发表
联系我们

登录

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

藤壶Balanus (Amphibalanus) improvisus是研究渗透调节和防污的典范。然而, 自然季节性产卵产生不可预知的 cyprid 幼虫供应。本文介绍了improvisus的全年培养方案, 包括幼虫的生产。阐述了培养的藤壶在基因表达研究中的应用。

摘要

藤壶是海洋甲壳类与无梗的成人和自由游泳, 浮游幼虫。藤壶Balanus (Amphibalanus) improvisus特别相关, 作为研究 osmoregulatory 机制的模型, 因为它对低盐度的极端耐受性。它也被广泛地用作沉降生物学的模型, 特别是在防污研究方面。然而, 自然季节性产卵产生不可预测的 cyprid 幼虫供研究。制定了一项全年培养improvisus的议定书, 概述了生产线上所有步骤的详细情况 (即, 在小组中建立成人文化, 收集和饲养藤壶幼虫, 并管理成人和幼虫饲料)。该描述还提供了关于故障排除和讨论关键参数的指导 (例如, 清除污染、生产高质量饲料、需要人力以及高质量海水的重要性)。每批从养殖系统最大产量约1.2万幼体, 可以提供四批在一周内, 所以多达5万幼虫每周可以生产。用于养殖B. improvisus的方法在很大程度上也适用于其他具有自由 swimminglarvae 的海洋无脊椎动物。本文介绍了各种组织的解剖方法, 并提出了高质量的 RNA 用于基因表达的研究。还描述了如何在广泛的实验设计中使用培养成人和饲养 cyprids, 以检查基因表达与外部因素的关系。利用培养的藤壶在基因表达中的应用研究了可能 osmoregulatory 作用的钠+/钾 atp 酶和水通道蛋白。

引言

藤壶是海洋甲壳类与无梗的成人和自由游泳, 浮游幼虫。1200种藤壶中的大多数栖息在浅水中, 许多人经常接触到低盐度。一个物种, 海湾藤壶Balanus (Amphibalanus) 即兴创作(B. improvisus), 可以容忍几乎淡水和查尔斯达尔文描述这个物种从一条小河在1乌拉圭的里约热内卢河口。极端容忍 tolow 盐度使B. improvisus一个特别相关的模型为 osmoregulatory 机制的研究2,3。这种藤壶喜欢咸水条件, 但能够生活在矿化度的水域, 从大约1.6 个电源到高达 404。它是在淡咸的波罗的海中唯一发现的藤壶物种。improvisus被认为起源于美国大陆的东海岸, 但今天在全世界被发现由于运输5。它是一个主要的污垢有机体, 通常在岩石、码头和船体上发现, 因此, 了解生物污垢在海洋和微咸水中的构造机制6,7是普遍的兴趣。

与大多数其他藤壶相似, B. improvisus是两性与交叉受精;繁殖发生通过交配的相邻个体使用拉长的小弟弟和内部受精。生育期主要从9月。B. improvisus有七个中上层幼虫阶段 (六幼体其次是一个 cyprid 阶段8)。受精卵孵化成一个无节幼体幼虫, 这是自由游泳和饲料在水柱长达数周前, 蜕皮成一个非喂养的 cyprid 幼虫。cyprid 使用多个线索找到一个合适的地点定居, 然后经历蜕变成一个无梗的少年藤壶9。该物种可以在实验室中培养, 在海洋中具有多年的寿命 (在实验室培养中2–3年)。平均来说, B. improvisus长到10毫米直径 (最大约20毫米), 达到最大高度约6毫米 (虽然它可以在拥挤的条件下长得更高)。该物种可以由其平滑的钙质均匀壳 (白色或灰), 壳板的径向图案的钙质基, 和背部板的形状1,10。

藤壶B. improvisus有几个优势特征作为研究渗透调节的模型, 重点是分子和生理机制, 以及生态相互作用和进化后果。它也被广泛使用作为一个模型为解决生物的调查, 特别是关于防污研究和机制涉及7,11,12,13。然而, 自然季节性产卵产生不可预测的 cyprid 幼虫供研究。因此, 通过全年的整个生命周期培养这种藤壶的能力, 是实现各种分子和机械研究的主要资产。此外, 它在世界范围内的海洋/微咸水域中的存在, 使得野外和实验研究结合在一起。受控育种还可以为长期培养14的已知血统的家庭生产, 而在几个月的世代时间可能允许长期的实验性进化。还有一个基因组和几个 transcriptomes 可用, 这些资源被用于克隆几个基因 (例如, 渗透调节中的重要基因)2,3。

本议定书的目的是描述如何建立和保持一个文化的藤壶improvisus全年, 以执行基因表达研究的成年人或幼虫的这个有机体。Rittschof等。15简要描述了一种培养藤壶的方法, 从幼体的释放到 cyprids 的Balanus 安菲特律特的沉降。该议定书已适应了在 Tjärnö海洋研究实验室 (瑞典) 全年培养B. improvisus , 并详细描述了生产线的所有步骤, 包括藤壶的生产和饲养幼虫, 以及对成人和幼虫饲料的管理。有关完整过程的概述, 请参见图 1。使用该培养系统的例子是一些常见的实验设置, 并说明在功能基因组学研究的钠+/K+ atp 酶和水通道蛋白, 阐明其可能的功能在渗透调节2, 3。有时有必要检查特定组织中的基因表达, 并将覆盖藤壶解剖的一些基本知识。由于优质海水供应良好, 在世界各地的海洋实验室中, 藤壶B. improvisus和潜在的许多其他物种的培养应该是可能的。

研究方案

1. 在田间收集成人藤壶, 开始新的亲鱼

  1. 部署热塑性塑料 (甲基丙烯酸甲酯) 透明板 (110 x 110 x 1.5 毫米3) 在≈ 1–3 m 深度在平静的水域, 以便收集成人藤壶从领域。使用可以采用多个面板 (图 2A) 的帧, 在每个面板和 attachthepanelstotherackusingcableties 的顶部钻取2个孔 (直径为6毫米)。因此, thepanelswillhangverticallyin 水。
    1. 当藤壶的沉降 (在面板上被确定为小的白色硬点) 时, 请将面板至少2–3周, 以确保藤壶足够大 (5 毫米), 以便在不被烘干或损坏的情况下转移到实验室。
  2. 将这些面板带入实验室, 当它们被固定在improvisus 的 B. 5毫米 indiameter。
    注意: 成人在田间发展到5毫米的时间高度依赖于食物的供应和温度。通常, 这需要大约3星期在 Tjärnö海洋研究实验室 (58.87 °N, 11.14 °E)。最常见的是, 新的亲鱼面板通常部署在后期琼和收集在8月底。
  3. 在将这些面板引入文化设施之前, 请从面板中清除其他有机体。去除其他藤壶物种是最重要的。请注意, 重要的是要经常清洁的面板, 以摆脱污染的物种在耕种期间, 因为这将大大增加生存的机会, 亲鱼。
  4. 将面板垂直放置在与研磨槽在聚乙烯托盘 (400 x 400 x 20 毫米3) 的立场上的边缘 (图 2C和2E)。支架上的凹槽为15毫米。
  5. 为了准备托盘, 在基座上做一个入口端口, 并在每个托盘的另一侧的顶部出口端口。将每个托盘的入口端口连接到包含约30升水的100升储层, 其入口为20摄氏度, 允许流经ca的速率。每分钟2升。
    注: 多达8个托盘连接到一个单一的 100 L 水库。
  6. 将 100 L 储层连接到温度控制的海水 (20 摄氏度) (例如,由热泵提供的来自传入海水的热量)。
    注: 藤壶B. improvisus可以生长和繁殖在一个完整的海洋盐度 (30–35);但是, 将盐度降低到ca。25通过将淡水添加到 100 L 水库, 增加了养殖幼虫的产量。

2. 从培养的 Cyprids 开始新世代成人

  1. 通过用无毒防水胶带将5个面板组合在一起, 在顶部打开热塑板的立方体。
  2. 把立方体放在一个小盘子里 (以防漏水), 然后用海水填满 (25)。保持室温下的水温 (约20 摄氏度)。在立方体顶部添加大约 200 cyprids。
  3. 每隔一天喂幼鱼100毫升中肋骨条 marinoi (见步骤 5), 而在立方体。
    注意: 幼藤可能有困难与摄取卤虫藻(见步骤 3), 因为它们是大的, 因此, 难以吞咽新定居的藤壶。
  4. 把水改成一周1x。
  5. 2周后, 当面板包含足够的已建立的幼鱼直径至少5毫米, 采取立方体分开, 并移动面板与青少年的托盘与流动 throughseawater, 然后, 饲料的藤壶与一个. 藻幼体。

3.卤虫藻幼体作为成人藤壶饲料的培养

  1. 通过使用一个1.5 升塑料瓶, bottomis 切断, 瓶子放在一个立场上颠倒, 并从侧面照亮, 建立一个养殖系统.将瓶颈固定在带有夹具的硅管上, 并将其连接到曝气泵 (图 2D)。
  2. 为了孵化鸡蛋, 增加约15毫升的干休眠卵的卤虫到1升 ofseawater。
    注:卤虫卵孵化成无节幼体幼虫后 24–48 h。为了延迟孵化的幼体 (例如, 在周末), 光线可以关闭, 以减少温度轻微。
  3. 要收割卤虫幼体, 关闭曝气, 用铝箔 (或类似的罐头) 使瓶子上部变暗。照亮瓶的下部10分钟孵化的卤虫幼体将游向光。非孵化囊肿将下沉到底部, 囊肿壳将漂浮在表面。
  4. 打开底部的夹子。收集中间分数作为一个密集的人口的游泳幼体。
    注: 每天 (除周末外), 1 l 的密集卤虫幼体悬浮被手动添加到 100 L 水库连接到托盘与成人藤壶。避免任何与空囊壳喂养, 因为他们不提供营养, 主要导致需要更频繁地清洁文化。

4. 藤壶幼虫的收集和饲养

  1. 用一只柔软的牙刷, 用淡水轻轻喷洒, 并在必要的时候清除藤壶外壳和面板上的污垢, 用成人藤壶清洁面板。此外, 清洁托盘 (没有藤壶) 和管在热 (75 °c) 淡水。
  2. 将一个90µm 浮游生物网的筛子粘在一根切割 PVC 管 (直径16厘米, 高度15厘米) 的一端, 放入一个带有溢出端口的聚乙烯托盘 (30 x 20 x 10 厘米3)。在筛improvisus幼虫在一夜之间收集 (图 2C)。
    注: 筛网位于藤壶板托盘的出口口下方, 接收出水水并过滤掉幼体。当海水溢出小托盘时, 幼虫留在筛子里。这个小托盘确保筛子永远不会 driedout。
  3. 将30升桶放在一个大的水浴中, 温度保持在26摄氏度, 使用鱼缸式鱼缸加热器 (图 2E)。通风和搅拌通过系统空气冒泡保证。
  4. 用20升过滤海水 (0.2 µm; 25) 填充桶。添加1升到60/40 混合的2硅藻微藻, S. marinoi和薄的桶 (见步骤 5)。这将给出一个初始密度约 5 x 104硅藻每毫升在桶。
    注: 藤壶幼体幼虫正趋光。桶是由不透明的白色塑料制成的盖子, 让通过一些光。在冬天, 房间被照亮白天 (8:00–17:00), 但夜间黑暗。在夏天, 外面的光线在白天的大部分时间进入了房间。
  5. 将所收集的improvisus幼体转移到结晶皿 (300 毫升; 直径90毫米; 高度50毫米)。
  6. 从侧面照亮盘子, 这将吸引幼虫到光源。收集的藤壶幼体, 收集在传入的光与吸管, 并转移到另一个结晶皿。除去剩余的卤虫幼虫。
  7. 将B. improvisus幼体幼虫转移到一个烧杯中, 过滤海水的1升。
  8. 通过搅拌烧杯轻轻地幼体的数量, 以获得一个甚至悬浮幼虫, 然后从烧杯不同的地方采取五1毫升样品。将每个样品转移到一个微板块中, 以显微镜进行目视检查。计算每五个样本中的幼体数并将它们加起来。
  9. 将计数数乘以 200 (1000 mL/5 毫升), 估计在整个烧杯中有多少个幼虫。如果烧杯中有太多的无节幼体幼虫, 稀释样品直至密度最多为1.4万幼虫/l (通常在11,000–12,000 幼虫/l 的范围内)。
  10. 添加1升improvisus幼体到一桶, 从而增加大约每桶11,000–12,000 幼虫。
    注意: 确保不要添加更多的幼体, 因为这会导致食物过少, 从而增加死亡率。
  11. 3天后, 收集藤壶幼体90µm 筛。然后清洁桶 (与75°c 淡水), 填补它与过滤海水, 添加新的硅藻饲料 (与开始时相同的数量), 最后添加幼体。Cyprids 6 天后开始出现 (1 天)。
  12. 首先收集 cyprids 90 µm 筛 (如上文4.2 所设计)。然后将非蜕皮藤壶幼体和 cyprids 与一个320µm 筛在160µm 筛顶部分开。B. improvisus幼体将收集在320µm 筛和 cyprids 在160µm 筛。
    注: cyprid 幼虫可以储存在10摄氏度在一个结晶皿在黑暗中, 以供以后使用, 由ca。6天。然而, 贮藏会影响藤壶幼虫的质量和性能, 因此比较不同治疗方法的实验最好是使用相同批次 (和类似贮存时间) 的幼虫, 以避免混淆效果16。

5. 微藻作为藤壶无节幼体幼虫饲料的培养

注: 藻类生长在3种不同类型的文化中: (i) 种群文化, 是长期维持的菌株, 被用于接种的扩大;(二) 开办文化, 这是扩大规模的第一步;最后 (iii) 生产文化, 这是作为藤壶饲料的大量藻类的最终生产规模。

  1. 从藻类和原生动物 (CCAP) 的文化收集中订购硅藻种, 用作藤壶无节幼体幼虫的饲料。2种中肋骨条 marinoi (CCAP 菌株 1077/5) 和毛藻单纯形var ( CCAP 菌株 1085/3) 均为饲料提供了良好的效果。
  2. 过滤所有海水用于藻类养殖, 使用一个直径为0.2 µm 的墨盒过滤系统. (过滤过的海水也用于孵化一个. 藻卵, 培养藤壶无节幼体幼虫.)对海藻培养的过滤海水进行蒸压 (摄氏105摄氏度, 5 分钟)。
  3. 用含无机营养素、微量金属和维生素的 Guillard f/2 溶液丰富的蒸压海水制备微藻培养培养基 (见 Guillard 197517 )。另外, 准备一个溶液硅酸盐 (Na23), 但保持这与 f/2 浓缩分离, 以防止固体沉淀。
    注: 浓缩液和硅酸盐溶液的浓度可作为每1升海水的1毫升添加。
  4. 高压釜用的所有设备在海藻养殖中使用120°c 20 分钟, 蒸压螺钉上限试验管, 1 毫升的 f/2 浓缩和1毫升硅酸盐溶液。当蒸压玻璃器皿和液体冷却到室温时, 加入富集和硅酸盐溶液 theseawater。
  5. 在40毫升的螺帽试管中培养微藻。
    1. 用大约30毫升丰富的海水填充试管。使用1毫升的2周旧的股票文化, 用一种不育的巴斯德吸管接种培养基。螺丝帽, 然后安装, 但不收紧, 以允许一些气体交换。如果可用, 接种应在层流柜内进行, 以减少污染的风险。
      注: 股票文化的目的是保持藻类文化的长期基础上, 并作为接种的开始文化。每2周再接种一次股票文化。
    2. 将新的股票文化暴露在一盏带有钙强度的白光上。25–50µmole m-2s-1 (以一个浅黑暗的周期 16:8 h)。将旧的股票文化以低光强度作为备份。丢弃任何2周的旧股票文化。
  6. 为扩大到藻类的生产文化, 接种的起始文化从股票文化和增长他们在500毫升 Erlenmeyerflasks。
    1. 高压釜4锥形烧瓶, 吸管和棉花塞子, 300 毫升过滤 (0.2 µm) 海水, 4 试管与0.3 毫升 f/2 浓缩和4与硅酸盐溶液。冷却 f/2 浓缩和硅酸盐到室温, 并加入锥形瓶的解决方案。用ca给他们接种疫苗。1毫升的2周的老股票文化。
      注: 用marinoi和2制备2瓶, 用单纯形。
    2. 把烧瓶放在震动台上, 光线强度为50µmole m-2s-1。当开始的文化已经获得密集的藻类种群 (黄色棕色的颜色), 他们准备作为接种的生产文化, 将提供藤壶幼虫的食物。
  7. 在4升聚碳酸酯瓶中种植生产文化, 硅胶塞子与2个钻孔端口安装玻璃管。
    1. 通过装有0.2 µm 空气滤清器的硅胶管将1玻璃管接触到瓶子的底部, 使之成为空气泵。确保第二个玻璃管结束刚好低于硅胶塞子, 并填充棉花, 以允许出口的空气。
    2. 每周, 用过滤过的海水填充四4升瓶, 并与塞子一起蒸压。此外, 高压釜4试管与4毫升的 f/2 浓缩和硅酸盐溶液。
    3. 冷却后, 加入 f/2 浓缩和硅酸盐溶液的瓶子, 然后接种他们的一半的数量的启动文化在锥形烧瓶。
    4. 将四4升瓶放在50–100µmole m-2s-1的光强上。
    5. 在ca之后收获生产文化。1周;然后, 它们足够密集, 用于喂养藤壶无节幼体幼虫。
      注: 生产文化的寿命约为2周, 这意味着在任何时候都有8个活跃的生产瓶。

6. 使用藤壶设计实验研究

  1. 将面板与青少年或成人藤壶在控制水族馆, 在那里他们可以种植在 identicalconditions。这称为共同花园实验, 例如, 可以用来了解局部 adaptions 或表型可塑性18, 或研究基因表达的变化与外部因素 (例如, 盐度, 温度, 或 pH 值)。
    注意: 也可以使用直接从现场收集的面板上的藤壶。使用实验室培养的个体的好处是, 在使用下一代后代时, 可以避免产妇的影响。
    1. 将藤壶暴露在 chosentime 间隔内的特定环境条件下, 接着是成年人的收割 (例如基因表达的研究)2。
  2. cyprid 幼虫实验研究基因表达3, 将 cyprids 放在受控水族馆中, 在同一条件下可以培养幼虫。
    1. 用筛子过滤 (如步骤4.7 中所述), 在指定的时间段后收割 cyprids, 并根据下面的协议提取 RNA (步骤 8)。

7. 藤壶解剖

  1. 清洁实验室空间, 在那里进行解剖和 DNA 取样, bothbefore 和个人之间, 包括所有解剖工具。这是使用氯的长凳 (或96% 乙醇的镊子)。
    注: 预先制备含有固定介质的标记管 (乙醇或 RNA 稳定液)。
  2. 选择大而短期饥饿的个体 (在解剖前2天不要喂养它们)。用牙刷清洁藤壶壳, 以减少其他物种 (如细菌、藻类) 的污染风险, 并用水冲洗。
    注意: 在解剖之前, 个人短期饥饿的原因是为了避免任何 DNA 污染 (例如, 从肠道中的卤虫囊肿)。
  3. 将单独的藤壶放在均匀的表面上, 或者附着在面板上或放在盘子里。从成人身上解剖各自的组织。根据研究的目的, 有几种解剖藤壶的方法。
    1. 解剖方法 A: 尽快修复整个藤壶。
      1. 使用手术刀将整个藤壶从面板中取出, 将其插入藤壶下并靠近面板表面。
        注意: 在大多数情况下, 这种操作使基底板几乎完好无损, 从而不影响藤壶内。
      2. 小心地通过插入钳在一侧打开外壳 (图 3)。这样做是为了便于侵入外壳内的一个正向介质。
        注: 如果在将藤壶放置在试管中之前, 壳体未被折断, 则可能导致固定过程较慢, DNA 的质量下降。
      3. 把破碎的藤壶放在含有 RNA 储存液或乙醇的试管中。留在溶液中的藤壶至少24小时的固定。当藤壶是固定的, 动物可以取出的固定介质, 并放置在解剖托盘。cirri, 地幔和体细胞 (身体) 可以分开, 并放置在单独的管进一步提取 DNA 或 RNA。
        注意: 有必要观察是否有受精卵的卵片存在于藤壶内。如果存在, 这些应该被删除之前进行 DNA 提取, 以避免发现多个基因型的样本。
    2. 解剖方法 B: 在固定前将藤壶从外壳中除去。
      注意: 这种方法可能并不总是导致地幔被取样, 因为它是附加到 calcareousshell 的内部。但它可以是一个快速的方法来取样 DNA 的个人。
      1. 通过使用解剖钳, 背部和 scutal 板 (图 3), 通过插入背部和 scutal 板之间的钳尖端, 抓住一个盘子, 并轻轻拉动, 以消除它们。
      2. 抓住 cirri 与钳和拉藤壶直接出来, 并把它直接放在96% 乙醇或 RNA 稳定溶液固定。
        注意: 有时, 地幔也会同时被取样, 就像一个薄的上皮与深色色素沉着 (在improvisus)。否则, 地幔可以用手术刀从外壳内部移除, 然后放置在乙醇或 RNA 稳定溶液中。
        注: 背部和 scutal 板 (如果完好无损) 可以干燥和保存, 因为它们是有用的物种的识别10。如果对物种有任何怀疑, 一般的建议是在初始化解剖之前也拍摄整个藤壶。

8. RNA 提取用于定量 PCR

  1. 把成人用于 rna 提取到一个 rna 稳定的解决方案, 孵化他们过夜 (高达24小时) 在4摄氏度, 然后储存在-80 摄氏度。
    注: Cyprid 幼虫优先干冷冻, 没有 RNA 以后直接地在-80 °c, 通过安置他们在 cryotubes 然后简要地淹没管子 (三十年代) 在液氮之前存放他们在-80 °c。
  2. 在 RNA 提取的时候, 解冻在冰上的藤壶和使用它们完整或解剖出要使用的组织 (见步骤 7)。
    注: 由于个体间的遗传多样性 (≈3–5% 在编码区域的变化;Alm Rosenblad 等, 未发表的数据) poola 成人的数量是可取的, 这将在以后的 qPCR 步骤中最大限度地减少个体间序列变异的影响。
  3. 对于 RNAextraction, 添加350µL 的裂解缓冲液, 提供一个 RNA 制备试剂盒到均匀管, 其中含有2.8 毫米的陶瓷珠。
    注: 与超声波相比, 陶瓷珠提供了更好的 RNA 产量 (代表性结果)。
  4. 采取一个成年藤壶 (整个或组织) 或收集至少 20 cyprid 幼虫使用镊子, 并把它们放入均匀管。
  5. 与珠磨直接进行破坏和均匀化。
  6. 将均匀管与样品和珠子放在珠磨机架上。在二十年代以4.0 米/秒的频率摇动它们. 在冰上冷却样品1分钟。重复2x。
  7. 根据商业上可用的 rna 隔离套件的协议准备 rna。
    注: 应在使用 RNA 提取方法之前进行风险评估 (包括阅读安全数据表), 以确定需要使用油烟机和其他防护衣物 (包括手套) 的危险化学品 (例如,在 RNA 提取过程中加入β-巯基乙醇到裂解缓冲液中, 应在通风罩中进行。
  8. 量化 RNA。准备一个工作解决方案, 并添加一个标准和样品, 以200µL 的总容积. 漩涡他们为 2–3 s 和孵化他们2分钟. 将管子插入荧光计并进行读数。
  9. 检查 rna 样品的任何蛋白质污染与分光光度计, 并检查他们的 rna 完整性与自动电泳系统 (代表性的结果)。
    注: 为良好的质量准备, 建议 RNA 的比例为260/280 纳米2–2.2 和 DNA 约1.8。低值表明蛋白质污染, 提取过程必须优化。

9. 基因表达: cDNA 合成和 qPCR

  1. 治疗获得的 RNAwith DNase, 以消除任何 remainingDNA 之前, 为 qPCR 的 cDNA。
    1. 在制备 cDNA 时, 通过添加 RNA 样本, 而不是逆转录酶来检查是否污染了基因组 DNA。如果在没有逆转录酶的 cDNA 上对所选基因进行 PCR 扩增, RNA 中就存在 DNA 污染。
      注: 对于用于 rna 序列的样品 (使用下一代测序技术进行 rna 排序), DNase 步骤不那么重要。特别是对于 rna 含量较低的样品, DNase 步骤可能会被省略, 以免在过程中失去太多的 rna。
  2. 使用在商业 cDNA 合成试剂盒中指定的范围内的 rna, 在 DNase 处理的 rna 上进行 cDNA 合成, 但通常使用至少 50 ng。
  3. 设计 qPCR 底漆, 使它们退火到感兴趣的基因的部分, 其中个体之间的序列标识尽可能高, 但基因 paralogs 之间的序列标识尽可能低。请参见相应的出版物为特定底漆对用于基因表达研究的 Na+/K+ atp 酶3和水通道蛋白2 (图 5)。
    注意: 为此, 可以使用数以百计的 cyprids 或几个成年人的 RNA 序列数据。
  4. 设计用于表达水平正常化的基因的引物 (如肌动蛋白)。成功用于肌动蛋白的引物是, 向前: 5 '-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3 ', 和反向: 5 '-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 '。
    注: 肌动蛋白是一种常用的控制基因。然而, 其他一些也被建议作为参考和测试的藤壶19。除了肌动蛋白, 使用 RPL8, 36B4, EF1 和 NADHd1 作为参考已经测试了3。结果表明, 体细胞、cirri、成人或 cyprids 在各自参考基因的表达水平上没有大的差异。
  5. 通过将增加的 cDNA (通常在0.25–50的范围内) 添加到含有 SYBR 绿色、dNTP、聚合酶和0.3 µM 每一个正向和反向底漆的混合物中, 优化设计底漆的退火温度。
  6. 在不同退火温度下运行 qPCR 协议:95 °c 的初始变性温度为3分钟, 变性步骤为二十年代95摄氏度, 二十年代55–63°c 的退火温度, 三十年代的伸长率为72摄氏度。总共运行40个 PCR 周期。
    注: 底漆效率应位于90–105% 的范围内, 并计算为 E = (10 ^ (-1/斜率)-1) x 100, 其中斜率是根据其周期阈值 (Ct) 绘制 cDNA 浓度的对数值时获得的曲线斜率。
  7. 使用适当数量的 cDNA (通常是 1–10) 执行 qPCR, 采用步骤3中描述的 PCR 协议, 并找到最佳退火温度。
    注: 较高数量的 cDNA 只用于在极低的数量表达的基因。

结果

通过对improvisus成人藤壶培养过程的描述, 每周可生产多达四批无节幼体幼虫。几乎每晚都可以收集无节幼体幼虫, 但这需要更多的人和基础设施 (在亲鱼中有许多藤壶, 一种文化会不断地释放幼虫)。幼虫生产的另外一个限制因素似乎是优质饲料的供应, 特别是关于硅藻中肋骨条。最大地, 每批从养殖系统包括大约1.2万幼体, 因此5万幼体每周可以养殖。然而, 在几个星期内, 可能会有更多的幼虫产生。一个成年人每天可以生产多达7000只幼虫14, 这意味着, 在每个批次中, 大人们都会释放幼虫。在一周内, 约70–90% 的收集幼体将发展成 cyprids (每星期产生大约 3万 cyprids, 最大), 可用于解决的化验和分子研究。

应该强调的是, 批次之间的 cyprid 特性有变化, 一般来说, 批次之间的差异比批处理中的大 。例如, 在沉降检测中沉降的成功率在30和70% 之间因不同批次而异。最有可能的是, 这是由特定对的成年人在不同的取样期内释放幼虫的个体遗传变异引起的。当然, 建议重复的实验 (生物复制) 应该包括一些批次的 cyprids, 如果要对结果作更多的一般性陈述的话。批量变异对实验设计提出了要求, 应在基因表达研究中应用适当的控制和标准化。然而, 即使实施了若干统计规范化程序, 大大减少了批处理之间的差异, 批处理的某些影响通常仍然很明显 (未发布的数据)。

根据提供的协议, 平均来说, 可以获得500的高质量 RNA 从多达 20 cyprids, 无论藤壶解决阶段 (表 1)。RNA 的质量通常被测量作为18S 和28S 峰顶的比率 (二个峰值的期望的位置在图 4被表明)。然而, 在藤壶和许多其他节肢动物的情况下, 28S rRNA 在加热时分解 (作为分析方法的一部分), 并与18S 峰值20一起迁移。这就是为什么在这种类型的藤壶分析中, 原则上有一个单一的 rRNA 峰。从这个测试 (图 4) 可以清楚地看出, 陶瓷珠子的均匀化为 RNA 提供了最高的完整性, 因此是选择的方法。RNA 在数量和质量上是足够的, 可以生成高质量的顺序库来进行排序, 从而平均每个样本读取7000万个 (当然, 读取的次数取决于排序过程中的多路复用程度)。RNA 的数量也足以用于基因的 cDNA 合成和 qPCR 表达分析。

图 5显示了水通道蛋白的 qPCR 分析和 Na+/K+ atp 酶 (NAK1) 拼接变体的结果, 其中的表达变化是针对环境线索2,3的变化进行调查的。对 NAK1 长、短拼接变形的相对表达式的比较表明, 低盐度的长 NAK1 mRNA 与短 NAK 的关系有双重增加 (图 5a)。因此, 数据表明, 在低盐度条件下, 交替拼接可使长形占优势。在水通道蛋白的情况下, 明显的两个输水 paralogs AQP1 和 AQP2 显示差分表达式 (图 5B)。特别是, 在地幔组织中, 明显的是, AQP1 在较低的矿化度, 这是没有看到 AQP2。相反, AQP2 显示在较低的矿化度, 但在躯体中的表达略有增加。这些发现为研究不同improvisus离子转运体和水通道蛋白在藤壶渗透调节中的功能作用提供了基础。

figure-results-2016
图 1: 对成人基因表达研究的全培养过程和 RNA 提取进行综述.为了启动一种新的文化, 面板连接到一个框架, 并部署在海 1-3 m 深度。几个星期后, 与成人/青少年的面板被垂直放置在托盘在实验室的架子上。每个托盘有大约40个面板与成人。每个面板大约有100个成年人, 总≈4000成人个体被培养每托盘。成年藤壶用卤虫喂养, 可以常年保存。无节幼体幼虫每周收集几次从托盘通过过滤通过筛子。收集的幼体被转移到桶保持在26°c 在水浴和哺养与微藻。幼体被饲养, 直到他们蜕皮成非喂养 cyprids, 这是收集的过滤。新的面板可以建立在实验室中, 解决 cyprids 在面板上, 要么提供新的面板, 为全年文化或用于特定的实验设置与改变的外部条件。然后在实验结束或特定的时间点从青少年/成人中提取 RNA。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-2689
图 2: 培养过程中一些重要步骤的图像.(A) 该图像显示了从该领域收集新人口的面板框架。(b) 这张图显示了improvisus的成人藤壶, 放在托盘中的架子上。面板被放置在大约 2 cm 分开。(C) 该图像显示了托盘与藤壶面板和喂养池的左侧。从每个托盘, 有一个出口, 其中的筛子放置在收集无节幼体幼虫。(D) 该图像显示了为成人藤壶生产卤虫饲料。(E) 这张图显示了幼体在水浴中放置的桶中的饲养, 设置为26摄氏度。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-3305
图 3: 描述成人藤壶的初步解剖步骤: 从壳体中取出身体.(A) 通过光圈轻轻插入镊子, 抓住其中一个鳃盖板。轻轻拉取出盘子, 露出动物。(B) 抓住 cirri 下方的躯体部分, 拔出动物。(C) 这个小组显示橡子藤壶的整体解剖。当身体被拉出时, 地幔和可能受精的卵 (在卵巢中) 停留在壳腔内。关于藤壶解剖学的说明 (对于一个更深入的帐户, 见安德森)9: 藤壶的墙板向内倾斜, 并在一起, 形成一个火山状锥。开口, 光圈, 由两个鳃盖板覆盖, 形成一个门, 或笼盖, 以关闭光圈。橡子藤壶一般有一个石灰基板, 牢固地粘附在底层;然而, 有些藤壶缺乏这种钙质板块 (例如, balanoides)。藤壶从深色的地幔 (甲壳) 中分泌外骨骼。双层地幔的外表面钙化成刚性, 而地幔的内表面不钙化, 因此具有弹性。在光圈内, cirri 存在于缩回位置。这些是胸附件, 藤壶用于悬浮喂养。卵巢靠近藤壶的底部, 而睾丸位于躯体中。这一数字已被帕诺娃等所采用。21 , 并已发表的许可, 从 Springer。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-4184
图 4: 毛细管凝胶电泳法测定 rRNA 的完整性.RNA 是由两种不同的均匀化方法制备的: (A) 超声波和 (B) 陶瓷珠。y 轴上的单位, 傅, 代表荧光单位。请单击此处查看此图的较大版本.

figure-results-4602
图 5: 基因表达的结果来自两个不同的基因研究对渗透调节在 improvisus 的重要. (A) 本小组显示的差异表达式, 由 qPCR 的剪接变种的钠+/钾+ atp 酶NAK1 , 以回应各种矿化度和2级3。在低盐度处理中, 长异构体 (NAK1-L) 的表达相对于短 (方差分析, P < 0.001) 增加。(b) 本小组显示在improvisus的成人中, 水通道蛋白在不同矿化度2期间的表现。qPCR 被用来确定水通道蛋白的表达水平相对于肌动。成年个体在3个不同的矿化度 (3, 20 和 33) 孵化了14天。为 RNA 准备, 成人的躯体、cirri 和地幔被分离了。在这两个数字中, 误差线表示标准偏差。** 和 ** 分别表明了意义的程度 (方差分析), 0.01 和0.001。这些数字已经从林德等。2,3. 这两个数字都是在公共图书馆的许可下公布的。请单击此处查看此图的较大版本.

结算阶段总 RNA 量 (ng)
免费游泳512
探索: 近距离搜索518
附加 cyprid550
新变质的少年832

表 1: RNA 的产量.本表显示了在沉降过程中不同阶段收集的 20 cyprid 个体的 rna 制备试剂盒提取的 rna 数量。

讨论

Tjärnö海洋研究实验室 (瑞典) 的藤壶养殖已经运行了20年, 并被用于许多不同研究领域的研究。在过去的几年中, 已经出版了超过30份科学论文, 其中包括防污13、22、流体力学23、化学生态学24、气候变化16的研究., 进化生物学5和分子生物学2。

为了避免选择一些更适合实验室环境的个体 (可能不代表野生人口的个体), 建议每年从田间收集新的亲鱼。此外, 每年对文化进行振兴也是一种良好的做法, 因为在正常的一年里, 成年人的死亡率大约为 50-80%。然而, 如果目的是生产自交系或建立实验性进化研究, 只有实验室饲养的家庭才会被使用。

在 Tjärnö海洋研究实验室的面板上收集improvisus的好时间是在 June–August, 因为当时在海里有很好的 cyprid 幼虫供应。每周检查面板, 看看藤壶定居点何时开始, 并手动移除 improvisus (如贻贝、tunicates、苔藓虫和、hydroids、纽虫/tubeworms 和其他藤壶物种) 的其他已定居物种.面板 (例如, 用牙刷)。Tjärnö周围有三种浅水藤壶物种 (improvisus、 Semibalanus balanoides和Balanus crenatus)。然而, B. improvisus是 July–August 期间光滑坚硬表面的主要 fouler。balanoides在早春时有沉降期, 主要倾向于天然基质 (如石头)。crenatus在夏季可能会在面板上出现低数。

也有可能从培养的 cyprids 开始新的成年藤壶世代, 这将是必要的, 如果某些 linages 具有特定的特征已经建立, 或在研究的实验性进化。开始新一代成人最方便的方法是在实验室的热塑性塑料板上 cyprids。这些新定居的 cyprids 的面板也可以用于实验治疗或在野外暴露。在紧急情况下, 你也可以使用来自附近地点的巨石的成年人 (例如, Idefjorden 在 Tjärnö海洋研究实验室的情况下), 其中B. improvisus是常见的。这些已经建立成人的治疗方式与成人在面板上, 从而被放置在托盘和美联储通过流经系统。流动细胞也可以用来建立与藤壶25的面板。这些是流动的房间与浮游生物网在 cyprids 不安定的边, 以小组作为唯一的解决表面为幼虫。

有几个步骤, 对于建立一个长期运作的藤壶文化, 包括所有生命阶段至关重要。用于培养B. improvisus的方法在很大程度上也适用于其他具有自由游泳、planktotrophic 幼虫的海洋无脊椎动物。一些物种的培养程序已经被很好的描述 (例如, 对于蓝贻贝和不同种类的牡蛎)26, 而对于其他海洋无脊椎动物, 只有几个例子, 长期文化跨越他们的整个生命周期。第一次成功的文化藤壶 (B. 安菲特律特) 的尝试是由 Rittschof等人完成的。15. 在考虑设立藤壶养殖设施之前, 应建立长期财政和个人资源。这类藤壶文化的维护需要至少一个人工作一半时间。今后在生产线上一些步骤的自动化可能有一定的潜力, 主要是微藻的培养27。此外, 为了取得成功, 有必要获得大量高质量的海水。微藻、卤虫和藤壶的培养不涉及任何特定的安全程序。然而, 一些防污物质或有毒化学品的测试可能需要特别的预防措施。

这些小组每周检查几次以进行污染。养殖中使用的海水从 Tjärnö海洋研究实验室外的科斯特峡湾的40米深度抽水, 在进入实验室水系统之前经过两个滤砂过滤器。如果没有过滤的水已经做, 将有更多的污染, 在文化。必须定期清洁从碎屑和其他无脊椎动物 (例如stolon 建筑 hydroids 和捕食性纽虫) 进入该系统的文化中的面板, 从该领域供应海水。例如, 如果没有生产幼虫, 尽管这一文化已经得到了很好的喂养, 否则似乎状况良好, 问题可能是纽虫的存在, 似乎抑制交配。自然地, Tjärnö海洋研究实验室的文化中的许多污染生物是专门为瑞典西海岸, 和其他类型的污染生物将是普遍的和更大的挑战在其他地理区域。在瑞典的西海岸, 在面板上发现其他藤壶物种的污染是不寻常的。有时, balanoides的建立已经被发现, 但这是一个非常边缘的问题 (最多, 一个S balanoides污染物为 1万B. improvisus样品)。在夏季, 当 larvaefrom B. improvisus具有高度优势时, 缺乏污染物种很可能依赖于建立新文化的制度。此外, 还有一个明显的丰富的improvisus在面板上, 因为这个物种是选择性的表面光滑13。

清除死亡的成年藤壶是必不可少的。如果空壳留在面板上, 它们可以成为卤虫幼体以及各种污染物种的庇护所。此外, 人们还注意到, 死亡的个体会影响邻近个体的福祉, 可能是在分解过程中释放有毒化合物。成人死亡率的另一个后果是, 一些人将被单独和离任何其他成年人太远, 以允许交配 (即使藤壶有在动物世界中最长的阳具与它的大小)28。这些人将生存, 但不生产的幼虫。然而, 这些孤立的成年个体可以轻轻地移除不损害基板和被放置在水平接近他人, 以使交配。藤壶也可以配对通过放置面板与一个成年人在每个但足够接近, 以便交叉受精可能发生。这样, 基因线就可以产生14。

几乎每天都要生产高质量的饲料和喂养文化是至关重要的。即使几天没有食物, 也会减少幼虫的释放。以前的饮食成分测试表明, 硅藻对藤壶幼体的生长和存活是必不可少的。一些硅藻品种似乎足够作为饲料, 虽然小或单独的细胞 (直径小于10µm) 可能是必要的幼体的摄取。pseudonana 的marinoi、单纯形和T.均已证明是improvisus幼体的适宜饲料, 同时也易于培养。此外, 在呈指数增长的藻类中, 饲料质量一般较高。据报道, 硅藻对建立B. 安菲特律特15的生产文化是必不可少的。硅藻的重要性的理论是, 他们有一个独特的脂肪酸剖面, 特别丰富的高不饱和度20:5 脂肪酸29。结果表明, 某些脂肪酸对30牡蛎幼虫的成功发育具有重要意义。

多年来, 藤壶文化中没有发生过有害疾病的发病率。在许多商业无脊椎动物水产, 如牡蛎和贻贝, 疾病是相当普遍的, 可能是非常有害的。野生种群也报告了病毒的有害影响。在法国的当地牡蛎被葡萄牙牡蛎angulata在1925年替换了, 但这个种类由虹彩模识消灭了大约 197031。最近, 太平洋牡蛎在世界各地的文化中发生了大量的死亡事件, 这似乎与 ostreid 疱疹病毒 132有关。迄今为止, 还没有发表关于藤壶病原体、细菌或病毒的报告。然而, 在正在进行的improvisus基因组项目中, 发现了病毒序列 (Alm Rosenblad等, 未发表的数据), 但与疾病症状没有明显的联系。抗生素的混合物以前被应用到文化中, 以尽量减少细菌感染的风险;然而, 这一程序目前被遗弃, 到目前为止, 这并没有造成任何污染问题。

如果海水受热 (如上所述), 过热可能是养殖生产线上最严重的风险。当然, 尽管可以使用传感器和适当的警报系统 (例如, 向负责人员发送电子邮件或短信), 但防止过热是困难的。这种情况在过去造成了成年人在文化中的大量杀戮。当然, 这可能是毁灭性的, 破坏长期投资的时间和金钱。特别是, 如果建立了近亲繁殖的遗传线, 这将是灾难性的。为了保证这些线路的寿命, 并确保它们免受意外损失, 最好为藤壶开发一种冷冻保存方法。据报道, 来自太平洋牡蛎的幼虫可以冷冻下来, 并恢复部分成功33。Cryobanking 还是保护34种种类的遗传资源的宝贵工具。据报道, 即使是从B. 安菲特律特的幼体在冰冻35中存活下来, 也发现20% 的冰冻个体成功变质成 cyprids36。然而, 目前还没有采用冻结的方法来维持文化的长期可持续性, 但确实需要维护选定的路线;这将是坚定地建立improvisus成为强有力的海洋 modelsystem 的重要步骤。

在这里, 提出了一个协议, 以解剖不同的组织从成人的improvisus (即, cirri, 躯体, 和壁炉)。然而, 应该强调的是, 其他组织也可以提取。例如, Tetraclita的膜基种的外幔和内地幔之间的软组织被仔细隔离, 用于 rna 提取和 rna 序列分析的基因表达37。此处描述的概要优化提取协议提供了足够数量的高质量 RNA, 用于从极小的起始材料中进行排序。首先, 将单个幼虫直接收集到均匀化管中, 将从一管转移到另一管子的损失降到最低。此外, 在不同的试验方法中, 与超声波或杵均匀化相比, 与陶瓷珠的均匀性在 RNA 的产量和完整性方面是最有效的。在规划基因表达或基因组实验时, 你必须牢记藤壶中高遗传变异的挑战, 至少对improvisus。藤壶有一个遗传多样性的范围 3–5%, 甚至在编码区域 (Alm Rosenblad等, 未发布的数据)。当然, 这对 qPCR 分析的引物设计提出了具体要求, 其中应确定更多的保守区域, 并将其用作底漆的模板, 以获得一致的表达结果 betweenbatches。对目标基因的保守区域, 如水通道蛋白和 Na +/K + ATPases, 可以通过研究这些基因的序列变异性, 从含有数以百计的人的 cyprids 的种群中获得。对于基因组分析, DNA 将被取样。然而, 从B. improvisus获得高质量的 DNA 可能具有挑战性21。

最后, 建立的藤壶文化在不同的实验研究中被证明是有益的。特别是, 全年幼虫生产允许我们进行实验, 而不限于自然发生的产卵期 ( B. improvisus, 这是在夏季)。获得的幼虫可用于进行广泛的实验研究, 包括沉降分析, 行为分析, 对特定基因的表达研究, 以及全基因组的转录研究。

披露声明

作者没有什么要申报的。

致谢

这项研究得到了瑞典研究理事会 (VR) 赠款2017-04559 的支持, 欧盟支持布隆博格。特别是, 多年来, 建立了培养设施, 得到以下供资机构的赠款支持: 琼森 (瑞典战略研究基金会), 通过海洋科学和技术方案和密斯特拉通过程序海洋漆。肯特 Berntsson 在建立 culturingfacility 的早期阶段发挥了作用。为建立培养设施提供的额外资金来自海洋进化生物学中心 (www.cemeb.science.gu.se), 由瑞典研究委员会 FORMAS 和 VR 资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panelsPlastic produkter, Bromma, Swedentransparent glas
1.5-L PET bottle
ArtemiaINVE Aquaculture, BelgiumWe have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland strain 1085/3
Millipore cartridge filter systemMillipore 
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µmMillipore cartridge CWSS01S03High capacity for large volumes
polycarbonate bottleNalgeneautoclavable
RNA laterQiagen76106 Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free KitInvitrogen/Thermofisher Scientific  AM1907DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis KitBiorad1708890cDNA synthesis kit
SYBR Green supermixBiorad1708880Dye for QPCR
RNeasy minikitQiagen74104RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubesPrecellysKT03961-1-003.2Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kitQiagen74004RNA extraction of few cyprids

参考文献

  1. Darwin, C. . A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , (1854).
  2. Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
  3. Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
  4. Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
  5. Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
  6. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
  7. Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
  8. Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
  9. Anderson, D. T. . Barnacles - structure, function, development and evolution. , (1994).
  10. Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
  11. Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
  12. Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
  13. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
  14. Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
  15. Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
  16. Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
  17. Guillard, R. R. L., Smith, W. L., Chanley, M. H. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. , 22-60 (1975).
  18. Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
  19. Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
  20. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
  21. Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
  22. Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
  23. Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
  24. Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
  25. Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
  26. Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
  27. Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
  28. Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
  29. Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
  30. Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -. &. #. 1. 9. 7. ;. Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
  31. Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
  32. Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
  33. Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
  34. Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
  35. Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
  36. Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
  37. Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

138Balanus Amphibalanus improvisusCypridsRNAPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。