
  2. Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
  3. Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
  4. Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
  6. Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
  7. Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
  8. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
  9. Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
  10. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  11. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
  12. Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
  13. Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
  14. Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
  15. Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
  16. Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
  17. Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
  18. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
  19. Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, &. #. 1. 9. 3. ;. Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
  20. Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
  21. Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
  22. Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
  23. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
  24. Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
  25. Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
  26. . Addgene Available from: https://www.addgene.org (2018)
  27. . Arabidopsis Biological Resource Center Available from: https://abrc.osu.edu (2018)
  28. Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
  29. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  30. Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  31. Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
  33. Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
  34. Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
  35. Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
  36. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
  37. Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
  38. Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135IIIPseudomonassuperfoldersubcellular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved