Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

Zusammenfassung

Die Nonnengänse (Amphibalanus) Balanus Improvisus ist ein Modell für die Untersuchung Muskeltätigkeit und Antifouling. Natürliche saisonale Laichen führt jedoch eine unvorhersehbare Versorgung mit Cyprid Larven. Hier ist ein Protokoll für die All-Year-Round Kultivierung von B. Improvisus beschrieben, einschließlich der Erstellung von Larven. Die Verwendung von kultivierten Seepocken in genexpressionsstudien wird dargestellt.

Zusammenfassung

Seepocken sind marine Krebstiere mit Traubeneichen Erwachsenen und nautiliden, planktonischen Larven. Die Nonnengänse (Amphibalanus) Balanus Improvisus ist aufgrund seiner extremen zu niedrigen Salzgehalt besonders relevant als Modell für das Studium der osmoregulatorischen Mechanismen. Es ist auch als ein Modell zur Beilegung der Biologie, insbesondere in Bezug auf Antifouling Forschung verbreitet. Natürliche saisonale Laichen führt jedoch eine unvorhersehbare Versorgung mit Cyprid Larven für Studien. Ein Protokoll für die All-Year-Round Kultivierung von B. Improvisus entwickelt wurde und eine detaillierte Beschreibung aller in der Fertigungslinie Schritte wird beschrieben (d. h., die Einrichtung von Erwachsenen Kulturen auf Platten, die Sammlung und Aufzucht von Barnacle Larven, und die Gabe von Futter für die Larven und Erwachsene). Die Beschreibung auch Anleitungen zur Fehlerbehebung und kritische Parameter (z. B.die Entfernung von Verunreinigungen, die Herstellung von qualitativ hochwertigen Futtermitteln, die menschliche Arbeitskraft benötigt und die Bedeutung von qualitativ hochwertigen Meerwasser) diskutiert. Jede Charge von der Kultivierung System maximal ergibt etwa 12.000 Nauplien und liefern vier Chargen in einer Woche, also bis zu fast 50.000 Larven pro Woche hergestellt werden können. Die verwendete Methode zur Kultur B. Improvisus ist wahrscheinlich, zu einem großen Teil auch auf anderen Wirbellosen Meerestieren mit frei Swimminglarvae anwendbar. Protokolle werden für die Zerlegung von verschiedenen Geweben von Erwachsenen als auch die Produktion von qualitativ hochwertigen RNA für Studien auf die Genexpression dargestellt. Es ist auch beschrieben wie kultivierte Erwachsene und gezüchteten Cyprids genutzt werden, in einer Vielzahl von experimentellen Designs zur Untersuchung der Genexpression im Zusammenhang mit externen Faktoren. Die Verwendung von kultivierten Seepocken im Genausdruck ist illustriert mit Studien über mögliche osmoregulatorischen Rolle von Na⁺/k⁺ ATPase und Aquaporine.

Einleitung

Seepocken sind marine Krebstiere mit Traubeneichen Erwachsenen und nautiliden, planktonischen Larven. Die meisten 1.200 Arten von Seepocken bewohnen Flachwasser und viele oft niedrigen Salzgehalt ausgesetzt sind. Eine Spezies, die Bucht Barnacle improvisiert, Balanus (Amphibalanus) (B. Improvisus), verträgt fast Süßwasser und Charles Darwin beschrieb diese Art von einem kleinen Bach in der Mündung des Rio De La Plata in Uruguay¹. Die extreme Toleranz Tolow Salzgehalt macht B. Improvisus Modellcharakter für die Studien von osmoregulatorischen Mechanismen^2,3besonders relevant. Diese Barnacle bevorzugt Brackwasser Bedingungen aber ist in der Lage sind, Leben in Gewässern mit Salzgehalt von etwa 1,6 Psu zu so hoch wie 40 Netzteil⁴. Es ist die einzige Barnacle Arten in das Brackwasser der Ostsee. B. Improvisus wird geglaubt, um von der Ostküste des amerikanischen Kontinents stammen aber heute durch⁵Versand weltweit wegen Verbreitung gefunden. Es ist ein großer Verschmutzung Organismus und findet sich häufig auf Felsen, Molen und Bootsrümpfe und deshalb von allgemeinem Interesse für das Verständnis der Mechanismen von Biofouling an Konstruktionen in marine und Brackwasser^6,7.

Ähnlich wie bei den meisten anderen Seepocken, B. Improvisus ist zwittrig mit gegenseitigen Befruchtung; Fortpflanzung geschieht durch Paarung zwischen benachbarten Individuen mit einem länglichen Penis und innere Befruchtung. Die reproduktive Periode ist vor allem von Mai bis September. B. Improvisus hat sieben pelagische Larvenstadien (sechs Nauplien gefolgt von einem Cyprid Stufe⁸). Das befruchtete Ei schlüpft in eine Nauplius-Larve, die nautiliden und in der Wassersäule für bis zu mehreren Wochen vor der Häutung in eine nicht-Fütterung Cyprid Larve ernährt. Die Cyprid nutzt mehrere Hinweise um zu finden, einen geeigneten Standort zu begleichen und dann erfährt Metamorphose in eine festsitzende juvenile Barnacle-⁹. Die Art kann im Labor kultiviert werden und hat eine Lebensdauer von 1 – 2 Jahre im Meer (2 – 3 Jahre in Laborkultur). Im Durchschnitt B. Improvisus wächst auf 10 mm im Durchmesser (mit einem Maximum von ca. 20 mm) und erreicht eine maximale Höhe von ca. 6 mm (obwohl es unter beengten Verhältnissen höher zu wachsen). Die Spezies kann durch seine glatte kalkhaltigen sogar Schale (weiß oder grau) identifiziert, der Radial gemusterten kalkhaltigen Basis der die Außenhaut und die Form der Platten sind^1,10.

Die Barnacle B. Improvisus hat mehrere vorteilhafte Merkmale als Modell für die Studien der Muskeltätigkeit, mit einem Fokus auf Molekulare und physiologische Mechanismen sowie ökologische Wechselwirkungen und evolutionären Konsequenzen. Es ist auch als Modell für die Untersuchungen zur Beilegung der Biologie, insbesondere in Bezug auf Antifouling-Forschung und die Mechanismen beteiligt^7,11,12,13verbreitet. Natürliche saisonale Laichen führt jedoch eine unvorhersehbare Versorgung mit Cyprid Larven für Studien. Die Fähigkeit, diese Barnacle über seinen gesamten Lebenszyklus ganzjährig Kultur ist daher ein wichtiger Trumpf, verschiedene Arten von molekularen und mechanistische Studien ermöglichen. Darüber hinaus erlaubt seine Präsenz in Marine/Brackwasser weltweit für eine Kombination aus Feld und experimentelle Studien. Kontrollierte Zucht produzieren auch Familien von bekannten Stammbäume für langfristige Kultivierung¹⁴und eine Generationszeit von ein paar Monaten ermöglicht langfristige experimentelle Evolution. Gibt es auch einen Entwurf des Genoms und mehrere Transkriptom und diese Ressourcen für das Klonen von mehreren Genen (z.B. Gene von Bedeutung für die Muskeltätigkeit)^2,3verwendet worden.

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie aufbauen und pflegen eine Kultur der Barnacle B. Improvisus im Laufe des Jahres um genexpressionsstudien auf Erwachsene oder Larven dieses Organismus durchzuführen. Rittschof Et al. ¹⁵ kurz beschrieben eine Methode zur Kultivierung Seepocken aus der Auflösung von Nauplien zur Regelung der Cyprids für die Spezies Balanus Amphitrite. Das Protokoll wurde angepasst für das ganze Jahr über Kultivierung von B. Improvisus Tjärnö Marine Research Laboratory (Schweden), und eine detaillierte Beschreibung aller Schritte in der Fertigungslinie ist skizziert, einschließlich der Erzeugung und Aufzucht von barnacle Larven, als auch die Gabe von Futter für die Larven und Erwachsene. Eine Übersicht über die komplette Prozedur siehe Abbildung 1. Die Nutzung des Systems der Kultivierung ist illustriert mit einigen gemeinsamen Versuchsanordnungen und illustriert in funktionsgenomics Studien von Na⁺/k⁺ ATPase und Aquaporine, ihre möglichen Funktionen in Muskeltätigkeit^{2, Erläuterung 3}. Es ist manchmal wichtig, die Genexpression in bestimmten Geweben zu untersuchen, und einige der Grundlagen der Barnacle Dissektion abgedeckt werden. Mit einer guten Versorgung mit qualitativ hochwertigen Meerwasser sollte die Kultivierung von Barnacle B. Improvisusund potenziell viele andere Arten in marine Laboratorien überall auf der Welt möglich.

Protokoll

1. Sammlung von Erwachsenen Seepocken im Feld eine neue Brutbeständen starten

1. Bereitstellung von Thermoplast (Poly-Methyl-Methacrylat) transparente Panels (110 x 110 x 1,5 mm³) ≈ 1 – 3 m Tiefe in ruhige Gewässern um Erwachsene Seepocken vom Feld zu sammeln. Verwendet Frames, die nehmen mehrere Panels (Abb. 2A), Bohren Sie 2 Löcher (mit einem Durchmesser von 6 mm) in den oberen Ecken der einzelnen Panel und Attachthepanelstotherackusingcableties. Damit das Wasser Thepanelswillhangverticallyin.
   1. Wann ist die Ansiedlung von Seepocken (identifiziert als kleine weiße harte Punkte auf den Tafeln) aufgetreten, lassen Sie die Platten mindestens 2 – 3 Wochen um sicherzustellen, dass die Seepocken groß sind genug (5 mm) bis zum Labor übertragen werden, ohne getrocknet oder beschädigt.
2. Holen Sie die Platten ins Labor, wenn sie fallen, mit ständiger B. Improvisus , die eine Größe von ca.erreicht haben. 5 mm Indiameter.
   Hinweis: Die Zeit für Erwachsene zu entwickeln, bis zu 5 mm im Feld ist stark abhängig von der Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln und die Temperatur. Normalerweise dauert dies ca. 3 Wochen Tjärnö Marine Research Laboratory (58,87 ° N, 11.14 ° E). Am häufigsten sind Panels für die neue Brutbeständen in der Regel Ende Juni bereitgestellt und Ende August gesammelt.
3. Vor der Einführung Reinigen der Platten in die Kultur-Anlage andere Organismen aus den Paneelen. Es ist am wichtigsten, andere Arten Barnacle zu entfernen. Bitte beachten Sie, dass es wichtig ist zu häufig reinigen die Paneele zu entledigen Arten während des Anbaus verunreinigen, da dies die Überlebenschancen von den Brutbeständen deutlich erhöhen wird.
4. Setzen Sie die Platten senkrecht am Rand in einem Ständer mit gefrästen Nuten in einem Polyethylen-Behälter (400 x 400 x 20 mm-³) (Abbildungen 2 und 2E). Die Nuten im Ständer sind 15 mm auseinander.
5. Um die Fächer vorzubereiten, machen Sie eine Eintrittsöffnung an der Basis und einer Ausgangsöffnung an der Spitze auf der gegenüberliegenden Seite des CD-Fach. Schließen Sie die Eintrittsöffnung für jedes Fach an ein 100 L Becken mit ca. 30 L Wasser mit einem Einlass der offenen Meerwasser bei 20 ° C um eine Durchströmung mit einer Rate von cazu ermöglichen. 2 L / min..
   Hinweis: Bis zu 8 Trays wurden zu einem einzigen 100 L Reservoir verbunden.
6. Verbinden Sie den 100 L Behälter mit temperierten Meerwasser (20 ° C) (z. B. durch eine Wärmepumpe, die Austausch von Wärme aus dem eingehenden Meerwasser zur Verfügung gestellt).
   Hinweis: Die Barnacle B. Improvisus können wachsen und reproduzieren in einem vollen marine Salzgehalt (30 – 35 Psu); jedoch Verringerung des Salzgehalts, ca. 25 Psu durch Zugabe von Frischwasser 100 L Behälter steigert die Leistung von Larven aus der Kultur.

2. starten neue Generationen von Erwachsenen aus kultivierten Cyprids

1. Würfel von oben offen thermoplastische Platten durch taping 5 Platten zusammen mit einem nicht-toxischen, wasserdicht Band zu konstruieren.
2. Setzen Sie die Würfel in eine kleine Schale (im Falle einer Leckage) und füllen Sie es mit Meerwasser (25 Psu). Halten Sie das Wasser bei Raumtemperatur (ca. 20 ° C). Fügen Sie etwa 200 Cyprids an der Oberseite des Würfels.
3. Füttern die Jungtiere mit 100 mL Skeletonema Marinoi jeden zweiten Tag (siehe Schritt 5) zwar im Cube.
   Hinweis: Juvenile Seepocken haben Schwierigkeiten mit der Einnahme von Artemia Salina (siehe Schritt 3) da sie groß und daher schwer zu schlucken für ein neu besiedelten Barnacle sind.
4. Wasserwechsel 1 x pro Woche.
5. Nehmen Sie nach 2 Wochen, wenn die Platten genug etablierte Jungtiere von mindestens 5 mm im Durchmesser enthalten den Würfel auseinander und verschieben Sie die Platten mit den Jugendlichen auf Tabletts mit Flow-Throughseawater und danach füttern Sie die Seepocken mit A. Salina Nauplien.

3. Kultur der Nauplien von Artemia Salina als Futter für Erwachsene Seepocken

1. Richten Sie eine Kultivierung System für A. Salina mithilfe einer 1,5 L Plastikflasche, wo die Bottomis abgeschnitten und die Flasche befindet sich kopfüber in einen Stand und von der Seite beleuchtet. Passen Sie den Engpass zu einem Silikonschlauch mit einer Klemme und verbinden Sie es mit einer belüftungspumpe (Abbildung 2D).
2. Um die Eier Ausbrüten, fügen Sie hinzu, etwa 15 mL trockenen ruhen Eier von Artemia 1 L Ofseawater.
   Hinweis: Artemia Eier schlüpfen in Nauplius-Larven nach 24-48 h. Um das Schlüpfen der A. Salina Nauplien (z. B.am Wochenende) zu verzögern, kann das Licht ausgeschaltet werden, um die Temperatur etwas reduzieren.
3. Artemia Nauplien ernten, schalten Sie die Belüftung und verdunkeln Sie den oberen Teil der Flasche mit Alu-Folie (oder ähnlich wie z.B.eine Dose)... Leuchten, die der untere Teil der Flasche für 10 min. Hatched Artemia Nauplien in Richtung des Lichts Schwimmen wird. Non-geschlüpft Zysten werden auf den Boden sinken und Zyste Schalen werden an der Oberfläche schwimmen.
4. Öffnen Sie die Halterung an der Unterseite. Sammeln Sie die zwischenfraktion wie eine dichte Bevölkerung von den Nauplien schwimmen.
   Hinweis: Jeden Tag (außer am Wochenende), 1 L der dichten Artemia Nauplien Suspension wurde manuell hinzugefügt, um Anschluss an die Tabletts mit den Erwachsenen Seepocken 100 L-Behälter. Vermeiden Sie jede Fütterung mit leeren Zyste Muscheln, da sie nicht Nahrung bieten und resultieren im Wesentlichen in der Kultur in kürzeren Abständen reinigen zu müssen.

4. Erhebung und Aufzucht von Barnacle Larven

1. Reinigen Sie die Platten mit Erwachsene Seepocken durch sanft Besprühen mit Süßwasser und entfernen Sie ggf. alle Verschmutzungen aus dem Barnacle Schalen und Platten mit einer weichen Zahnbürste. Reinigen Sie auch die Schalen (ohne Seepocken) und Rohre in heiß (75 ° C) Süßwasser.
2. Setzen Sie ein Sieb hergestellt aus einem 90 µm Plankton-Netz geklebt, um am Ende einen Schnitt PVC-Rohr (16 cm Durchmesser, 15 cm hoch) in einen Polyethylen-Behälter (30 x 20 x 10 cm³) mit einem Überlauf Anschluss. Sammeln Sie die B. Improvisus Larven in das Sieb über Nacht (Abbildung 2C).
   Hinweis: Das Sieb wurde knapp unterhalb der Ausgangsöffnung des Fachs der Barnacle Platten das abfließende Wasser erhalten und die Nauplien herausfiltern positioniert. Die Larven blieb im Sieb, während das Meerwasser das kleine Fach übergelaufen. Dieses kleine Tablett sichergestellt, dass das Sieb nie Driedout.
3. Legen Sie einen 30 L Eimer in einem großen Wasserbad wo bleibt die Temperatur bei 26 ° C mit Aquarium Fisch behälterheizungen (Abb. 2E). Belüftung und Unruhe werden von Luft sprudelt durch das System sichergestellt.
4. Füllen Sie den Eimer mit 20 L gefilterten Meerwasser (0,2 µm; 25 Psu). Hinzu kommt 1 L Eimer mit einer 60/40-Mischung aus den 2 Diatomee Mikroalgen, S. Marinoi und C. Gracilis (siehe Schritt 5). Dies wird eine anfängliche Dichte von etwa 5 x 10⁴ Diatomeen pro mL in den Eimer geben.
   Hinweis: Barnacle Nauplien Larven sind positiv phototaktische. Die Eimer wurden von opak weißem Kunststoff mit Deckel, die etwas Licht durchlässt. Im Winter war das Zimmer tagsüber (08:00 – 17:00), aber während der Nacht dunkel beleuchtet. Während des Sommers kam das äußere Licht ins Zimmer, während der meisten Zeit des Tages.
5. Übertragung der gesammelten B. Improvisus Nauplien in eine kristallisierende Schale (50 mm Höhe, 300 mL; 90 mm im Durchmesser).
6. Beleuchten Sie das Gericht von der Seite, die die Larven der Lichtquelle anziehen wird. Sammeln Sie die Barnacle Nauplien, die auf das einfallende Licht mit einer Pipette erfassen und übertragen Sie sie auf ein weiteres kristallisierenden Gericht. Entfernen Sie alle verbleibenden Artemia -Larven.
7. Übertragen Sie B. Improvisus Nauplien Larven auf einen Becher mit 1 L des gefilterten Meerwasser.
8. Die Anzahl der Nauplien rühren das Becherglas vorsichtig, um eine sogar Aussetzung der Larven zu bekommen und dann fünf 1 mL Proben aus verschiedenen Orten in den Becher geben. Übertragen Sie jede Probe in einer Mikrotestplatte für eine Sichtkontrolle mit einem Stereomikroskop. Die Anzahl der Nauplien in jedem der fünf Proben und sie addieren.
9. Multiplizieren Sie die gezählte Anzahl von 200 (1.000 mL/5 mL) zu schätzen, wie viele Tausende von Larven im ganzen Becher. Wenn es zu viele Nauplius-Larven in den Becher geben gibt, verdünnen Sie die Probe, bis die Dichte bei den meisten 14.000 Larven/L (in der Regel im Bereich von 11.000 – 12.000 Larven/L ist).
10. Einen Eimer, damit du ungefähr 11.000 – 12.000 Larven pro Eimer fügen Sie 1 L von B. Improvisus Nauplien hinzu.
    Hinweis: Stellen Sie sicher nicht zu mehr Nauplien hinzuzufügen, da dies zu wenig Nahrung in Bezug auf die Larven zur Folge und, infolgedessen Sterblichkeit erhöht.
11. Nach 3 Tagen sammeln Sie Barnacle Nauplien auf einem 90 µm-Sieb. Reinigen Sie den Eimer (mit 75 ° C Süßwasser), füllen Sie ihn mit gefiltertem Meerwasser fügen Sie einen neuen Feed Diatomee (die gleiche Menge wie am Anfang) und schließlich fügen Sie die Nauplien erneut hinzu. Cyprids beginnen nach etwa 6 Tagen (± 1 Tag) angezeigt werden.
12. Sammeln Sie Cyprids zuerst mit einem 90 µm-Sieb (wie in Ziffer 4.2 genannten entworfen). Dann trennen Sie nicht gehäutet Barnacle Nauplien und Cyprids mit einem 320 µm-Sieb oben auf einem 160 µm-Sieb. B. Improvisus Nauplien sammeln in den 320 µm-Sieb und Cyprids in der 160 µm-Sieb.
    Hinweis: Die Cyprid Larven können in der Dunkelheit für eine spätere Verwendung bis zu cabei 10 ° C in einer kristallisierenden Schale gespeichert werden. 6 Tage. Die Speicherung kann jedoch beeinflussen die Qualität und Leistungsfähigkeit der Barnacle Larven, also Experimente vergleicht man verschiedene Behandlungen sollten im Idealfall Larven aus der gleichen Charge (und ähnliche Speicherzeit), verwirrende Effekte¹⁶zu vermeiden.

5. Kultur von Mikroalgen als Futter für Barnacle Nauplius-Larven

Hinweis: Algen wurden in 3 verschiedene Arten von Kulturen angebaut: (i) Kulturen, die für die langfristige Erhaltung der Stämme, die für die Impfung von der Skalierung; verwendet wurden auf Lager (Ii) Start-Kulturen, die den ersten Schritt in das Scale-Up sind; und (Iii) die Produktionskultur, die endgültige Produktion großer Mengen von Algen als Barnacle ist schließlich zu ernähren.

1. Bestellen Sie Diatomee Arten aus dem Kultur-Sammlung von Algen und Protozoen (CCAP) als Futter für die Barnacle Nauplius-Larven verwendet werden. Die 2 Arten Skeletonema Marinoi (CCAP Stamm 1077/5) und Chaetoceros Simplex var. Gracilis (CCAP Stamm 1085/3) geben gute Ergebnisse als Futter.
2. Filtern Sie alle Meerwasser verwendet werden, in den Algen Kulturen mit einer Cartridge-Filter-System mit einer nominalen Porengröße von 0,2 µm. (die gefilterten Meerwasser ist auch für die Schraffur von A. Salina Eiern und die Kultivierung der Barnacle Nauplius-Larven verwendet werden.) Autoklaven der gefilterten Meerwasser für die Algen Kulturen (bei 105 ° C für 5 min).
3. Bereiten Sie ein Medium für die Kultur von Mikroalgen, mit autoklaviert Meerwasser angereichert mit Guillard f/2 Lösung mit anorganischen Nährstoffen, Spurenelementen und Vitaminen (siehe Guillard 1975¹⁷ für das ausführliche Rezept). Darüber hinaus bereiten Sie eine Lösung von Silikat (Na₂SiO₃), aber bewahren Sie diese getrennt von der f/2 Bereicherung, einen solide Niederschlag zu verhindern.
   Hinweis: Die Konzentrationen der Vorratslösung Bereicherung und Silikat-Stammlösung waren bereit, als eine 1 mL Zugabe von jeweils 1 L Meerwasser verwendet werden.
4. Autoklaven verwendet alle Geräte in die Algenkultur bei 120 ° C für 20 min. Autoklaven Schraube begrenzt Reagenzgläser mit 1 mL der Bereicherung f/2 und 1 mL Silikat-Lösung. Die Anreicherung und Silikat-Lösungen Theseawater beim Hinzufügen der autoklaviert Glaswaren und Flüssigkeiten auf Raumtemperatur abgekühlt sind.
5. Wachsen Sie Stammkulturen von Mikroalgen in 40 mL Reagenzgläser mit Schraubverschlüssen.
   1. Füllen Sie die Reagenzgläser mit etwa 30 mL angereichertes Meerwasser. Die Kulturen mit einem sterilen Pasteurpipette mit etwa 1 mL einer 2 Wochen altes Lager Kultur zu impfen. Der Schraubverschluss ist dann aber nicht angezogen, um einige Gasaustausch zu ermöglichen. Falls vorhanden, sollte die Impfung in einem Laminar-Flow Kabinett zur Verringerung des Risikos einer Kontamination durchgeführt werden.
      Hinweis: Ziel der Stammkulturen ist weiterhin, dass Algen Kulturen auf einer langfristigen Basis und als Inokulum für Kulturen beginnen. Stammkulturen wurden alle 2 Wochen erneut geimpft.
   2. Setzen Sie die neue Lager Kultur auf ein weißes Licht mit einer Intensität von ca. 25 – 50 µmole m^-2s^-1 (mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 16:8 h). Bewegen Sie die alten Stammkulturen, eine geringe Lichtintensität als Back-Up. Entsorgen Sie alle 2 Wochen alten Stammkulturen.
6. Impfen Sie für die Aufstockung der Produktionskultur von Algen die Start-Kulturen aus dem Lager Kultur zu und wachsen sie in 500 mL Erlenmeyerflasks.
   1. Autoklaven 4 Erlenmeyerkolben, Pipetten und Baumwolle Stopper mit 300 mL gefiltertem Meerwasser (0,2 µm) und 4 Reagenzgläser mit 0,3 mL Bereicherung f/2 und 4 mit Silikat-Lösungen. Die f/2 Bereicherung und das Silikat auf Raumtemperatur abkühlen, und die Lösungen zu den Erlenmeyerkolben hinzufügen. Mit cazu impfen. 1 mL der 2 - Wochen alten Lager Kultur.
      Hinweis: Bereiten Sie 2 Fläschchen mit S. Marinoi und 2 mit C. Simplex.
   2. Setzen Sie die Kolben auf einem Rütteltisch in eine Lichtintensität von 50 µmole m^-2s^-1. Wenn die Start-Kulturen dichtere Algen Populationen (Gelb-braune Farbe) erworben haben, sind sie bereit, als Inokulum für die Produktion Kulturen verwendet werden, die die Barnacle Larven mit Lebensmitteln versorgt werden.
7. Wachsen Sie Produktion Kulturen in 4 L-Polycarbonat-Flaschen mit Silikon Stopfen mit 2 gebohrte Ports ausgestattet mit Glasröhren.
   1. Schließen Sie 1 Glas Schlauch erreichen an der Unterseite der Flasche eine Luftpumpe über einen Silikonschlauch mit einem 0,2 µm Luftfilter ausgestattet. Stellen Sie sicher, dass die zweite Glasröhre endet knapp unterhalb der Silikon-Stopper und ist gefüllt mit Baumwolle um den Ausgang des injizierten Luft zu ermöglichen.
   2. Jede Woche Flaschen füllen vier 4 L mit gefiltertem Meerwasser und Autoklaven sie zusammen mit den Stöpseln. Darüber hinaus Röhren Autoklaven 4 Test mit 4 mL f/2 Bereicherung und Silikat-Lösungen.
   3. Nach dem Abkühlen f/2 Bereicherung und Silikat-Lösungen, die Flaschen und dann mit der Hälfte des Volumens der Start-up-Kulturen in den Erlenmeyerkolben zu impfen.
   4. Legen Sie die vier 4-Liter-Flaschen mit einer leichten Intensität von 50 – 100 µmole m^-2s^-1.
   5. Ernten Sie die Produktion Kulturen, nach ca. 1 Woche; Sie sind dann ausreichend dichten verwendet werden, für die Fütterung der Barnacle Nauplius-Larven.
      Hinweis: Produktion Kulturen haben eine Lebensdauer von ca. 2 Wochen, was bedeutet, dass zu jeder Zeit gibt es 8 aktive Flaschen.

6. Gestaltung experimentelle Studien mit Seepocken

1. Verlegen Sie die Platten mit Jugendlichen oder Erwachsenen Seepocken in kontrollierten Aquarien, wo sie unter Identicalconditions angebaut werden können. Dies nennt man eine Experiment gemeinsamen Garten nutzbar, z. B. lokale Anpassungen oder phänotypische Plastizität¹⁸zu verstehen oder zu Veränderungen der Genexpression in Bezug auf externe Faktoren (z.B., Salzgehalt, Temperatur oder pH-Wert) zu studieren.
   Hinweis: Es ist auch möglich, Seepocken, die direkt vom Feld auf Platten gesammelt zu verwenden. Ein Vorteil der Verwendung von Einzelpersonen Labor gezüchtet ist, dass mütterliche Effekte vermieden werden können, wenn Sie die nächste Generation von Nachkommen zu verwenden.
   1. Seepocken an die spezifischen Umweltbedingungen während einem Chosentime Intervall, gefolgt von der Ernte der Erwachsenen (z.B.für Studien auf die Genexpression) aussetzen².
2. Der Cyprids Platz für Experimente mit Cyprid Larven gen Expression³zu studieren in kontrollierten Aquarien, wo die Larven unter identischen Bedingungen kultiviert werden kann.
   1. Ernten Sie die Cyprids nach bestimmten Zeiträumen durch Filterung mit sieben (wie in Schritt 4.7 beschrieben), und extrahieren Sie RNA gemäß den Protokollen unten (Schritt 8).

7. Präparation der Seepocken

1. Reinigen Sie den Lab-Raum wo die Dissektion und DNA-Proben durchgeführt werden, Bothbefore und zwischen Einzelpersonen, einschließlich alle Dissektion Werkzeuge. Dies geschieht mit Chlor für die Bank (oder 96 % igem Ethanol für die Zange).
   Hinweis: Beschriftete Röhrchen mit Fixierung Medien (Ethanol oder eine RNA-Stabilisierung-Lösung) werden im Voraus vorbereitet.
2. Wählen Sie große und kurzfristige ausgehungerte Menschen (nicht sie für 2 Tage vor der Dissektion füttern). Reinigen Sie die Barnacle Shell mit einer Zahnbürste zu minimieren das Risiko einer Kontamination von anderen Arten (z. B.Bakterien, Algen) und mit Wasser abspülen.
   Hinweis: Der Grund für den kurzfristigen Hungertod von Einzelpersonen vor der Präparation soll eine DNA-Kontamination (z. B.von Artemia -Zysten im Darm) zu vermeiden.
3. Legen Sie die einzelnen Seepocken auf einer ebenen Fläche, entweder an einem Panel oder lose in eine Schüssel. Die jeweiligen Gewebe von Erwachsenen zu sezieren. Es gibt mehrere Möglichkeiten, Seepocken, abhängig vom Zweck der Studie zu zergliedern.
   1. Dissektion Methode A: die ganze Barnacle so schnell wie möglich beheben.
      1. Entfernen Sie die ganze Barnacle mithilfe ein Skalpell, einfügen, unter den Barnacle und nah an der Panel-Oberfläche aus dem Panel.
         Hinweis: In den meisten Fällen diese Manipulation die basale Platte fast intakt lässt, damit nicht zum Nachteil der Barnacle im Inneren.
      2. Vorsichtig knacken der Außenschale auf der einen Seite durch das Einfügen einer Pinzette (Abbildung 3). Dies geschieht, um das Eindringen von Konzentration Medium innerhalb des Oberteils zu erleichtern.
         Hinweis: Wenn die Shell nicht überhaupt vor dem Einlegen der Barnacle in einem Reagenzglas gebrochen ist, kann es ein langsamer Prozess der Fixierung und später ein minderer Qualität der DNA führen.
      3. Setzen Sie die gebrochenen Barnacle im Reagenzglas, entweder eine RNA-Storage-Lösung oder Ethanol enthalten. Lassen Sie die Barnacle in die Lösung für mindestens 24 h für die Fixierung. Wenn die Barnacle fixiert ist, kann das Tier aus der Fixierung Medien genommen und platziert auf einem Tablett Dissektion. Die Cirri, Mantel und Soma (Körper) können voneinander getrennt und in separaten Röhren für weitere Extraktionen von DNA oder RNA gelegt.
         Hinweis: Es ist wichtig zu beobachten, wenn Ei Lamellen mit befruchteten Eier im Inneren der Barnacle vorhanden sind. Falls vorhanden, sollten diese vor dem Fortfahren mit der DNA Extraktionen zu vermeiden, finden mehrere Genotypen in der Probe entfernt.
   2. Dissektion Methode B: die Nonnengänse aus der Schale vor der Fixierung entfernen.
      Hinweis: Diese Methode kann nicht immer führen in den Mantel wird abgetastet, da es an der Innenseite des Calcareousshell befestigt ist. Es kann jedoch eine schnelle Methode für die Probenahme von DNA von einer einzelnen Person.
      1. Entfernen Sie vorsichtig, mit Dissektion Zange, die sind und scutal Platten (Abbildung 3) von der Spitze der Zange zwischen den Platten sind und scutal einfügen, faßt der Platte und ziehen sanft um zu entfernen.
      2. Greifer halten die Cirri mit der Zange und ziehen die Barnacle gerade heraus und legen Sie sie direkt in 96 % igem Ethanol oder RNA-Lösung zur Fixierung zu stabilisieren...
         Hinweis: Manchmal, der Mantel wird auch sein Stichprobe zum gleichen Zeitpunkt wie gesehen als eine dünne Epithel mit dunkel pigmentiert (in B. Improvisus). Andernfalls kann der Mantel von der Innenseite der Schale mit einem Skalpell entfernt und danach in Ethanol oder RNA stabilisiert Lösung gelegt.
         Hinweis: Die sind und scutal Platten (wenn intakt) können getrocknet und gespeichert, da sie nützlich für die Spezies Identifizierung^{10 sind}. Eine generelle Empfehlung, wenn es irgendeinen Zweifel Arten, ist auch die ganze Barnacle vor der Initialisierung der Dissektion zu fotografieren.

(8) RNA-Extraktion für die Quantitative PCR

1. Setzen Sie Erwachsene für RNA-Extraktion in einer RNA stabilisiert Lösung verwendet werden, inkubieren sie über Nacht (bis zu 24 Stunden) bei 4 ° C und dann speichern Sie sie bei-80 ° C.
   Hinweis: Cyprid Larven sind bevorzugt trocken-gefroren, ohne RNA später direkt bei-80 ° C, indem sie im Cryoröhrchen und dann die Rohre kurz Eintauchen (30 s) in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei-80 ° C.
2. Zum Zeitpunkt der RNA-Extraktion der Seepocken auf Eis Auftauen und verwenden sie intakt oder sezieren aus den Geweben verwendet werden (siehe Schritt 7).
   Hinweis: durch hohe genetische Vielfalt zwischen Individuen (≈ 3 – 5 % Abweichung bei der Codierung Regionen; Alm Rosenblad Et Al., unveröffentlichte Daten) ist es ratsam, Angestellten Anzahl der Erwachsenen Personen, welche die Wirkung der Sequenz Variation zwischen Individuen in einem späteren Schritt qPCR minimiert.
3. Fügen Sie für die RNAextraction 350 µL Lyse Puffer mit einer RNA-vorbereitungssatz in Homogenisierung Röhrchen mit 2,8 mm Keramik Perlen versehen.
   Hinweis: Keramische Perlen bieten eine bessere Ausbeute der RNA im Vergleich zur Beschallung (Vertreter Ergebnisse).
4. Nehmen Sie einen Erwachsenen Barnacle (ganz oder Gewebe) oder sammeln Sie mindestens 20 Cyprid Larven mit Pinzette zu und sie in Homogenisierung Röhren.
5. Gehen Sie direkt zu der Störung und Homogenisierung mit einem Rührwerksmühle.
6. Setzen Sie die Homogenisierung Rohre mit der Probe und Perlen in der Korn-Mühle-Halterung. Schütteln Sie sie mit einer Frequenz von 4,0 m/s für 20 S. Cool die Probe für 1 min auf Eis. Wiederholen Sie 2 X.
7. Bereiten Sie die RNA nach dem Protokoll des im Handel erhältlichen RNA isolierungskit.
   Hinweis: Eine Risikobewertung (einschließlich einer Lesung von Sicherheitsdatenblätter) sollte vor der Verwendung von RNA-Extraktionsmethoden, um gefährliche Chemikalien zu identifizieren, die erfordern den Einsatz von einer Abzugshaube und andere Schutzkleidung einschließlich Handschuhen (z.B.durchgeführt werden die Zugabe von β-Mercaptoethanol in der Lyse Puffer bei der RNA-Extraktion sollte in einem Abzug durchgeführt werden).
8. Die RNA zu quantifizieren. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung und fügen Sie ein Standard und Proben auf ein Gesamtvolumen von 200 µL. Vortex für 2 – 3 s und inkubieren sie 2 min. Einfügen die Röhren in einem Fluorometer und Lesungen.
9. Überprüfen Sie die RNA-Proben für eine Protein-Kontamination mit einem Spektrophotometer, und überprüfen Sie die Integrität ihrer RNA mit einem automatisierten Elektrophorese-System (Vertreter Ergebnisse).
   Hinweis: Für gute Qualität Vorbereitungen, RNA wird empfohlen, ein Verhältnis von 260/280 nm 2 – 2,2 und eine DNA von etwa 1,8. Niedrigere Werte zeigen Protein Verunreinigungen und Extraktionsverfahren muss optimiert werden.

9. die Genexpression: cDNA Synthese und qPCR

1. Behandeln Sie die erhaltenen RNAwith DNase um alle RemainingDNA zu entfernen, bevor die cDNA für qPCR zu machen.
   1. Suchen Sie nach Kontamination genomischen DNA durch Zugabe einer RNA-Probe aber keine Reverse-Transkriptase, wenn die cDNA vorbereiten. Ist eine PCR Amplifikation des ausgewählten Gens auf die cDNA gemacht ohne Reverse Transkriptase, gibt es DNA-Kontaminationen in der RNA.
      Hinweis: Für Proben für RNA-Seq (RNA-Sequenzierung mit Next Generation Sequencing Technologie) verwendet werden, ist der DNase-Schritt weniger kritisch. Insbesondere für Proben mit geringer RNA, die DNase-Schritt um nicht zu verlieren weggelassen werden könnte zu viel von der RNS in den Prozess.
2. DNase-behandelten RNA Verwendung viel RNA innerhalb des Bereichs angegeben in der kommerziellen cDNA Synthese Kit, aber in der Regel Verwendung mindestens 50 ng führen Sie cDNA Synthese.
3. Entwerfen Sie qPCR Primer so, dass sie auf Teile des Gens von Interesse, Glühen wo die Reihenfolge Identität zwischen den Individuen ist so hoch wie möglich, aber die Sequenz Identität zwischen gen Paralogs ist so gering wie möglich. Entnehmen Sie bitte die entsprechenden Publikationen für die spezifische Primer-Paare zur genexpressionsstudien von Na⁺/k⁺ ATPase³ und Aquaporine² (Abbildung 5).
   Hinweis: Zu diesem Zweck können RNA-Seq Sequenzdaten von Hunderten von Cyprids oder mehreren Erwachsenen verwendet werden.
4. Design-Primer für ein Gen für die Normalisierung der Ausdruck Ebenen (z.B. Aktin) verwendet werden. Die Primer Aktin erfolgreich eingesetzt werden, nach vorn: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3 ", und umgekehrt: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3".
   Hinweis: Aktin ist ein häufig verwendeter Kontrolle gen. Allerdings haben andere auch vorgeschlagen als Referenz und auf Seepocken¹⁹getestet. Neben Aktin wurde die Verwendung von RPL8, 36B4, EF1 und NADHd1 als Referenz getestet³. Es wurde festgestellt, dass es keine großen Unterschiede im Ausdruck der jeweiligen Referenz Gene zwischen Soma, Cirri, Erwachsenen oder Cyprids gibt.
5. Optimieren Sie die Anlasstemperatur für die gestalteten Primer durch Zugabe von cDNA (in der Regel im Bereich von 0,25 bis 50 ng) in zunehmendem Maße zu einer Mischung mit SYBR Green, dNTP, Polymerase und 0,3 µM vorwärts- und Grundierung.
6. Führen Sie qPCR Protokolle bei unterschiedlichen Temperaturen glühen wie folgt: eine erste Denaturierung Temperatur von 95 ° C für 3 min, Denaturierung Schritt bei 95 ° C für 20 s, Glühen Temperaturen von 55 – 63 ° C für 20 s und eine Dehnung bei 72 ° C für 30 s. Insgesamt 40 PCR-Zyklen laufen.
   Hinweis: Primer Wirkungsgrade im Bereich von 90-105 % liegen sollte und berechnet als E = (10^(-1/slope)-1) X 100 wo die Steigung die Steigung der Kurve erhält man ist, wenn den Log-Wert der cDNA Konzentrationen gegen ihren Zyklus-Schwellenwerte (Ct) zu plotten.
7. Durchführen Sie qPCR mit einer entsprechenden Menge an cDNA, in der Regel 1 – 10 ng, mit der PCR-Protokoll mit der optimalen Anlasstemperatur gefunden in Schritt 3 beschrieben.
   Hinweis: Der höhere Betrag von cDNA dient nur für Gene, die in äußerst geringen Mengen ausgedrückt werden.

Ergebnisse

Mit dem beschriebenen Verfahren für die Kultivierung von Erwachsenen Rankenfußkrebse von B. Improvisuskönnen bis zu vier Chargen der Nauplius Larven pro Woche hergestellt werden. Es wäre möglich, Nauplius-Larven sammeln fast jede Nacht, aber dies erfordert mehr Menschen und Infrastruktur (mit vielen Entenmuscheln in den Brutbeständen, eine Kultur wird release Larven ständig). Ein zusätzliche limitierender Faktor für die Larven Produktion scheint die Verfügbarkeit von Futter von hoher Qualität, insbesondere in Bezug auf die Diatomee Skeletonemasein. Maximal, bestehend Jede Charge aus dem Kultivierung System aus rund 12.000 Nauplien, so dass bis zu 50.000 Nauplien pro Woche kultiviert werden können. Jedoch einige Wochen möglicherweise bis zu Zehnfache weniger Larven produziert. Ein Erwachsener kann bis zu 7.000 Larven pro Tag¹⁴, produzieren, die bedeutet, dass 1 – 2 Erwachsene Larven für jede Partie freigeben. Innerhalb einer Woche werden etwa 70 – 90 % der gesammelten Nauplien in Cyprids (etwa 30.000 Cyprids pro Woche, maximal nachgeben) entwickeln, die Siedlung Assays und molekulare Studien verwendet werden können.

Es sollte betont werden, die es Varianten in Cyprid Funktionen zwischen den einzelnen Chargen gibt, und im Allgemeinen gibt es größere Unterschiede zwischen Chargen als in Chargen. Beispielsweise variiert der Einschwingzeit Erfolg in Siedlung Assays zwischen 30 und 70 % für verschiedene Chargen. Am ehesten ist dies durch die individuelle genetische Variation zwischen den spezifischen Paaren der Erwachsenen Freigabe Larven in den verschiedenen Probenahme Perioden verursacht. Empfohlen wird, natürlich, dass wiederholte Experimente (biologische Wiederholungen) Cyprids aus einer Anzahl von Batches umfassen sollte, wenn mehr allgemeine Aussagen über die Ergebnisse vorgenommen werden. Die Variation von Charge zu Charge stellt Anforderungen an die experimentelle Gesamtplanung, wo geeignete Kontrollen und Normierungen in genexpressionsstudien angewendet werden sollte. Aber auch nach mehreren statistischen Normalisierung Verfahren umgesetzt wurden erheblich reduziert, die zwischen Batch-Variation, einige Effekte des Stapels sind in der Regel noch deutlich (unveröffentlichte Daten).

Im Anschluss an das angegebene Protokoll ist es möglich zu erhalten, im Durchschnitt 500 ng hochwertige RNA von weniger als 20 Cyprids, unabhängig von der Phase der Barnacle Siedlung (Tabelle 1). Die Qualität der RNA wird normalerweise als das Verhältnis zwischen 18 und 28 s (die erwartete Position der beiden Gipfel sind in Abbildung 4angegeben) gemessen. Jedoch im Falle von Seepocken und viele andere Arthropoden, 28 s rRNA bricht zusammen, wenn Sie (als Bestandteil der Analysemethode) erhitzt und wandert zusammen mit den 18 Gipfel²⁰. Deshalb gibt es im Prinzip ein einziges rRNA Peak bei dieser Art der Auswertung für Seepocken. Es ergibt sich aus diesem Test (Abbildung 4), dass eine Homogenisierung von keramischen Perlen die RNA mit höchster Integrität bietet und daher die Methode der Wahl ist. Die RNA ist ausreichend in Menge und Qualität zu erzeugen qualitativ hochwertige Sequenzierung Bibliotheken für die Sequenzierung, was einem Durchschnitt von 70 Millionen Lesevorgänge pro Probe (die Anzahl der Lesevorgänge, hängt natürlich, auf der Ebene der Multiplexen während der Sequenzierung). Die RNA ist auch ausreichend für cDNA Synthese und qPCR Expressionsanalyse eine große Anzahl von Genen.

Abbildung 5 zeigt dem Ergebnis von qPCR Analysen der Aquaporine und Na⁺/k⁺ ATPase (NAK1) splice-Varianten, wo der Ausdruck Änderungen als Reaktion auf Veränderungen der Umwelt Hinweise^2,3untersucht wurden. Ein Vergleich der relativen Ausdruck des langen und kurzen splice Varianten von NAK1 zeigt ein zweifaches erhöhen für die lange NAK1-mRNA in niedrigen Salzgehalt in Bezug auf die kurzen NAK (Abb. 5A). So zeigen die Daten, dass alternatives Spleißen die Langform vorherrschenden niedrigen Salzgehalt Bedingungen macht. Im Falle der Aquaporine geht hervor, dass zwei Wasser-der Transport von Paralogs AQP1 und AQP2 differentielle Expression (Abb. 5B) angezeigt. Insbesondere im Mantel Gewebe ist es offensichtlich, dass die AQP1 deutlich nach unten auf niedrigere Salinität geregelt ist, gilt nicht für AQP2. Stattdessen zeigt AQP2 einen leicht erhöhten Ausdruck bei niedriger Salzgehalt, aber in der Soma. Diese Ergebnisse dienen als Grundlage für die Untersuchung der funktionalen Rollen der verschiedenen B. Improvisus Ionen-Transporter und Aquaporine in Barnacle Muskeltätigkeit.

Abbildung 1 : Überblick über die gesamte Kultivierung Verfahren und die RNA-Extraktion für genexpressionsstudien bei Erwachsenen. Um eine neue Kultur zu initiieren, sind Platten auf einem Rahmen befestigt und in das Meer in 1-3 m Tiefe eingesetzt. Nach mehreren Wochen sind die Paneele mit Erwachsenen/Jugendlichen in Gestellen in Schalen im Labor vertikal. Jedes Fach hält ca. 40 Tafeln mit Erwachsenen. Mit rund 100 Erwachsene pro Panel sind in insgesamt ≈ 4.000 Erwachsene Personen kultivierten pro Fach. Der Erwachsene Seepocken werden mit Artemia gefüttert und gehalten werden kann Jahr-rund um. Nauplius-Larven werden mehrmals pro Woche von den Schalen über eine Filterung durch ein Sieb aufgefangen. Die gesammelten Nauplien werden auf Eimer bei 26 ° C im Wasserbad gehalten und gefüttert, mit Mikroalgen übertragen. Nauplien werden gehalten, bis sie in nicht-Fütterung Cyprids, Häuten, die von Filtern gesammelt werden. Neue Platten können im Labor hergestellt werden, durch die Ansiedlung von Cyprids auf Tafeln, entweder um neue Panels für das Jahr zu bieten-rund um Kultur oder für spezifische Versuchsanordnungen mit veränderten äußeren Bedingungen verwendet werden. RNA wird dann von den Jugendlichen/Erwachsenen am Ende des Experiments oder zu bestimmten Zeitpunkten gewonnen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Bilder von einige wichtige Schritte in der Kultivierung Prozedur. (A) dieses Bild zeigt die Frames mit Paneelen für neue Populationen aus dem Feld zu sammeln. (B) zeigt dieses Bild die Paneele mit Erwachsene Seepocken von B. Improvisus in Racks, die in Schalen gelegt werden. Die Paneele sind ca. 2 cm voneinander entfernt platziert. (C) dieses Bild zeigt die Tabletts mit den Barnacle, Panels und die Fütterung Tank auf der linken Seite. Aus jedem Fach gibt es eine Steckdose wo die Siebe für die Sammlung der Nauplius-Larven platziert werden. (D) zeigt dieses Bild, dass die Produktion von Artemia für Erwachsene Seepocken zu ernähren. (E) zeigt dieses Bild die Aufzucht von Nauplien in Eimern gelegt in ein Wasserbad legen auf 26 ° C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Beschreibung der ersten Dissektion Schritte der Erwachsene Seepocken: den Körper aus der Schale entfernen. (A) Grab eines der Kiemendeckel Platten durch Einfügen einer Pinzette vorsichtig durch die Öffnung. Ziehen Sie vorsichtig, um die Platte zu entfernen und das Tier aussetzen. (B) ziehen Sie das Tier durch den Soma Teil direkt unterhalb der Cirri greifen. (C) dieser Bereich zeigt die allgemeine Anatomie der Eichel Seepocken. Mantel und potenziell befruchtete Eier (im Eierstock) bleiben in der Schale, wenn Körper herausgezogen wird. Ein Hinweis auf Barnacle Anatomie (für eine tiefer gehende Konto siehe Anderson)⁹: die Wandplatten von einem Barnacle Neigung nach innen, und zusammen bilden sie einen Vulkan-wie Kegel. Eine Öffnung der Blende fällt unter die beiden Kiemendeckel Platten bilden eine Tür oder ein Operculum, um die Blende zu schließen. Eichel Seepocken haben in der Regel eine kalkhaltige basale Platte, die fest auf das Substrat geklebt wird; Allerdings fehlen einige Arten von Seepocken diese kalkhaltigen Platte (z. B. S. Balanoides). Seepocken absondern, das Exoskelett aus dem dunkel pigmentierte Mantel (Carapax). Die äußere Oberfläche des Mantels doppellagig ist verkalkt, um steif, während die innere Oberfläche des Mantels nicht verkalkt und daher flexibel ist. Innerhalb der Blende sind die Cirri in einer zurückgezogenen Position vorhanden. Dies sind der thorakalen Anhängsel, die Rankenfußkrebse für Aussetzung Fütterung verwenden. Die Eierstöcke befinden sich in der Nähe der Basis der Barnacle, während die Hoden in der Soma liegen. Diese Zahl wurde von Panova Et Al. übernommen ²¹ und wurde mit freundlicher Genehmigung von Springer veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Bestimmung der rRNA Integrität durch Kapillare Gelelektrophorese. RNA wurde von zwei verschiedenen Homogenisierung Methoden vorbereitet: Ultraschall (A) und (B) Keramik Perlen. Die Einheit auf der y-Achse, FU, steht für Fluoreszenz-Einheiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Genexpression ergibt sich aus zwei verschiedenen Studien von Genen, die wichtig für die Muskeltätigkeit in B. Improvisus. (A) dieses Panel zeigt die differentielle Expression gemessen am qPCR Splice-Varianten des Na⁺/⁺ ATPase NAK1 als Reaktion auf verschiedene Salzgehalte und pCO₂ k³Ebenen. Bei der Behandlung von niedrigen Salzgehalt, Ausdruck der langen Isoform (NAK1-L) steigt im Verhältnis zu den kurzen (ANOVA, P < 0,001). (B) dieses Panel zeigt den Ausdruck der Aquaporine bei Erwachsenen von B. Improvisus während ihrer Exposition gegenüber verschiedenen Salzgehalte². qPCR wurde verwendet, um die Aquaporin Ausdruck Ebenen relativ Aktin bestimmen. Erwachsene Personen waren bei 3 verschiedenen Salzgehalte (3, 20 und 33 PSU) für 14 Tage inkubiert. Für die RNA-Vorbereitung wurden der Soma, Cirri und Mantel der Erwachsenen getrennt. In beiden Abbildungen zeigen Fehlerbalken die Standardabweichung. Die ** und *** zeigen das Signifikanzniveau (ANOVA), 0,01 und 0,001, beziehungsweise. Diese Zahlen wurden von Lind Et Al. modifiziert ^{2 , 3}. beide Figuren sind mit freundlicher Genehmigung von PLoS ONE veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Siedlungsphase	Gesamtbetrag der RNA (ng)
Freies Schwimmen	512
Exploration: Enge Suche	518
Beigefügten cyprid	550
Neu verwandelt juvenile	832

Tabelle 1: Renditen von RNS. Diese Tabelle zeigt die RNA-Menge mit einer RNA-vorbereitungssatz von Pools von 20 Cyprid Individuen gesammelt in den verschiedenen Phasen bei der Abrechnung extrahiert.

Diskussion

Die Barnacle Kultur Tjärnö Marine Research Laboratory (Schweden) läuft seit über 20 Jahren und ist für Studien in vielen verschiedenen Forschungsbereichen verwendet worden. Über 30 wissenschaftliche Abhandlungen erschienen, die die Kultivierung System in den letzten Jahren, einschließlich Studien in Antifouling^13,22, Hydrodynamik²³, chemische Ökologie²⁴genutzt haben, den Klimawandel¹⁶ , Evolutionsbiologie⁵und Molekularbiologie².

Um die Auswahl bestimmter Individuen zu vermeiden, die eignen sich mehr für die Laborumgebung (Einzelpersonen, die möglicherweise nicht repräsentativ für die wilde Bevölkerung), empfiehlt es sich, jedes Jahr eine neue Brutbeständen aus dem Bereich zu sammeln. Darüber hinaus ist es auch ratsam, die Kultur jährlich zu verjüngen, da gibt es etwa 50-80 % der Sterblichkeit bei Erwachsenen in einem normalen Jahr. Jedoch ist das Ziel, Inzuchtlinien zu produzieren oder zum Studium der experimentellen Entwicklung einrichten, sollen nur Labor aufgezogen Familien verwendet werden.

Eine gute Zeit, B. Improvisus auf Tafeln am Tjärnö Marine Research Laboratory zu sammeln ist im Juni / August, weil zu diesem Zeitpunkt eine gute Versorgung mit Cyprid Larven im Meer ist. Überprüfen Sie die Platten wöchentlich zu sehen, wann die Barnacle Siedlung beginnt und andere manuell entfernen ließ sich Arten als B. Improvisus (z. B.Muscheln, Manteltieren, Bryozoen, Hydrozoen, Nemerteans/Röhrenwürmern und andere Barnacle Arten) von der Platten (z.B.mit einer Zahnbürste). Rund um Tjärnö gibt es drei Flachwasser-Barnacle Artenvielfalt (B. Improvisus, Semibalanus Balanoidesund Balanus Crenatus). B. Improvisus ist jedoch die dominierende fouler von glatten harten Oberflächen im Juli-August. S. Balanoides hat seine Abrechnungsperiode im frühen Frühling und bevorzugt vor allem natürliche Substrate (z.B. Steinen). B. Crenatus können zu niedrigen Zahlen auf den Tafeln im Sommer auftreten.

Es ist auch möglich, neue Generationen von Erwachsenen Barnacle zu starten, von kultivierten Cyprids, die wäre wichtig, wenn bestimmte Gruppen mit spezifischen Eigenschaften festgelegt wurden, oder im Studium der experimentellen Entwicklung. Der bequemste Weg, um neue Generationen von Erwachsenen zu starten ist, Cyprids auf thermoplastische Platten im Labor zu vereinbaren. Diese Platten mit neu besiedelten Cyprids könnte auch in experimentelle Behandlungen oder für die Exposition im Feld verwendet werden. In Notfällen kann man auch verwenden wo B. Improvisus üblich Erwachsene auf Felsbrocken aus einem nahe gelegenen Standort (z.B.Idefjord bei Tjärnö Marine Research Laboratory). Diese bereits etablierten Erwachsenen behandelt genauso wie die Erwachsenen auf die Platten, so in Schalen gelegt und über die Durchfluss-System eingespeist. Durchflusszellen können auch Platten mit Seepocken²⁵herstellen verwendet werden. Dies sind durchströmten Kammern mit Plankton net an den Seiten, auf denen die Cyprids mit Platten als die einzige Siedlung Oberfläche für die Larven nicht begleichen zu tun.

Es gibt mehrere Schritte, die für eine langfristig funktionierende Barnacle Kultur einschließlich Lebensabschnitte Einrichten von entscheidender Bedeutung sind. Die Methoden zur Kultur B. Improvisus sind wahrscheinlich, zu einem großen Teil auch auf anderen Wirbellosen Meerestieren mit freischwimmenden, Planktotrophic Larven anwendbar. Kultivierung Verfahren für einige Arten bereits gut sind beschrieben (z.B.für Miesmuscheln und verschiedene Arten von Austern)²⁶, während für andere Wirbellose sind nur wenige Beispiele für langfristige Kulturen über ihr ganzes Leben Zyklus. Einer der ersten erfolgreichen Versuche Kultur Entenmuscheln (B. Amphitrite) erfolgte durch Rittschof Et al. ¹⁵. langfristige finanzielle und personelle Ressourcen sollten vor der Prüfung der Einrichtung einer Barnacle Kultivierung Anlage vorhanden sein. Die Wartung dieser Art des Jahres-rund um Barnacle Kultur erfordert mindestens eine Person halbe Arbeitszeit. Möglicherweise gibt es ein Potential für die zukünftige Automatisierung der einige Schritte in der Produktion, vor allem die Kultivierung von Mikroalgen²⁷. Um erfolgreich zu sein, gilt es darüber hinaus Zugriff auf große Mengen an qualitativ hochwertigen Meerwasser haben. Die Kultivierung von Mikroalgen, Artemia, und Seepocken beinhaltet besonderen Sicherheitsvorkehrungen. Tests von einigen Antifouling Substanzen oder giftige Chemikalien benötigen jedoch besondere Vorsichtsmaßnahmen.

Die Platten wurden mehrmals wöchentlich für Verunreinigungen überprüft. Das Meerwasser in die Kultur verwendet wurde aus 40 m Tiefe im Koster Fjord außerhalb des Tjärnö Marine Research Laboratory hochgepumpt und wurde durch zwei Sand-Filter vor dem Eintritt in die Labor-Wasser-System übergeben. Wenn keine Filterung des Wassers getan hätte, gäbe es viel mehr Verunreinigungen in der Kultur. Es ist wichtig, regelmäßig zu reinigen die Paneele in der Kultur von Detritus und andere Wirbellose (z.B.Ausläufer-Gebäude Hydrozoen und räuberische Nemerteans), die das System durch die Zufuhr von Meerwasser aus dem Feld eingeben. Z. B. wenn keine Larven, trotz produziert werden der Tatsache, dass die Kultur wohlgenährt und auch sonst wurde scheint in gutem Zustand, das Problem könnte sein, das Vorhandensein von Nemerteans, die scheinbar Paarung hemmen. Natürlich, viele der kontaminierenden Organismen in der Kultur der Tjärnö Marine Research Laboratory waren spezifisch für die Schwedische Westküste, und andere Arten von Organismen verunreinigt werden weit verbreitet und werden eine größere Herausforderung in anderen geografischen Gebieten. An der Westküste von Schweden ist es ungewöhnlich, dass Verunreinigungen durch andere Barnacle Arten auf den Tafeln finden. Gelegentlich, die Einrichtung von S. Balanoides gefunden wurde, aber dies ist eine sehr marginale Problem (allenfalls ein S. Balanoides Verunreinigung für 10.000 B. Improvisus Proben). Der Mangel an Verunreinigung Arten wurde wahrscheinlich abhängig von dem Regime, neue Kulturen zu etablieren, während des Sommers, wenn Larvaefrom B. Improvisus waren sehr dominant. Darüber hinaus gab es auch eine klare Bereicherung von B. Improvisus auf den Tafeln, da diese Spezies selektiv für glatte Oberflächen¹³ist.

Es ist wichtig, Tote Erwachsene Seepocken zu entfernen. Die leeren Schalen auf den Tafeln übrig sind, können sie einen Unterschlupf für Artemia Nauplien als auch für verschiedene Verunreinigungen werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Tote Personen Einfluss auf das Wohlbefinden der benachbarten Einzelpersonen, wahrscheinlich mit der Freisetzung von toxischen Verbindungen während der Zersetzung. Eine weitere Konsequenz der erwachsenensterblichkeit ist, dass einige Individuen allein zu weit weg gelassen werden und werden von anderen Erwachsenen zur Paarung erlauben (obwohl Seepocken den längsten Penis in der Tierwelt im Verhältnis zur Größe haben)²⁸. Diese Personen werden überleben, aber sind nicht produktiv für die Larven. Jedoch diese einsamen erwachsenen Individuen sanft ohne Schädigung der Bodenplatte entfernt werden und horizontal platziert werden, in der Nähe von anderen Paarung zu ermöglichen. Seepocken können auch gedeckt werden, indem Sie Platten mit einem Erwachsenen auf jeder aber nahe genug, so dass gegenseitige Befruchtung auftreten kann. Auf diese Weise können genetische Linien produzierten¹⁴sein.

Es ist wichtig, einen Feed von hoher Qualität zu produzieren und zu Kulturen fast jeden Tag ernähren. Noch ein paar Tage ohne Nahrung führt zu einer abnehmenden Freisetzung von Larven. Vorangegangenen Tests Ernährung Zusammensetzung haben gezeigt, dass Kieselalgen essentiell für das Wachstum und Überleben der Barnacle Nauplien sind. Mehreren Diatomee Arten scheinen als angemessen zu ernähren, obwohl kleine oder einsame Zellen (weniger als 10 µm im Durchmesser) für die Nauplien Einnahme erforderlich sind. Die Art S. Marinoi, C. Simplexund T. Pseudonana haben alle erwiesen sich als ausreichend Futter für B. Improvisus Nauplien, sowie leicht zu kultivieren. Darüber hinaus ist die Futterqualität für exponentiell wachsenden Algen in der Regel höher. Es wurde auch berichtet, dass Kieselalgen für des produktiven Kulturen von B. Amphitrite¹⁵unerlässlich sind. Eine Theorie der Bedeutung der Diatomeen ist, dass sie eine einzigartige Fettsäureprofil und sind besonders reich an 20:5 hoch ungesättigten Fettsäure-²⁹. Es hat gezeigt, dass bereits bestimmte Fettsäuren sind wichtig für die erfolgreiche Entwicklung der Auster Larven³⁰.

Im Laufe der Jahre wurden keine Fälle von schädlichen Krankheiten in der Barnacle Kultur. In vielen kommerziellen Wirbellosen Aquakulturen, wie Austern und Muscheln Krankheiten sind recht häufig und können sehr schädlich sein. Schädliche Auswirkungen von Viren haben auch aus Wildpopulationen gemeldet. Die gebürtige Auster in Frankreich wurde ersetzt durch die portugiesische Auster Crassostrea Angulata 1925, aber diese Spezies wurde durch ein Iridovirus um 1970³¹ausgelöscht. Vor kurzem gab es massive Sterblichkeit Ereignisse in die Pazifische Auster Crassostrea Gigas in Kulturen weltweit erscheinenden Ostreid Herpesvirus 1³²zugeordnet werden soll. Keine Berichte über Krankheitserreger, Bakterien oder Viren auf Seepocken sind bisher erschienen. Jedoch im laufenden Genom-Projekt auf B. Improvisus, Virus-Sequenzen wurden gefunden (Alm Rosenblad Et Al., unveröffentlichte Daten) aber keine offensichtliche Verbindung zu Symptome von Krankheiten. Mischungen von Antibiotika wurden zuvor auf die Kulturen zur Minimierung des Risikos von bakteriellen Infektionen angewendet; Allerdings wird dieses Verfahren derzeit aufgegeben und so weit, hat dies keinerlei Verunreinigungsprobleme verursacht.

Wenn Meerwasser erhitzt wird (wie oben beschrieben), möglicherweise eine Überhitzung das größte Risiko in der Kultur-Fertigungslinie. Es ist natürlich schwierig zum Schutz gegen Überhitzung, obgleich Sensoren und geeignete Alarmsysteme verwendet (z. B.Senden von e-Mail- oder SMS-Nachrichten an Verantwortlichen) sein können. Vorfälle dieser Art in der Vergangenheit führten zu erheblichen Tötung von Erwachsenen in der Kultur. Dies kann natürlich verheerend sein und langfristige Investitionen an Zeit und Geld zu ruinieren. Insbesondere wäre katastrophal, wenn genetische Inzuchtlinien eingerichtet wurden. Um die Langlebigkeit der solche Linien und vor Datenverlust zu sichern, wäre entwickeln eine Kryokonservierung Methodik für Seepocken wünschenswert. Es wurde berichtet, dass die Larven von der pazifischen Auster können sich eingefroren und mit Teilerfolg³³wiederbelebt. Kryobank wurde auch ein wertvolles Instrument zur Erhaltung der genetischen Ressourcen von den unterschiedlichsten Arten³⁴. Auch Nauplien von B. Amphitrite werden berichtet, um Einfrieren³⁵zu überleben, und ergab, dass 20 % der Personen eingefroren-Down erfolgreich in Cyprids³⁶verwandelt. Einfrieren für die langfristige Tragfähigkeit der Kulturen Anwendung bisher nicht angenommen worden, aber dies wäre in der Tat für die Aufrechterhaltung der ausgewählten Linien notwendig; Dies wäre ein wesentlicher Schritt, B. Improvisus in eine starke marine Modelsystem fest zu etablieren.

Hier wurde ein Protokoll für die Zerlegung von verschiedenen Geweben von Erwachsenen von B. Improvisus (d.h., Cirri, Soma und Kaminsims) vorgestellt. Allerdings sollte betont werden, dass auch andere Gewebe extrahiert werden können. Zum Beispiel das weiche Gewebe zwischen den äußeren und inneren Mantel der Gattung häutigen-Base Tetraclita Japonica Formosana sorgfältig isoliert und für eine RNA-Extraktion und Analyse der RNA-Seq Gen Ausdruck³⁷verwendet. Die skizzierten optimierte Extraktion Protokoll hier beschriebenen bietet ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA für die Sequenzierung von eine minimale Menge des Ausgangsmaterials. Zunächst minimiert die Auflistung der einzelnen Larven direkt in die Homogenisierung Rohre Verluste während der Übertragung von einem Gefäß in ein anderes. Darüber hinaus gehört zu die verschiedenen Methoden getestet, die Homogenisierung mit keramischen Perlen erwies sich die effizienteste in Bezug auf RNA ergeben und Integrität, im Vergleich zu beschallen oder Stößel Homogenisierung. Bei der Planung für gen-Expression oder Genomik Experimente muss man im Hinterkopf die Herausforderung der hohen genetischen Variation in Seepocken, zumindest für B. Improvisusbehalten. Barnacle hat eine genetische Vielfalt im Bereich von 3 – 5 %, auch bei der Codierung Regionen (Alm Rosenblad Et Al., unveröffentlichte Daten). Das, natürlich stellt spezifische Anforderungen an das Design der Zündkapseln für qPCR Analyse, wo mehr erhalten sollten Regionen identifiziert und als Vorlagen für Primer eingesetzt, um konsistente Ausdruck Ergebnisse Betweenbatches bekommen. Konservierte Regionen für Zielgene, wie Aquaporine und Na + / K +-ATPasen, durch das Studium der Sequenz Variabilität dieser Gene in RNA-Seq Daten aus Populationen von Cyprids mit Hunderten von Personen identifiziert werden können. Für eine Genomanalyse wird DNA entnommen werden. Allerdings kann erhalten qualitativ hochwertige DNA von B. Improvisus ²¹Herausforderung darstellen.

Abschließend erweist die etablierten Barnacle Kultur sich maßgeblich an verschiedene Arten von experimentellen Studien. Vor allem All-Jahr-um Larven Produktion ermöglicht es uns, Experimente durchzuführen, ohne darauf beschränkt zu den natürlich vorkommenden Laichzeit (für B. Improvisus, dies ist in den Sommermonaten). Erhaltenen Larven können verwendet werden, um eine breite Reihe von experimentellen Studien, einschließlich Siedlung Assays, Verhalten-Assays, Ausdruck Studien über bestimmte Gene sowie Transkriptom genomweite Studien durchzuführen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels	Plastic produkter, Bromma, Sweden		transparent glas
1.5-L PET bottle
Artemia	INVE Aquaculture, Belgium		We have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)	CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland	strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)	CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland	strain 1085/3
Millipore cartridge filter system	Millipore
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm	Millipore	cartridge CWSS01S03	High capacity for large volumes
polycarbonate bottle	Nalgene		autoclavable
RNA later	Qiagen	76106	Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free Kit	Invitrogen/Thermofisher Scientific	AM1907	DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708890	cDNA synthesis kit
SYBR Green supermix	Biorad	1708880	Dye for QPCR
RNeasy minikit	Qiagen	74104	RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes	Precellys	KT03961-1-003.2	Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kit	Qiagen	74004	RNA extraction of few cyprids