זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים

Summary

שברת את improvisus Balanus (Amphibalanus) היא דוגמנית ללמוד osmoregulation ו- antifouling. עם זאת, ההשרצה עונתיים טבעי מניב אטומטי בלתי צפוי של הזחלים cyprid. כאן, עבור culturing בכל ימות השנה של improvisus דרב פרוטוקול המתואר, כולל הייצור של הזחלים. השימוש של ספחות בתרבית במחקרים ביטוי גנים מודגם.

Abstract

ספחות הם סרטנים ימיים עם מבוגר sessile free-swimming, פלנקטוניים הזחלים. הכינוי Balanus (Amphibalanus) improvisus היא רלוונטית במיוחד כמודל עבור הלימודים של מנגנונים osmoregulatory שלה עמידות קיצוניים בפני מליחות נמוכה. הוא גם משמש כמודל ליישוב בביולוגיה, במיוחד ביחס antifouling מחקר. עם זאת, ההשרצה עונתיים טבעי מניב אטומטי בלתי צפוי של הזחלים cyprid ללימודים. פרוטוקול culturing בכל ימות השנה של improvisus דרב פותחה, תיאור מפורט של כל השלבים בתוך פס הייצור המותווה (כלומר, הממסד של תרבויות למבוגרים על לוחות, האוסף שלומות זיפרגליים הזחלים, הממשל של מזון עבור בוגרים וזחלים). התיאור מכיל הנחיות על פתרון בעיות ודן גם פרמטרים קריטיים (למשל, ההסרה של זיהום, הייצור של מזון באיכות גבוהה, את כוח האדם הדרוש, ואת החשיבות של מי ים באיכות גבוהה). כל אצווה ממערכת culturing מקסימאלית התשואות בערך 12,000 הדברים, יכול לספק לארבע אצוות בעוד שבוע, אז עד כמעט 50,000 רימות בשבוע יכול להיות מיוצר. השיטה המשמשת התרבות דרב improvisus הוא, כנראה, חלים גם על אחרים חסרי חוליות ימיים עם swimminglarvae חינם במידה רבה. פרוטוקולים מוצגים רוברט של רקמות שונות מבוגרים, כמו גם הייצור של RNA באיכות גבוהה עבור מחקרים על ביטוי גנים. הוא גם תיאר איך בתרבית מבוגרים, cyprids גדלו יכול להיות מנוצל במגוון רחב של עיצובים ניסיוני לבחינת ביטוי גנים ביחס גורמים חיצוניים. השימוש של ספחות בתרבית בביטוי הגנים מלווה באיורים מחקרים של תפקידים osmoregulatory אפשרי של Na⁺/K⁺ ATPase, aquaporins.

Introduction

ספחות הם סרטנים ימיים עם מבוגר sessile free-swimming, פלנקטוניים הזחלים. רוב המינים 1,200 של ספחות המאכלסים במים רדודים, רבים נחשפים לעיתים קרובות מליחות נמוכה. מין אחד, ספחת המפרץ נורא Balanus (Amphibalanus) (נולד ב- improvisus), יכול לסבול כמעט מים מתוקים, צ'ארלס דרווין תיאר זן זה של נחל קטן בשפך של ריו דה לה פלטה אורוגוואי¹. המליחות tolow סובלנות קיצוני הופך improvisus דרב מודל רלוונטיים במיוחד עבור הלימודים של מנגנונים osmoregulatory^2,3. זיפרגליים הזה מעדיף תנאים מליחים אבל מסוגלת לחיות במים עם salinities של כח בסביבות 1.6 ל גבוה כמו כח 40⁴. זה המין היחיד ספחת שנמצאו בים הבלטי מליחים. Improvisus ב' מאמינים שמקורם בחוף המזרחי של יבשת אמריקה אך היום נמצא ברחבי העולם עקב פיזור על ידי משלוח⁵. זה הוא יצור fouling הגדולות, נפוץ על סלעים, המזחים הסירה קליפות, ולכן הוא עניין כללי להבנת המנגנונים של ביופילמים על מבנים ימיים, מליחים מים^6,7.

בדומה לרוב ספחות אחרים, improvisus דרב הוא אנדרוגיניות עם הפרייה; רבייה מתרחשת באמצעות הזדווגות בין יחידים שכנות באמצעות של הפין מוארך, הפריה פנימית. תקופת הרבייה היא בעיקר ממאי עד ספטמבר. Improvisus דרב יש שבעה שלבים זחל פלאגי (6 הדברים ואחריו cyprid אחד שלב⁸). הפתחים הביצית המופרית אל זחל nauplius free-swimming ואינה ניזונה עמודת המים עבור עד מספר שבועות לפני משיר אל זחל cyprid שאינם האכלה. Cyprid משתמשת מספר רמזים כדי למצוא אתר מתאים להתיישב, ואז עובר מטמורפוזה לתוך ספחת לנוער sessile⁹. המין יכול להיות בתרבית במעבדה, יש תוחלת חיים של 1 – 2 שנים בים (2 – 3 שנים בתרבות מעבדה). בממוצע, נולד ב- improvisus גדל עד 10 מ מ קוטר (עם מספר מרבי של 20 מ מ), מגיע לגובה מרבי של-6 מ מ (למרות שזה יכול לגדול גבוה בתנאים צפופים). המין יכול להיות מזוהה על ידי חלקה גירני אפילו קונכייתו (לבן או אפרפר), הבסיס גירני בדוגמת בצורה רדיאלית של צלחת מעטפת, צורת לוחות tergal^1,10.

שברת את improvisus נולד ב- כולל מספר תכונות יתרון כמודל עבור מחקרים של osmoregulation, עם דגש על מנגנונים פיזיולוגיים המולקולריים וכן אינטראקציות אקולוגי והשלכות אבולוציונית. הוא גם משמש כמודל עבור החקירות ליישב בביולוגיה, במיוחד ביחס antifouling ומחקר של המנגנונים המעורבים^7,11,12,13. עם זאת, ההשרצה עונתיים טבעי מניב אטומטי בלתי צפוי של הזחלים cyprid ללימודים. היכולת תרבות זו ספחת דרך מחזור החיים שלו כל כל השנה היא, לכן, נכס גדול כדי לאפשר סוגים שונים של מחקרים מכניסטית המולקולריים. בנוסף, נוכחותו במים מליחים/ים ברחבי העולם מאפשר שילוב של שדה ומחקרים ניסיוני. גידול מבוקר גם להפיק משפחות של שושלות יוחסין ידוע culturing לטווח ארוך¹⁴, זמן דור של כמה חודשים עשויה לאפשר התפתחות ניסיוני לטווח ארוך. שם זמין גם הגנום טיוטה, transcriptomes מספר, המשאבים הללו שימשו עבור השיבוט של גנים (למשל, גנים חשיבות osmoregulation) מספר^2,3.

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להקים ולתחזק תרבות של הכינוי נולד ב- improvisus לאורך כל השנה על מנת לבצע מחקרים ביטוי הגן על מבוגרים או הזחלים של האורגניזם. . Rittschof et al. ¹⁵ מתוארות בקצרה שיטה culturing ספחות מן המהדורה של הדברים להתנחלות של cyprids עבור המין אמפיטריטה Balanus. הפרוטוקול היה מותאם culturing בכל ימות השנה של improvisus דרב -מעבדת המחקר הימי Tjärnö (שוודיה), תיאור מפורט של כל השלבים בתוך פס הייצור המותווה, כולל את הייצור והגידול של ספחת הזחלים, כמו גם הממשל של הזנה הזחלים ולמבוגרים. לקבלת סקירה כללית של ההליך מלאה, ראה איור 1. השימוש במערכת culturing ביטוי עם קצת קופצים ניסיוני משותף, מאויר במחקרים גנומיקה תפקודית של Na⁺/K⁺ ATPase, aquaporins, שחקרתי שלהם פונקציות אפשריות osmoregulation^{2, 3}. זה לפעמים חיוני כדי לבחון את ביטוי גנים ספציפיים ברקמות, כמה עקרונות הבסיסיים של ספחת ביתור יהיה מכוסה. אספקה טובה של מי ים באיכות גבוהה, culturing ה"בארנקל improvisus דרב, שעשוי להיות מינים נוספים רבים, צריך להיות אפשרי במעבדות ימית ברחבי העולם.

Protocol

1. אוסף של ספחות למבוגרים בשטח כדי להתחיל עם Broodstock החדש

1. פריסת לוחות שקופים תרמופלסטיים (פולי-חומצתי) (110 x 110 x 1.5 מ מ³) ≈ שקטים בתוך 1-3 מ' עומק כדי לאסוף ספחות למבוגרים מהשדה. משתמשים במסגרות שיכול לקחת מספר פאנלים (איור 2א), לקדוח 2 חורים (בקוטר של 6 מ מ) בפינות העליונה של כל לוח, attachthepanelstotherackusingcableties. לפיכך, thepanelswillhangverticallyin המים.
   1. מתי ההתיישבות של ספחות אירעה (שזוהה כנקודות קשיח קטן לבן על הפאנלים), להשאיר הלוחות לפחות 2-3 שבועות לוודא ספחות גדול מספיק (5 מ מ) להעביר למעבדה ללא הגעה יבש או פגום.
2. להביא את הלוחות לתוך המעבדה כאשר הם מכוסים התיישבו improvisus דרב אשר הגיעו בגודל של ca. indiameter 5 מ מ.
   הערה: הפעם למבוגרים לפתח 5 מ מ בשדה זה תלויים במידה רבה הזמינות של מזון, הטמפרטורה. בדרך כלל זה לוקח כשלושה שבועות במעבדת המחקר הימי Tjärnö (58.87 ° N, 11.14 ° E). הנפוץ ביותר לוחות broodstock החדש בדרך כלל הפרוסות בסוף יוני, שנאספו בסוף אוגוסט.
3. לפני החדרת הלוחות אל המתקן תרבות, לנקות אורגניזמים אחרים בין הפאנלים. חשוב ביותר להסיר מינים אחרים ספחת. אנא שימו לב כי חשוב לנקות לעיתים קרובות הלוחות כדי להיפטר מזהמות מינים במהלך הטיפוח, מאז זה יהיה להגדיל באופן משמעותי את סיכויי ההישרדות של broodstock.
4. במקום הלוחות אנכית על הקצה בדוכן עם חריצים וטוחנים מגש פוליאתילן (400 x 400 x 20 מ מ³) (דמויות 2C ו 2E). החריצים דוכן העדים הם 15 מ מ אחד מהשני.
5. לשם הכנת המגשים, להפוך יציאת הכניסה בבסיס ויציאת יציאה בחלק העליון בצד הנגדי בכל מגש. לחבר את יציאת הכניסה של כל מגש 100 L מאגר המכיל כ 30 לליטר מים עם מעין שקע בחופו של מי ים פתוח ב- 20 ° C כדי לאפשר זרימה דרך בקצב של ca. L 2 לכל מין.
   הערה: עד 8 מגשי היו מחוברים 100 L מאגר יחיד.
6. להתחבר למאגר 100 L ים מבוקרי טמפרטורה (20 ° C) (למשל, המסופקים על ידי משאבת חום החלפת חום מן המים נכנסות).
   הערה: הכינוי improvisus דרב יכול גדלים ומתרבים ב מליחות מלא ימית (30 – 35 psu); עם זאת, להפחתת המליחות ל ca. ספק כח 25 על-ידי הוספת מים מתוקים למאגר המים 100 L מגביר את הפלט של הזחלים מתרבות.

2. החל את הדור החדש של מבוגרים מ Cyprids בתרבית

1. לבנות קוביות של לוחות תרמופלסטיים פתוח בחלק העליון על ידי הקלטה 5 פאנלים יחד באמצעות קלטת רעיל, עמיד במים.
2. הכנס את הקוביה מגש קטן (במקרה של דליפה) ולמלא אותו במי ים (25 psu). מאחסנים את המים בטמפרטורת החדר (ca-20 ° C). להוסיף בערך 200 cyprids בחלק העליון של הקוביה.
3. להאכיל את נוער עם 100 מ של Skeletonema marinoi בכל יום אחר (ראה שלב 5) בעוד בקוביה.
   הערה: ספחות לנוער יכולים להיות קשיים עם בליעת Artemia סאלינה (ראה שלב 3) מכיוון שהן גדול ומכאן שקשה לבלוע במשך ספחת שיוחסו לאחרונה.
4. להחליף את המים 1 x בשבוע.
5. לאחר 2 שבועות, כאשר הלוחות מכילים קטינים מספיק ותיקה לפחות 5 מ מ קוטר, לפרק את הקוביה להעביר את הלוחות עם קטינים המגשים עם זרימה-throughseawater ו, לאחר מכן, להאכיל את ספחות עם הדברים salina א .

3. תרבות של הדברים סאלינה Artemia כמו מזון עבור ספחות למבוגרים

1. להגדיר מערכת culturing עבור salina א באמצעות בקבוק פלסטיק 1.5 ליטר bottomis חתך ואיפה הבקבוק ימוקם הפוך בעמדה, מאוירים מן הצד. להתאים את צוואר הבקבוק צינור סיליקון עם מלחציים ולחבר אותו משאבת לערבב (איור 2D).
2. על מנת בוקעות הביצים, להוסיף כ-15 מיליליטר יבש ביצים מנוחתו של Artemia ofseawater 1 ליטר.
   הערה: Artemia ביצים הפתח לזחלים nauplius לאחר 24-48 שעות. לעכב את הבקיעה של הדברים salina א (למשל, בסופי שבוע), האור ניתן לבטל כדי להפחית את הטמפרטורה מעט.
3. הקציר Artemia הדברים, לבטל את לערבב, להכהות את החלק העליון של הבקבוק עם רדיד אלומיניום (או דומה למשל, פחית). מאירים שהחלק התחתון של הבקבוק במשך 10 דקות Hatched Artemia הדברים לשחות לכיוון האור. ציסטות סס שאינם ישקעו לתחתית, ציסטה פגזים יצוף על פני השטח.
4. פתח את המלחציים בתחתית. לאסוף את השבר ביניים ככל אוכלוסיה צפופה של הדברים שחייה.
   הערה: כל יום (למעט בסופי שבוע), 1 ליטר של ההשעיה הדברים Artemia צפופה באופן ידני נוסף למאגר 100 L התחברות המגשים עם ספחות למבוגרים. הימנע כל האכלה עם ציסטה ריק פגזים, מאז הם לא לספק תזונה, בעיקר לגרום צורך לנקות את התרבות במרווחים תכופים יותר.

4. אוסף והגידול של הזחלים זיפרגליים

1. לנקות את הלוחות עם ספחות למבוגרים בהתזה אותם בעדינות עם מים מתוקים, במידת הצורך, הסר כל עכירות ספחת פגזים, לוחות באמצעות מברשת שיניים רכה. כמו כן, לנקות את המגשים (ללא ספחות) ואת צינורות חם (75 ° C) מים מתוקים.
2. מניחים מסננת של 90 מיקרומטר פלנקטון-רשת מודבקים לסוף צינור PVC לחתוך (16 ס"מ בקוטר 15 ס מ גובה) לתוך מגש פוליאתילן (30 x 20 x 10 ס מ³) עם יציאת גלישה. לאסוף את הזחלים improvisus דרב בתוך המסננת למשך הלילה (איור 2C).
   הערה: המסננת הוצב מתחת היציאה של המגש של הלוחות ספחת כדי לקבל את המים outflowing וכדי לסנן את הדברים. הזחלים נותרו המסננת בזמן ממי הים גלש במגש קטן. מגש קטן זה הבטיחו כי המסננת מעולם לא driedout.
3. הניחו דלי 30 L באמבט מים גדולה שבה הטמפרטורה נשמר בטמפרטורה 26 ° C באמצעות אקווריום דגים טנק תנורים (איור 2E). לערבב ועצבנות מובטח על ידי אוויר-מבעבעים דרך המערכת.
4. למלא את הדלי עם 20 רמות של מי ים מסונן (0.2 µm; כח 25). להוסיף 1 ליטר הדלי של שילוב 60-40 של microalgae צורניות 2, ס marinoi ו ג העדין (ראה שלב 5). זה ייתן של צפיפות הראשונית של בערך 5 x 10 diatoms⁴ לכל mL בדלי.
   הערה: ספחת הדברים הזחלים הם phototactic באופן חיובי. הדליים היה עשוי מפלסטיק לבן אטום בשלמותם המאפשרים דרך קצת אור. במהלך החורף, החדר היה מואר בשעות היום (8:00-17:00), אך כהה במהלך הלילה. במהלך הקיץ, האור החיצוני נכנסו לחדר במהלך רוב היום.
5. להעביר את שנאספו improvisus דרב הדברים כדי תבשיל crystallizing (300 מ ל; 90 מ מ בקוטר 50 מ מ גובה).
6. להאיר את המאכל מן הצד, אשר ימשוך את הזחלים למקור אור. לאסוף את הדברים ספחת האוספת את האור הנכנס עם פיפטה להעביר אותם ל תבשיל crystallizing אחר. הסר כל הזחלים Artemia הנותרים.
7. להעביר את הזחלים הדברים improvisus נולד ב- גביע עם 1 ליטר של מי ים מסונן.
8. לספור את מספר הדברים על ידי ערבוב כשהספל בעדינות כדי לקבל על השעיית הזחלים אפילו ולאחר מכן לוקחים את חמש דוגמאות 1 מ"ל ממקומות שונים במיכל. להעביר כל מדגם microplate עבור בדיקה חזותית עם stereomicroscope. לספור את מספר הדברים בכל אחת הדגימות חמש ולהוסיף אותם.
9. הכפילו את המספר שנספרו ב- 200 (1,000 מ של 5 מ"ל) כדי להעריך כמה אלפי הזחלים הם במיכל שלם. אם יש יותר מדי הזחלים nauplius הספל, לדלל את הדגימה עד הצפיפות היא לכל היותר 14,000 הזחלים/L (בדרך כלל בטווח של 11,000 – 12,000 הזחלים/L).
10. להוסיף 1 ליטר של הדברים improvisus דרב דלי אחד, ובכך מוסיף כ- 11,000 – 12,000 הזחלים לכל דלי.
    הערה: הקפד לא להוסיף עוד הדברים, מאז זה לגרום מזון מעט מדי ביחס הזחלים, לפיכך, להגדיל את התמותה.
11. לאחר 3 ימים, לאסוף את הדברים ספחת על מסננת 90 מיקרומטר. לאחר מכן לנקות את הדלי (עם 75 ° C מים מתוקים) למלא אותו עם מי ים מסונן, להוסיף הזנה צורניות חדשה (אותה כמות כמו בהתחלה), ולבסוף להוסיף את הדברים שוב. Cyprids מתחילים להופיע לאחר כ 6 ימים (± 1 יום).
12. איסוף cyprids קודם עם מסננת 90 מיקרומטר (שתוכנן כמו נקודת 4.2 לעיל). ואז להפריד בין הדברים ספחת moulted ו- cyprids עם מסננת 320 µm על גבי מסננת 160 מיקרומטר. Improvisus דרב הדברים תאסוף 320 µm מסננת, cyprids בתוך המסננת 160 מיקרומטר.
    הערה: הזחלים cyprid ניתן לאחסן ב 10 ° C בקערה crystallizing בחשכה לשימוש מאוחר יותר, עד ca. 6 ימים. עם זאת, האחסון יכול להשפיע את האיכות והביצועים של הזחלים ספחת, כך ניסויים השוואה בין טיפולים שונים צריך להשתמש באופן אידיאלי הזחלים מאותה אצווה (וזמן דומה אחסון) כדי למנוע תופעות מבלבלים¹⁶.

5. תרבות של Microalgae כמו מזון עבור הזחלים Nauplius ספחת

הערה: אצות גדלו ב- 3 סוגים שונים של תרבויות: (i) במלאי תרבויות, לתחזוקת לטווח ארוך של זנים היו בשימוש עבור חיסון של שינוי קנה מידה את; (ii) התחל תרבויות, הצעד הראשון הסולם למעלה; סוף סוף (iii) התרבות הפקה, אשר היקף הייצור הסופי כמויות גדולות של אצות כמו ספחת להאכיל.

1. סדר צורניות מינים מן התרבות אוסף של אצות חד-תאיים (CCAP) כדי לשמש להאכיל הזחלים nauplius ספחת. המין 2 Skeletonema marinoi (זן CCAP 1077/5) וגם Chaetoceros סימפלקס var. העדין (CCAP זן 1085/3) לתת תוצאות טובות כמו הזנה.
2. לסנן את כל מי ים כדי לשמש בתרבויות אצה, באמצעות מערכת סינון מחסנית עם גודל הנקבוביות הנומינלי של 0.2 µm. (המים המסוננים הוא גם לשמש את הבקיעה ביצים salina א ולאחר culturing של הזחלים nauplius ספחת). אוטוקלב המים המסוננים על התרבויות אצה (ב 105 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות).
3. היכונו מדיום התרבות של microalgae, שימוש במי ים בלוק מועשר פתרון f/2 של Guillard המכילה חומרים מזינים אורגניים, במתכות, וויטמינים (ראה Guillard 1975¹⁷ למתכון מפורט). בנוסף, להכין פתרון של סיליקט (נה₂SiO₃), אבל לשמור את זה לחוד העשרת f/2 כדי למנוע של משקעים מוצק.
   הערה: ריכוזי הפתרון מניות העשרה הפתרון מניות של סיליקט היו מוכנים לשמש כתוספת 1 מ"ל של כל אחד כדי 1 ליטר של מי ים.
4. אוטוקלב כל הציוד לשימוש בתרבות אצה ב 120 ° C מינימלית 20 אוטוקלב הכתיר בורג מבחנות עם 1 מ"ל של f/2 העשרה, 1 מ"ל של פתרון סיליקט. להוסיף את העשרה ופתרונות סיליקט theseawater כאשר בלוק זכוכית ונוזלים יש התקררה לטמפרטורת החדר.
5. לגדול תרבויות מניות microalgae במבחנות 40 מ"ל עם מזרקי.
   1. למלא צינורות הבדיקה כ 30 מ של מי ים מועשר. לחסן את התרבויות עם פיפטה פסטר סטרילי באמצעות כ 1 מ"ל של תרבות מניות 2 בן שבועיים. הכיפה בורג ואז מצויד אך לא התהדקה, כדי לאפשר חילוף הגזים קצת. אם הוא זמין, חיסון צריך להתבצע תוך זרימה שכבתית בארון כדי להפחית את הסיכון של זיהום.
      הערה: המטרה של התרבויות מניות היא לשמור על תרבויות אצה על בסיס ארוך טווח, כדי לשמש inoculum בשביל להתחיל תרבויות. תרבויות מניות חוסנו מחדש כל שבועיים.
   2. לחשוף את התרבות החדשה מניות כדי אור לבן עוצמה של ca. 25-50 µmole ז^-2s^-1 (עם מחזור בהירה-כהה של h 16:8). להעביר מניות התרבויות הישנות עוצמת אור נמוך כמו גיבוי. למחוק את כל התרבויות מניות 2 בן שבועיים.
6. שינוי קנה מידה לתרבות הייצור של אצות, לחסן את התרבויות התחלה מתרבות מניות, לגדל אותם ב- 500 מ"ל Erlenmeyerflasks.
   1. אוטוקלב 4 Erlenmeyer מבחנות, פיפטות פקקים כותנה עם 300 מ של מי ים (0.2 µm) מסוננים ו 4 מבחנות עם mL 0.3 העשרה f/2 ו- 4 עם פתרונות סיליקט. לקרר את העשרת f/2, את סיליקט לטמפרטורת החדר, ולהוסיף את הפתרונות המבחנות Erlenmeyer. לחסן אותם עם ca. 1 מ"ל של התרבות מניות 2 - בן שבועיים.
      הערה: להכין 2 מבחנות עם ס' marinoi 2 עם סימפלקס ג.
   2. הכניסו המבחנות על שולחן חזק עוצמת האור של 50 µmole m s^-2-1. כאשר תרבויות התחלה שרכשו אוכלוסיות צפופות אצה (צהוב-חום בצבע), הם מוכנים לשמש inoculum התרבויות ייצור אשר יספקו שברת את הזחלים עם אוכל.
7. לגדול הייצור תרבויות בבקבוקי פוליקרבונט 4 L עם פקקים סיליקון עם 2 יציאות קדח מצוידים עם צינורות זכוכית.
   1. לחבר את מבחנה 1 להגיע לתחתית הבקבוק משאבת אוויר דרך צינור סיליקון מצויד במסנן אוויר 0.2 µm. ודא הקצוות שפופרת זכוכית השנייה מתחת פקק סיליקון מתמלא כותנה כדי לאפשר את יציאת אוויר מוזרקים.
   2. בכל שבוע, מילוי 4 4 L בקבוקים עם מי ים מסונן, החיטוי אותם יחד עם פקקים. בנוסף, מבחן אוטוקלב 4 צינורות עם 4 מ"ל של העשרה f/2 פתרונות סיליקט.
   3. לאחר קירור, להוסיף את f/2 העשרה והפתרונות סיליקט הבקבוקים, ואז לחסן אותם עם חצי נפח של תרבויות סטארט-אפ המבחנות Erlenmeyer.
   4. למקם את הבקבוקים 4 L 4 עוצמת האור של 50 – 100 µmole ז^-2s^-1.
   5. הקציר התרבויות הייצור לאחר ca. שבוע 1; עתה הם צפופים מספיק כדי לשמש להאכיל שברת את הזחלים nauplius.
      הערה: ייצור התרבויות יש תוחלת חיים כשבועיים, מה שאומר כי ישנם 8 בקבוקים ייצור פעילים בכל עת.

6. עיצוב ניסיוני מחקרים באמצעות ספחות

1. מקום לוחות עם נער או מבוגר ספחות aquaria מבוקרת איפה הם יכולים להיות גדל תחת identicalconditions. זה נקרא ניסוי משותף-גן, אשר, למשל, יכול לשמש כדי להבין adaptions המקומי או פנוטיפית¹⁸, או ללמוד שינויים בביטוי גנים ביחס גורמים חיצוניים (למשל, מליחות, טמפרטורה או pH).
   הערה: זה גם ניתן להשתמש ספחות ישירות שנאספו מהשטח על לוחות. היתרון שבשימוש מעבדה-bred יחידים היא כי ניתן להימנע אפקטים אימהי בעת שימוש הדור הבא של הצאצאים.
   1. לחשוף ספחות לתנאים סביבתיים מסוימים במהלך מרווח זמן chosentime, ואחריו קציר של מבוגרים (למשלבמחקרים על ביטוי גנים)².
2. לניסויים עם הזחלים cyprid ללמוד ביטוי גנים³, מקם את cyprids מבוקרת aquaria איפה הזחלים ניתן לטפח בתנאים זהים.
   1. לקצור את cyprids לאחר תקופות זמן שצוין על-ידי סינון עם הנפות (כפי שמתואר בשלב 4.7), ולחלץ RNA לפי הפרוטוקולים להלן (שלב 8).

7. ניתוח ספחות

1. לנקות את המעבדה החלל שבו מתבצעים דיסקציה של דגימת דנ א, bothbefore, בין אנשים, כולל כל כלי ניתוח. פעולה זו מתבצעת באמצעות כלור הספסל (או אתנול 96% עבור המלקחיים).
   הערה: צינורות שכותרתה המכיל קיבוע מדיה (אתנול או פתרון מייצב RNA) מוכנות מראש.
2. בחר אנשים מורעבים לטווח קצר וגדול (לא להאכיל אותם במשך יומיים לפני הקרע). לנקות את הקליפה ספחת עם מברשת שיניים כדי למזער את הסיכון של זיהום ממינים אחרים (למשל, חיידקים, אצות) ולשטוף עם מים.
   הערה: הסיבה הרעב לטווח קצר של אנשים לפני הקרע היא כדי למנוע כל זיהום דנ א (למשל, של ציסטות Artemia בבטן).
3. למקם את ספחות בודדים על השטח אפילו, המצורף על פאנל או רופפים בקערה. לנתח את רקמות בהתאמה במבוגר. ישנם מספר דרכים לנתח ספחות, בהתאם למטרת המחקר.
   1. שיטת ניתוח ת לתקן את שברת את כל מהר ככל האפשר.
      1. הסר את שברת את כל הלוח באמצעות אזמל, הוספתו תחת הכינוי, קרוב לפני השטח לוח.
         הערה: ברוב המקרים, זו מניפולציה משאיר את הצלחת הבזליים כמעט ללא פגע, ובכך לא משפיע על הכינוי בפנים.
      2. בזהירות לפצח את הקליפה החיצונית בצד אחד על-ידי הוספת מלקחיים (איור 3). זה נעשה כדי להקל על החדירה של מדיום fixating בתוך המעטפת.
         הערה: אם הקליפה לא שבור בכלל לפני הצבת ה"בארנקל במבחנה, זה עלול להוביל תהליך קיבוע איטי יותר ואיכות נחותים של ה-DNA מאוחר יותר.
      3. הכניסו ה"בארנקל שבור מבחנה המכילה פתרון אחסון RNA או אתנול. השאירו את שברת את הפתרון עבור פחות 24 שעות ביממה עבור קיבעון שלה. כאשר הכינוי הוא קבוע, החיה ניתן יהיה להוציא את המדיה קיבעון, מניחים על מגש חיתוך. Cirri, מנטל, סומא (גוף) יכולים להיות מופרדים זה מזה, להציב צינורות נפרדת עבור נוסף עקירות של DNA או RNA.
         הערה: חשוב לבחון אם הביצה lamellae עם הביצים נמצאים בתוך הכינוי. אם היא קיימת, יש להסיר אלה לפני שתמשיך הקוד שיחולץ דנ א כדי להימנע מציאת מרובים אחרים במדגם.
   2. דיסקציה שיטה ב': הסרת את שברת את הקליפה לפני קיבוע שלה.
      הערה: שיטה זו לא תמיד עלולה להיות שנדגמו מאז שהוא מחובר הפנימי של calcareousshell המעטפת. אבל זה יכול להיות שיטה מהירה עבור דגימת DNA מאדם בודד.
      1. הסר בזהירות, באמצעות ניתוח מלקחיים, הלוחות tergal ו- scutal (איור 3) על ידי החדרת הקצה של המלקחיים בין הלוחות tergal, scutal, לתפוס צלחת למשוך בעדינות כדי להסיר אותם.
      2. לתפוס החזק של cirri עם מלקחיים, למשוך שברת את ולמקם אותו ישירות ב- 96% אתנול או RNA ייצוב פתרון עבור קיבעון.
         הערה: לפעמים, המעטפת גם ניתן לטעום בו זמנית, כפי שנראה כמו אפיתל דק עם פיגמנטציה כהה (ב ב improvisus). אחרת, המעטפת יכול להיות הסיר מבפנים של המעטפת באמצעות אזמל והניח, לאחר מכן, אתנול או RNA ייצוב פתרון.
         הערה: הלוחות tergal ו- scutal (אם שלם) יכול להיות מיובש ונשמר מאז הם שימושיים עבור זיהוי המינים¹⁰. המלצה כללית, אם ישנו ספק מינים, היא גם לצלם את שברת את כולו לפני מאתחל את הקרע.

8. RNA חילוץ עבור ה-PCR כמותי

1. מבוגרים במקום שישמש עבור ה-RNA עקירות לתוך RNA ייצוב פתרון, דגירה אותם בן לילה (עד 24 שעות) ב 4 ° C ולאחר מכן לאחסן אותם ב- 80 ° c
   הערה: Cyprid הזחלים הם מעדיפים יבש קפוא, ללא RNA מאוחר יותר ישירות ב- 80 ° C, על-ידי הצבתם cryotubes ולאחר מכן השוקע הצינורות בקצרה (30 s) בחנקן נוזלי לפני אחסונם ב-80 מעלות צלזיוס.
2. בזמנו את החילוץ RNA, להפשיר את ספחות על קרח, להשתמש בהם ללא פגע או שווייץ הרקמות כדי לשמש (ראה שלב 7).
   הערה: בשל מגוון גנטי גבוה בין יחידים (≈ 3 – 5% וריאציה של קידוד אזורי; Alm Rosenblad. et al., נתונים שלא פורסמו) רצוי מספר poola של אנשים מבוגרים, אשר מצמצם את ההשפעה של וריאציה רצף בין אנשים בשלב מאוחר יותר qPCR.
3. RNAextraction, הוסיפו µL 350 פירוק המאגר שסופק עם ערכת הכנה RNA לתוך צינורות המגון המכיל 2.8 מ"מ של חרוזים קרמיים.
   הערה: חרוזי קרמיקה לספק תשואה טובה יותר של RNA בהשוואה sonication (נציג תוצאות).
4. . קח ספחת למבוגרים (כולו או רקמות) או לאסוף מינימום של 20 הזחלים cyprid באמצעות מלקחיים ולשים אותם לתוך צינורות המגון.
5. להמשיך ישירות ההפרעה ואת המגון עם מפעל חרוז.
6. הכניסו הצינורות המגון עם דוגמה, חרוזים בעל טחנת חרוז. לנער אותם עם תדירות של 4.0 m/s מגניב ס' 20 לדוגמה עבור 1 דקות על קרח. חזור על 2 x.
7. הכינו את הרנ א לפי הפרוטוקול של ערכת זמינים מסחרית של בידוד ה-RNA.
   הערה: הערכת סיכונים (כולל קריאה של גליונות נתונים בטיחות) צריך להתבצע לפני בשיטות RNA החילוץ, לזיהוי כימיקלים מסוכנים שדורשים שימוש ברדס fume וביגוד מגן אחרים, כולל כפפות (למשל, התוספת של β-mercaptoethanol אל המאגר פירוק במהלך החילוץ RNA צריכה להתבצע בשכונה fume).
8. לכמת את הרנ א. להכין הפתרון עובד, להוסיף תקן ודוגמאות הנפח הכולל של 200 µL. מערבולת אותם עבור 2-3 s דגירה אותם עבור 2 דק הוספה הצינורות לתוך fluorometer ולא את הקרינה.
9. בררו את הדגימות RNA מפושטת חלבון ספקטרופוטומטרים ובדוק תקינות RNA שלהם עם מערכת ממוכנת אלקטרופורזה (נציג תוצאות).
   הערה: ההכנות באיכות טובה, RNA מומלץ לקיים יחס של 260/280 nm של 2 – 2.2 ו- DNA של 1.8. ערכים נמוכים יותר מצביעים על חלבון מציג כי ההליך החילוץ חייב להיות מותאם.

9. גנים: cDNA סינתזה, qPCR

1. פנקו את RNAwith DNase שהושג כדי להסיר את כל remainingDNA לפני ביצוע של cDNA עבור qPCR.
   1. בדוק מזהמות הדנ א על-ידי הוספת דוגמה RNA אבל אין רוורס טרנסקריפטאז בעת הכנת את cDNA. אם יש הגברה PCR של הגן שנבחר על cDNA מבלי רוורס טרנסקריפטאז, אין דנ א מזהמים הרנ א.
      הערה: לקבלת דוגמאות לשימוש עבור ה-RNA-seq (RNA-רצף באמצעות טכנולוגיית הדור הבא רצפי), השלב DNase הוא פחות קריטי. בפרט, עבור דגימות עם רמות נמוכות של RNA, הצעד DNase עשוי להיות מושמט כדי לא לאבד הרנ א בתהליך יותר מדי.
2. מבצע cDNA סינתזה RNA DNase שטופלו באמצעות כמות של RNA בטווח שצוין cDNA מסחרי סינתזה הערכה, אבל בדרך כלל, שימוש לפחות 50 ng.
3. לעצב תחל qPCR כך הם anneal חלקי הגן עניין שבו זהות רצף בין אנשים לא גבוה ככל האפשר, אך זהות רצף בין גנים paralogs לא נמוך ככל האפשר. ראה את הפרסומים המתאים עבור ספציפיים פריימר-זוגות המשמש ללימודי ביטוי גנים של Na⁺/K⁺ ATPase³ ו- aquaporins² (איור 5).
   הערה: למטרה זו, ה-RNA-seq רצף נתונים מאות cyprids או מספר מבוגרים יכול לשמש.
4. צבעי יסוד עיצוב גן שישמש עבור נירמול של רמות הביטוי (למשל, אקטין). הן צבעי יסוד משמש בהצלחה אקטין, קדימה: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3', והוא הפוך: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
   הערה: אקטין הוא גן שליטה בשימוש תכוף. עם זאת, אחרים יש גם כבר הציע כהפניה ובדק את ספחות¹⁹. מלבד אקטין, השימוש RPL8, 36B4, EF1 ו NADHd1 כנקודת התייחסות כבר נבדקו³. הוא היה סיכם כי אין הבדלים גדולים של רמות ביטוי של גנים התייחסות בהתאמה בין סומא, cirri, מבוגר או cyprids.
5. למטב את הטמפרטורה מחזק עבור תחל תוכנן על-ידי הוספת כמויות הולכות וגדלות של cDNA (בדרך כלל בטווח של 0.25 – 50 ng) תערובת המכילה SYBR Green, dNTP, פולימראז ו 0.3 מיקרומטר כל של פריימר ואחורה.
6. הפעלת פרוטוקולים qPCR בטמפרטורות שונות מחזק כדלקמן: טמפרטורה דנטורציה הראשונית של 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, צעד דנטורציה ב 95 ° C עבור 20 s, חישול טמפרטורות של 55 – 63 ° C עבור 20 s, על התארכות ב-72 מעלות ל 30 s. בסך הכל, לרוץ 40 מחזורי PCR.
   הערה: פריימר היעילות שאשקר בטווח של 90-105% ואת מחושבים E = (10^(-1/slope)-1) x 100 שבו השיפוע הוא השיפוע של העקומה המתקבל כאשר התוויית ערך יומן של ריכוז cDNA נגד שלהם ערכי הסף (Ct) של מחזור.
7. לבצע qPCR באמצעות כמות מספקת של cDNA, בדרך כלל 1 – 10 ng, באמצעות פרוטוקול ה-PCR שתוארו בשלב 3 עם הטמפרטורה מחזק אופטימום נמצאו.
   הערה: הסכום גבוה יותר של cDNA משמש רק עבור גנים באים לידי ביטוי בכמויות נמוכות מאוד.

תוצאות

ההליך המתואר עבור culturing של ספחות למבוגרים של improvisus דרב, עד לארבע אצוות של nauplius הזחלים ניתן להפיק בכל שבוע. שזה יהיה אפשרי לאסוף את הזחלים nauplius כמעט כל לילה, אבל זה דורש יותר אנשים ותשתיות (עם ספחות רבים ב- broodstock, תרבות ישחרר הזחלים ברציפות). גורם מגביל נוסף לייצור הזחלים נראה הזמינות של הזנה באיכות גבוהה, בפרט בנוגע צורניות Skeletonema. מקסימאלית, כל אצווה ממערכת culturing מורכב הדברים בערך 12,000, כך עד 50,000 הדברים בשבוע יכול להיות בתרבית. עם זאת, כמה שבועות ייתכנו עד tenfold הזחלים פחות המיוצר. מבוגר אחד יכול לייצר עד 7,000 הזחלים לכל יום¹⁴, מה שאומר כי 1 – 2 מבוגרים משחררים הזחלים עבור כל אצווה. תוך שבוע, 70-90% הדברים שנאספו יתפתח cyprids (מניב בערך 30,000 cyprids בשבוע, מקסימאלית) יכול לשמש עבור מבחני ההתנחלות, במחקרים מולקולריים.

יודגש כי ישנן וריאציות cyprid תכונות בין אצוות, באופן כללי, ישנן וריאציות גדול יותר בין אצוות מאשר בתוך קבוצות. לדוגמה, הצלחת ההתיישבות מבחני שיקוע משתנה בין 30 ל- 70% עבור קבוצות שונות. סביר להניח, זה כתוצאה של וריאציה גנטית בין זוגות מסוימים של מבוגרים שחרור הזחלים בתקופות דגימה שונים. כמובן, מומלץ כי ניסויים חוזרים ונשנים (משכפל ביולוגי) צריך לכלול cyprids ממספר קבוצות אם הצהרות כלליות יותר על התוצאות להתבצע. וריאציית אצווה-כדי-אצווה מעמיד דרישות על הנבחנים, שבו פקדי תקין ו- normalizations במחקרים ביטוי גנים צריך להיות מיושם. אולם, גם לאחר מספר הליכים סטטיסטיים נורמליזציה יושמו זה להפחית במידה ניכרת בין-אצווה וריאציה, חלק מהאפקטים של אצוות בדרך כלל עדיין נראית לעין (נתונים שלא פורסמו).

בעקבות פרוטוקול שסופקו, זה ניתן להשיג, בממוצע, 500 ננוגרם של RNA באיכות גבוהה מ- cyprids קטנה כמו 20, ללא התחשבות השלב ההתיישבות ספחת (טבלה 1). איכות RNA נמדד בדרך כלל כיחס בין הפסגות 18S, 28S (המיקום הצפוי של שתי הפסגות הם הצביעו על איור 4). עם זאת, במקרה של ספחות ופרוקי רגליים רבים אחרים, rRNA 28S נשברת כאשר מחממים (כחלק שיטת הניתוח), נודד יחד עם שיא 18S²⁰. זו הסיבה מדוע יש, באופן עקרוני, פסגה אחת rRNA יחיד בסוג זה של ניתוח של ספחות. ברור מן המבחן הזה (איור 4) כי המגון על ידי חרוזי קרמיקה מספק את הרנ א השלמות הגבוהה ביותר, היא, איפוא, שיטת הבחירה. הרנ א מספיקה הכמות והאיכות ליצירת ספריות רצף באיכות גבוהה עבור רצף, וכתוצאה מכך ממוצע של 70 מיליון קריאות עבור דגימה (מספר הקריאות, כמובן, תלוי ברמה של ריבוב במהלך הרצף). הכמות של RNA מספיקה גם עבור cDNA סינתזה qPCR ביטוי וניתוח של מספר רב של גנים.

איור 5 מראה התוצאה מניתוחי qPCR של aquaporins ושל Na⁺/K⁺ ATPase (NAK1) אחוי גרסאות, שבו נחקרו שינויים בביטוי בתגובה לשינויים רמזים סביבתיים^2,3. השוואה של הביטוי היחסי של הארוך וקצר אחוי וריאציות של NAK1 מראה כפולה גידול עבור ה-mRNA NAK1 ארוך מליחות נמוכה ביחס NAK קצר (איור 5א). לפיכך, הנתונים מצביעים על כך שחבור חליפי הופכת את הטופס ארוך השולט בתנאי מליחות נמוכה. במקרה של aquaporins, ברור כי שני הובלת מים paralogs AQP1, AQP2 להציג ביטוי דיפרנציאלי (איור 5B). בפרט, בתוך רקמת מעטפת כדור הארץ, ברור כי AQP1 הוא משמעותי למטה מוסדר ב salinities נמוך, אשר לא נראה במשך AQP2. במקום זאת, AQP2 מראה ביטוי מוגבר מעט נמוכה יותר salinities, אבל בסומה. ממצאים אלה מספקים בסיס לחקירות של התפקידים פונקציונלי השונות מובילי יון נולד ב- improvisus ו- aquaporins ב osmoregulation ספחת.

איור 1 : סקירה של כל culturing הליך והפקת RNA ללימודי ביטוי גנים במבוגרים. ליזום תרבות חדשה, לוחות מחובר למסגרת, לפרוס בים ב 1-3 מ' עומק. לאחר מספר שבועות, הלוחות עם נוער/מבוגרים ממוקמים אנכית בארונות במגשים במעבדה. בכל מגש מחזיקה כ- 40 לוחות עם מבוגרים. עם מבוגרים בערך 100 לכל לוח, ≈ הכולל 4,000 אנשים מבוגרים הם בתרבית למגש. ספחות הבוגרים ניזונים מ- Artemia , יכול להישמר שנה-סביב. Nauplius הזחלים נאספים מספר פעמים בשבוע מ המגשים ויה סינון דרך מסננת. הדברים שנאספו מועברים דליים בטמפרטורה 26 ° C באמבט מים ולא נמאס microalgae. הדברים גדלים עד שהם הנשירה לתוך שאינם האכלה cyprids, אשר נאספו על-ידי סינון. לוחות חדשים יכול להתבסס במעבדה על שיקוע של cyprids על לוחות, גם כדי לספק פאנלים חדשים לשנה-סביב תרבות או שישמש עבור ספציפיים set-ups ניסיוני עם שינו תנאים חיצוניים. RNA ואז המופק נוער/מבוגרים בסוף הניסוי או בנקודות זמן מסוימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : תמונות של כמה צעדים חשובים בהליך culturing. (א) תמונה זו מראה המסגרות עם לוחות לאיסוף אוכלוסיות חדשות מן השדה. (B) תמונה זו מציגה את הלוחות עם ספחות למבוגרים של improvisus דרב בארונות הממוקמות המגשים. הלוחות ממוקמים כ- 2 ס מ אחד מהשני. (ג) תמונה זו מציגה המגשים עם הכינוי פאנלים, הטנק האכלה משמאל. מ בכל מגש, אין פורקן היכן ממוקמים את הנפות של אוסף של הזחלים nauplius. (ד) תמונה זו מציגה שהייצור של Artemia feed ספחות למבוגרים. (E) תמונה זו מציגה גידול של הדברים בדליים מניחים באמבט מים מוגדר כ- 26 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : תיאור של המדרגות ניתוח ראשוני של ספחות למבוגרים: הסרת בגוף מהשריון שלו. (א) לתפוס אחד הלוחות opercular על-ידי הוספת מלקחיים בעדינות דרך הפתח. משוך בעדינות כדי להסיר את הצלחת ולחשוף את החיה. (B) לעקור החיה על ידי גרירה החלק סומא מתחת cirri. (ג) לוח זה מראה את האנטומיה הכוללת של ספחות בלוט. מנטל וביצים שעשויות להיות מופרית (בשחלה) לשהות בחלל מעטפת כאשר הגופה תיפלט. פתק על אנטומיה ספחת (על חשבון מעמיק יותר, ראו אנדרסון)⁹: צלחות קיר ספחת שיפוע פנימה ולאחר, וביחד הם יוצרים קונוס כמו הר געש. פתיחה, הצמצם, מכוסה על ידי שתי צלחות opercular, המהווים דלת, או operculum, כדי לסגור את הצמצם. בלוט ספחות בדרך כלל יש צלחת הבסיס גירני מודבקים בחוזקה תשתית; עם זאת, מינים מסוימים של ספחות חוסר הצלחת גירני הזו (למשל, ס' balanoides). ספחות מפרישים שלד חיצוני מן המעטפת בקדרות פיגמנט (השריון). המשטח החיצוני של המעטפת שכבות כפול התקשחה להיות נוקשה, ואילו השטח הפנימי של המעטפת לא התקשחה ולכן גמיש. בתוך הפתח, cirri נמצאים בעמדה שקועה. אלו הן תוספות בית החזה ספחות להשתמש עבור השעיה האכלה. השחלות ממוקמים סמוך הבסיס של הכינוי, ואילו האשכים נעוץ של סומא. איור זה אומץ מ. Panova et al. ²¹ , שפורסם באישור שפרינגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : נחישות של rRNA שלמות על ידי אלקטרופורזה בג'ל נימי. RNA הוכן על ידי שתי שיטות שונות המגון: (א) sonication וחרוזים קרמיקה (B). יחידת בציר ה-y, פו, עומד על יחידות קרינה פלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : ביטוי גנים תוצאות שני מחקרים שונים של גנים חשוב osmoregulation ב נולד ב- improvisus. (א) לוח זה מראה את הביטוי דיפרנציאלית כפי שהוא נמדד qPCR של משתנים אחוי של Na⁺/K⁺ ATPase NAK1 בתגובה salinities השונות pCO₂ רמות³. בטיפול מליחות נמוכה, הביטוי isoform ארוך (NAK1-L) הוא גדל יחסית הקצר (ANOVA, P < 0.001). (B) לוח זה מראה את הביטוי של aquaporins אצל מבוגרים improvisus דרב של במהלך החשיפה שלהם salinities שונים². qPCR נעשה שימוש כדי לקבוע את רמות ביטוי aquaporin ביחס אקטין. אנשים מבוגרים היו מתפשט-3 salinities שונים (3, 20, 33 PSU) למשך 14 ימים. לשם הכנת RNA, הופרדו סומא, cirri, קרנה של המבוגרים. בשתי דמויות, קווי שגיאה מציינות סטיית התקן. * * ו * * * מצביעים על החשיבות של רמה (ANOVA), 0.01 ו- 0.001, בהתאמה. הדמויות שונו מ לינד. et al. ^{2 , 3}. הדמויות הן מפורסמים באישור PLoS ONE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שלב ההתיישבות	הסכום הכולל של RNA (ng)
שחייה חינם	512
חקר: חיפוש קרובים	518
Cyprid המצורפת	550
לאחרונה כשהתבוננה לנוער	832

טבלה 1: התשואות של רנ א. טבלה זו מציגה את הכמות ה-RNA חילוץ עם ערכת הכנה RNA מתוך בריכות של 20 אנשים cyprid שנאספו בשלבים שונים במהלך תהליך ההתנחלות.

Discussion

התרבות ספחת-מעבדת המחקר הימי Tjärnö (שוודיה) פועל למעלה מ-20 שנה, שימש במשך מחקרים בתחומים רבים של מחקר שונים. מעל 30 מאמרים מדעיים פורסמו אשר נעזרו מערכת culturing במהלך השנים האחרונות, כולל מחקרים antifouling^13,22, הידרודינמיקה²³, אקולוגיה כימית²⁴, האקלים שינוי¹⁶ , ביולוגיה אבולוציונית⁵וביולוגיה מולקולרית².

כדי למנוע את הבחירה של אנשים מסוימים, כי הם יותר מתאימים לסביבת מעבדה (יחידים כי לא יכול להיות נציג של האוכלוסייה פראי), מומלץ לאסוף broodstock חדש מן השדה בכל שנה. בנוסף, זה גם תרגול טוב כדי להצעיר את התרבות מדי שנה, מאז יש בערך 50-80 אחוז התמותה בקרב מבוגרים במהלך שנה רגילה. עם זאת, אם המטרה היא לייצר קווים המפגרים או להגדיר לימודי האבולוציה ניסיוני, המשפחות גדלו-מעבדה בלבד הם כדי לשמש.

זמן טוב לאסוף improvisus דרב על לוחות במעבדת המחקר הימי Tjärnö הוא יוני – אוגוסט כי באותו הזמן, יש לאספקה טובה של הזחלים cyprid בים. בדיקת הלוחות פעם בשבוע כדי לראות מתי מתחיל ההתנחלות ספחת להסיר באופן ידני את השני התיישבו מינים מאשר improvisus דרב (למשל, מולים, tunicates, bryozoans, hydroids, nemerteans/tubeworms ו מינים אחרים ספחת) לוחות (למשל, עם מברשת שיניים). סביב Tjärnö, יש שלושה מינים במים רדודים ספחת הנוכחי (נולד ב- improvisus, Semibalanus balanoidesו Balanus crenatus). אולם, improvisus דרב הוא הדומיננטי הדחוס של חלק משטחים קשים במהלך יולי-אוגוסט. ס balanoides יש תקופת ההתנחלות שלו במהלך האביב המוקדם, מעדיף בעיקר טבעיים מצעים (למשל, אבנים). Crenatus דרב יכול להתרחש בכל המספרים הנמוכים על הלוחות במהלך הקיץ.

זה גם אפשר להתחיל הדורות ספחת למבוגרים cyprids בתרבית, אשר יהיה חיוני אם הוקמו מסוימים linages עם תכונות מיוחדות, או לימודי האבולוציה ניסיוני. הדרך הנוחה ביותר להתחיל דורות חדשים של מבוגרים הוא להתיישב cyprids על לוחות תרמופלסטיים במעבדה. לוחות אלה עם cyprids החדש שיוחסו יכול לשמש גם ניסיוני טיפולים או חשיפה בשטח. במקרים חירום, ניתן גם להשתמש מבוגרים על סלעים מאתר הסמוך (למשל, Idefjorden במקרה של המעבדה לחקר Tjärnö ימיים) איפה improvisus דרב נפוץ. מבוגרים שכבר פועלת אלה מטופלים באותו אופן כמו המבוגרים על הלוחות, ובכך להציב מגשים, מוזן דרך הזרימה דרך המערכת. תאים זרימה יכולה לשמש גם כדי ליצור לוחות עם ספחות²⁵. אלה הם תאי זרימה דרך עם פלנקטון נטו על הצדדים בו cyprids אל תתפשר, עם פאנלים כמו פני השטח הישוב היחיד עבור הזחלים.

ישנם מספר שלבים הם קריטיים עבור הגדרת תרבות ספחת ארוכת טווח תפקוד כולל בכל שלבי החיים. בין השיטות התרבות דרב improvisus הם כנראה, במידה רבה, חלים גם על אחרים חסרי חוליות ימיים עם הזחלים planktotrophic free-swimming. נהלים culturing עבור מינים מסוימים הם כבר היטב תיאר (למשל, מולים כחולים, מינים שונים של צדפות)²⁶, בעוד שלגבי שאר החוליות, ישנן רק כמה דוגמאות של תרבויות ארוכת טווח הנמשכים כל חייהם מחזור. אחד מהניסיונות המוצלחת הראשונה ספחות תרבות (נולד ב אמפיטריטה) בוצע על ידי. Rittschof et al. ¹⁵. משאבים אישיים ופיננסיים לטווח ארוך צריכה להיות במקום לפני בהתחשב הגדרה ספחת culturing מתקן. שמירה על סוג זה של השנה-סביב ספחת תרבות דורש אחד לפחות אדם לעבוד בחצי משרה. ייתכנו כמה פוטנציאל עתידי אוטומציה של כמה צעדים קו הייצור, בעיקר culturing microalgae²⁷. בנוסף, כדי להצליח, זה חיוני כדי ש- access כדי כמויות גדולות של מי ים באיכות גבוהה. Culturing microalgae, Artemia, ו ספחות אינו כרוך כל נהלי בטיחות מסוים. עם זאת, בדיקות של כמה חומרים antifouling או כימיקלים רעילים, ייתכן שיהיה עליך באמצעי זהירות מיוחדים.

הלוחות נבדק מספר פעמים בשבוע עבור מציג. מי ים המשמשים את התרבות היה נרגש מן לעומק 40 מ' ב הפיורד Koster מחוץ למעבדה המחקר הימי Tjärnö, היה עבר שני מסננים חול לפני כניסתו למערכת המים במעבדה. אם אין סינון המים נעשה, יהיו הרבה יותר זיהום בתרבות. זה חיוני לנקות באופן קבוע הלוחות בתרבות דטריטי, פרוקי רגליים אחרים (למשל, בניית stolon hydroids ו- nemerteans טורפים) מזין את המערכת דרך אספקת מי ים מן השדה. לדוגמה, אם אין הזחלים מיוצרים למרות העובדה כי התרבות כבר מוזן היטב, אחרת נראה במצב טוב, ייתכן שהבעיה הנוכחות של nemerteans שמופיעים כדי לעכב את ההזדווגות. באופן טבעי, הרבה אורגניזמים מזהמים בתרבות במעבדת המחקר הימי Tjärnö היו ספציפיות עבור החוף המערבי שבדי ולאחר סוגים אחרים של מזהם אורגניזמים להיות שכיחה יותר אתגר באזורים גיאוגרפיים אחרים. בחוף המערבי של שבדיה, זה נדיר למצוא זיהום על ידי מינים אחרים ספחת על הלוחות. לעיתים, הקמת balanoides ס נמצאה, אך זוהי בעיה שולית מאוד (לכל היותר, אחד ס' balanoides מזהם עבור דגימות improvisus נולד ב- 10,000). העדר מזהמות מינים הייתה תלויה ככל הנראה המשטר להקים תרבויות חדשות במהלך הקיץ, כאשר larvaefrom improvisus נולד ב- היו מאוד דומיננטי. בנוסף, היה גם העשרה ברורה של improvisus דרב על הלוחות מאז שהמין הזה הוא סלקטיבי עבור משטחים חלקים¹³.

זה חיוני כדי להסיר ספחות מת למבוגרים. אם התרמילים הריקים השאיר על הלוחות, הם יכולים להפוך מקלט הן הדברים Artemia כמו גם עבור מינים מזהמים שונים. בנוסף, כבר הבחין כי אנשים מתים להשפיע לרווחתם של השכנה יחידים, כנראה עם שחרורו של תרכובות רעילים במהלך הפירוק. תוצאה נוספת של התמותה למבוגרים הוא כי אנשים מסוימים יישארו לבד, רחוק מדי ממבוגרים אחרים כדי לאפשר הזדווגות (למרות ספחות יש את הפין הארוך ביותר בעולם החי ביחס לגודלו)²⁸. אנשים אלה ישרדו, אבל הם לא פרודוקטיביים עבור הזחלים. עם זאת, אלה אנשים מבוגרים בודד ניתן להסיר בעדינות מבלי לפגוע במשטח הבסיס, להיות ממוקמים בצורה אופקית קרוב אחרים כדי לאפשר הזדווגות. ספחות גם יכול להיות הזדווגו על ידי הנחת לוחות עם מבוגר אחד על אחד, אבל מספיק קרוב כך הפרייה יכול להתרחש. בדרך זו, קווים גנטיים יכול להיות מיוצר¹⁴.

זה חיוני כדי לייצר שידור באיכות גבוהה, להאכיל תרבויות כמעט כל יום. אפילו כמה ימים ללא מזון עלולה לגרום לשחרור יורדת של הזחלים. בדיקות קודמות של דיאטה קומפוזיציה הראו כי diatoms הם חיוניים עבור הצמיחה ואת ההישרדות של הדברים ספחת. מספר מינים צורניות נראה הולם כמו הזנה, למרות תאים קטנים או יחידי (פחות מ- 10 מיקרומטר בקוטר) יהיה צורך הבליעה של הדברים. המין marinoi ס, ג סימפלקסו pseudonana ט כל הוכיחו להיות הזנה הולמת עבור הדברים improvisus דרב , כמו גם קל לטפח. בנוסף, איכות המזון היא בדרך כלל גבוה יותר עבור שמתקדמות אצות. גם דווח כי diatoms הם חיוניים עבור הקמת תרבויות פרודוקטיבי אמפיטריטה ב¹⁵. תיאוריה על החשיבות של diatoms הוא שהם יש פרופיל חומצת שומן ייחודית, הם עשירים במיוחד חומצות שומן רב בלתי רווי מאוד 20:5²⁹. הוכח כי מסוימים חומצות שומן חשובים להתפתחות מוצלחת של הצדפה הזחלים³⁰.

במהלך השנים, היו אין מקרים של מחלות מזיקה בתרבות ספחת. Aquacultures הגעה מסחריים רבים, כמו צדפות ומולים, מחלות נפוצות למדי, שעשויות להזיק מאוד. השפעות מזיקות של וירוסים דווחו גם של אוכלוסיות בר. הצדפה יליד צרפת הוחלף הצדפה פורטוגזית Crassostrea angulata בשנת 1925, אך מין זה נמחתה iridovirus סביב 1970³¹. לאחרונה, היו אירועי תמותה מסיבית בתוך הצדפה פסיפיק Crassostrea גיגס בתרבויות ברחבי העולם, אשר מופיע לשייך ההרפס 1 ostreid³². אין דיווחים על פתוגנים, חיידקים או וירוסים על ספחות פורסמו עד כה. עם זאת, בפרוייקט מתמשך הגנום-על improvisus דרב, וירוס רצפים נמצאו (Alm Rosenblad. et al., נתונים שלא פורסמו) אבל עם אין קשר לכאורה סימפטומים של מחלות. תערובות של אנטיביוטיקה בעבר הוחלו על התרבויות כדי למזער את הסיכון לזיהומים חיידקיים; עם זאת, ההליך שנמצאת כרגע נטושה, עד כה, זה לא יצרה בעיות זיהום.

אם מי ים מחומם (כמתואר לעיל), התחממות יתר ייתכן הסכנה החמורה ביותר בתוך פס הייצור תרבות. קשה, כמובן, כאמצעי הגנה נגד התחממות יתר, למרות חיישנים ומערכות התראה מתאימה עשוי להיות בשימוש (לדוגמה, לשלוח דואר אלקטרוני והודעות טקסט אנשים אחראים). מקרים מסוג זה בעבר גרמו ההרג משמעותי של מבוגרים בתרבות. זה ניתן, כמובן, להיות הרסנית, להרוס בהשקעות לטווח ארוך של זמן וכסף. בפרט, זה יהיה אסון אם נקבעו קווים גנטיים המפגרים. כדי להבטיח את תוחלת החיים של קווים אלה ולאבטח אותם מפני אובדן מקרי, רצוי לפתח מתודולוגיה הקפאה קריוגנית ספחות. בעבר דווח כי הזחלים הצדפה השקט יכול להיות קפוא למטה, קמה לתחייה עם הצלחה חלקית³³. Cryobanking היה גם כלי חשוב כדי לשמר משאבים גנטי של מגוון רחב של מינים³⁴. הדברים אפילו מב' אמפיטריטה מדווחים לשרוד מקפיא³⁵, נמצא כי 20% של האנשים למטה קפואה בהצלחה כשהתבוננה לתוך cyprids³⁶. עם זאת, החלת הקפאה להישרדותם לטווח ארוך של תרבויות כה לא אומץ, אבל זה אכן יהיה נחוץ לשם קיום השורות שנבחרו; זה יהיה צעד חיוני לביסוס improvisus דרב בחוזקה לתוך modelsystem ימיים חזק.

. הנה, פרוטוקול הוצג רוברט של רקמות שונות מן הבוגרים של improvisus דרב (קריcirri, סומה, האח). עם זאת, יש להדגיש כי גם ניתן לחילוץ לרקמות אחרות. למשל, הרקמות הרכות בין המעטפת חיצוניים ופנימיים של המינים עלי הלוואי קרומיים בסיס Tetraclita חבוש יפני formosana יש כבר בקפידה מבודד ולא להשתמש בו עבור החילוץ-RNA וגם RNA-seq ניתוח של ביטוי גנים³⁷. פרוטוקול מיצוי מיטבי מחולקת לרמות המתוארים כאן מספק כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור רצף של כמות מזערית של הפעלת חומר. ראשית, האוסף של הזחלים בודדים ישירות לתוך הצינורות המגון ממזער אובדן במהלך ההעברה של שפופרת אחת לאחרת. יתר על כן, בין השיטות השונות שנבדקו, את המגון עם חרוזי קרמיקה התבררה תשואות היעילה ביותר מבחינת RNA ויושר, בהשוואה המגון sonication או במכתש ועלי. בעת תכנון גנים או גנומיקה ניסויים, יש לזכור את האתגר של וריאציה גנטית גבוהה ספחות, לפחות עבור improvisus דרב. זיפרגליים יש מגוון גנטי בטווח של 3-5%, אפילו בקידוד אזורי (Alm Rosenblad. et al., נתונים שלא פורסמו). זה, כמובן, מעמיד והדרישות הספציפיות על העיצוב של צבעי בסיס לניתוח qPCR, שם יותר והתפאורה אזורים צריך להיות מזוהה ומשמש תבניות עבור תחל כדי לקבל ביטוי עקבי תוצאות betweenbatches. אזורים שנשמרת עבור היעד גנים, כמו aquaporins ו- Na + / K + ATPases, יכול להיות מזוהה על ידי לימוד ההשתנות רצף של גנים אלה ב- RNA-seq והנתונים שהתקבלו אוכלוסיות של cyprids המכילה מאות אנשים. עבור ניתוח הגנום, DNA ניתן לטעום. עם זאת, השגת DNA באיכות גבוהה מ- improvisus דרב עשויה להיות מאתגרת²¹.

לסיכום, התרבות ספחת מבוססים הוכיחה להיות אינסטרומנטלי סוגים שונים של מחקרים ניסיוניים. בפרט, ההפקה השנה-סביב כל זחל מאפשרת לנו לערוך ניסויים בלי להיות מוגבל לתקופה ההשרצה המתרחשים באופן טבעי (עבור improvisus דרב, מדובר במהלך הקיץ). הזחלים שהושג יכול לשמש כדי לבצע מערכת רחבה של מחקרים ניסיוניים, כולל מבחני ההתנחלות, מבחני התנהגות, ביטוי מחקרים על גנים ספציפיים, כמו גם מחקרים transcriptome הגנום כולו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels	Plastic produkter, Bromma, Sweden		transparent glas
1.5-L PET bottle
Artemia	INVE Aquaculture, Belgium		We have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5)	CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland	strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3)	CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland	strain 1085/3
Millipore cartridge filter system	Millipore
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm	Millipore	cartridge CWSS01S03	High capacity for large volumes
polycarbonate bottle	Nalgene		autoclavable
RNA later	Qiagen	76106	Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free Kit	Invitrogen/Thermofisher Scientific	AM1907	DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708890	cDNA synthesis kit
SYBR Green supermix	Biorad	1708880	Dye for QPCR
RNeasy minikit	Qiagen	74104	RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes	Precellys	KT03961-1-003.2	Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kit	Qiagen	74004	RNA extraction of few cyprids