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摘要

在这里, 我们提出了一个生产革兰氏阴性大肠杆菌 (大肠杆菌) spheroplasts 和革兰氏阳性芽孢杆菌巨大(巨大) 原生质体的协议, 以清楚地形象化和快速表征多肽-细菌的相互作用。这为定义膜定位和转运肽提供了系统的方法。

摘要

用共焦显微镜作为一种评估细菌内肽定位模式的方法, 通常被常规光学显微镜的分辨率限制所抑制。由于给定显微镜的分辨率不能很容易地增强, 我们提出了改变小棒状革兰氏阴性大肠杆菌 (大肠杆菌) 和革兰阳性芽孢杆菌巨大(巨大) 的协议 .成更大, 容易成像的球形形式称为 spheroplasts 或原生质体。这种转变使观察者能够迅速、清楚地确定肽是否进入细菌膜 (即膜定位) 或穿过细胞膜进入细胞 (即转运)。利用这种方法, 我们还提出了一种系统的方法来表征多肽作为膜定位或转运。这种方法可用于各种膜活性肽和细菌菌株, 我们通过观察 Buforin II P11A (BF2 P11A)、抗菌肽 (AMP) 与大肠杆菌的相互作用, 证明了本协议的实用性.spheroplasts 和B. 巨大原生质体。

引言

抗菌肽 (安培) 得到了重视, 因为他们的潜在用途作为替代传统抗生素1,2,3,4,5。安培杀死细菌的转运通过细胞膜, 并与细胞内的成分, 如核酸, 或通过 permeabilizing 膜导致细胞含量的泄漏6。除了用作抗生素外, 转运安培还可用于药物传递应用, 因为它们可以无中断地穿过不透水细胞膜7、8。因此, 我们寻求了解基本的 AMP 作用机制, 为其在药物设计中的应用打下基础。

共焦显微镜为评估细菌细胞中荧光标记安培的定位模式提供了一种方法, 提供了对其作用机制9、10、11、12的洞察力,13,14. 通过对细菌膜进行标记, 可以确定是否有荧光标记肽本地化到细胞膜或细菌细胞的细胞内空间。然而, 这种技术受细菌的小尺寸和杆型的限制, 由于常规光学显微镜的分辨率极限和15张幻灯片中细菌的变异方向, 使得成像具有挑战性。

所提出的方法的目的是通过共聚焦显微镜增强荧光标记肽定位模式的可视化。通过将小的、薄的、棒状的革兰阴性大肠杆菌 ( 大肠杆菌) 和革兰阳性芽孢杆菌巨大(B. 巨大) 细菌转化为扩大的球形形式, 将其增强, 称为spheroplasts (为革兰阴性菌株) 和原生质体 (为革兰阳性菌株)16,17,18,19,20,21。Spheroplasts 和原生质体更容易图像, 因为它们的大小和对称的形状, 这使得在幻灯片上的细菌的方向与其成像无关。此外, 我们提出了一个系统的方法来定量分析共焦显微数据, 以表征安培作为一种膜定位或转运。应用这些方法可以更容易地区分荧光标记的肽定位模式。此处提供的协议可用于评估除安培以外的各种膜活性剂的定位, 包括细胞穿透肽。

这种技术的一个明显的优点是, 它提供了对安培在单个细胞水平上的作用机制的洞察, 这可能揭示细胞对细胞的异质性15, 而不是其他常用的荧光化验方法来识别安培的作用机制, 仅提供容量估计9,22,23,24,25。使用 spheroplasts 和原生质体, 以评估 AMP 细胞进入是特别有用的26 , 因为它们比其他模型用于评估细胞进入, 如脂囊泡24的生理相关15 。

研究方案

1. 解决方案准备

注: 准备步骤1.1–1.9 和1.8–1.11 中描述的解决方案, 以便分别生产大肠杆菌spheroplasts 和巨大原生质体。

  1. 制备1米三氯, pH 7.8 通过溶解10.34 克三盐酸和 4.17 g 的三 OH 在50毫升的 dH 2O 在125毫升瓶。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
  2. 20毫米氯化镁2, 0.7 米蔗糖, 10 毫米三氯, pH 7.8), 通过溶解0.10 克氯化镁2 (95.2 克/摩尔) 和11.98 克蔗糖 (342.3 克/摩尔) 25 毫升 dH 在2毫升的瓶中。添加500µL 1 M 三氯 (pH 7.8) 和调整体积为50毫升。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
  3. 10毫米氯化镁2, 0.8 米蔗糖, 10 毫米三氯, pH 7.8), 通过溶解0.05 克氯化镁2 (95.2 克/摩尔) 和13.69 毫升的蔗糖 (342.3 克/摩尔) 在 25 ml dH2毫升瓶中。添加500µL 1 M 三氯 (pH 7.8) 和调整体积为50毫升。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
  4. 在2毫升的烧瓶中, 将13.69 克蔗糖 (342.3 克/摩尔) 溶解在50 毫升 dH 中, 制备0.8 米蔗糖。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
  5. 准备5毫克/毫升脱氧核糖核酸酶 (DNase i) 通过溶解0.015 克 DNase i 3 毫升的 dH2O 在50毫升瓶。通过25毫米注射器过滤器, 用0.2 µm 膜过滤消毒。整除溶液成离心管, 贮存在-20 摄氏度。
  6. 用15毫升的烧瓶将0.698 克 EDTA 二钠脱水 (372.2 克/摩尔) 分解为2毫升 dH, 制备0.125 米乙氧乙酸 (edta), pH 8.0。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
  7. 600µg/毫升苄溶解0.03 克的苄水合物 (365.404 克/摩尔) 在50毫升的 dH2O 在125毫升瓶。通过过滤25毫米注射器过滤器与0.2 µm 膜, 并贮存在一个锥形管4°c 消毒。
  8. 5毫克/毫升溶菌酶溶出0.015 克溶菌酶3毫升的 dH2O 在50毫升瓶。通过25毫米注射器过滤器, 用0.2 µm 膜过滤消毒。整除溶液成离心管, 贮存在-20 摄氏度。
  9. 在2升瓶中, 在1升的 dH2O 中溶解30克的胰酪胨, 准备3% 瓦特/v 的大豆肉汤。整除将溶液放入含有25毫升或100毫升的烧瓶中, 分别用于制备大肠杆菌spheroplasts 或巨大原生质体.蒸压瓶消毒液体培养基。无菌的可储存在室温或4摄氏度。
  10. 准备溶液 C (1 米蔗糖, 0.04 米马来酸, 0.04 米氯化镁2, pH 6.5) 溶解34.23 克蔗糖 (342.3 克/摩尔), 0.46 克马来酸 (116.07 克/摩尔), 和0.38 克氯化镁2 (95.21 克/摩尔) 在100毫升的 dH2 毫升瓶。将 pH 值调整为6.5。通过25毫米注射器过滤器进行消毒, 用0.2 µm 膜, 在室温下贮存在锥形管中。
  11. 在1升玻璃瓶中混合100毫升3% 瓦特/v 型和100毫升溶液 C, 制备200毫升原生质体培养基。蒸压釜消毒溶液并贮存在室温下。

2. 隔夜文化的准备

注: 使用适当的无菌技术执行2-4 节。如果需要, 细菌菌株可以含有一种抗抗生素的质粒, 以减少潜在的污染。如果使用耐药性菌株, 在步骤2.1、3.1–3.2 和4.1–4.4 中添加必要的抗生素。

  1. 准备一夜文化, 通过采摘一个单一的细菌菌落使用不育的吸管尖端, 并将其放入一个14毫升培养管含有2–3毫升3% 瓦特/v。孵育在37摄氏度, 而颤抖 16–21 h。

3. 革兰阴性大肠杆菌Spheroplasts 的制备

  1. 在一个250毫升的烧瓶中, 稀释隔夜文化1:100 在25毫升容量3% 瓦特/v 和孵化细菌溶液在37°c, 而颤抖大约 2.5 h, 直到解决达到了0.5–0.8 的光学密度在600毫微米。使用分光光度计测量光学密度。
  2. 在一个250毫升瓶, 稀释这个文化1:10 在30毫升3% 瓦特/v 和孵化在37°c, 而颤抖 2.5 h 在存在60µg/毫升苄 (347.4 克/摩尔), 以产生约50–150µm 的单细胞花丝长度, 可在使用光显微镜的1,000X 放大率下观察到 (图 1B)。
  3. 通过离心细菌溶液在 1500 x g, 4 °c 为4分钟醒酒, 并丢弃上清, 保留颗粒, 以收获花丝。
  4. 轻轻地加入1毫升0.8 米蔗糖, 小心不要扰乱颗粒, 以洗涤花丝。孵育1分钟, 然后丢弃上清, 不干扰颗粒。
  5. 添加150µL 1 M 三氯 (pH 7.8), 120 µL 5 毫克/毫升溶菌酶, 30 µL 5 毫克/毫升 DNase I, 120 米 EDTA µL 在各自的顺序对颗粒和孵化溶液在室温下为0.125 分钟。
  6. 增加1毫升溶液 a 逐渐超过1分钟的解决方案, 在3.5 使用微, 同时轻轻旋转的解决方案手工。在室温下孵化溶液4分钟。
  7. 将7毫升4°c 溶液 B 放入两个15毫升锥形管中。在3.6 中为这两个管中的每一个添加相同数量的溶液。离心溶液在 1500 x g, 4 °c 为4分钟。
  8. 使用血清吸管, 小心去除所有, 但 1-2 毫升的上清, 而不干扰颗粒。用 P1000 微轻轻吹打上下并用重悬颗粒。通过使用光显微镜观察1,000X 放大器上的样品, 目视检查以查看 spheroplasts 的形成情况 (图 1C)。
  9. 储存的 spheroplasts 在-20 摄氏度, 直到一个星期或直到他们已经经历了3冻融循环。

4. 革兰阳性B. 巨大原生质体的制备

  1. 在一个250毫升瓶, 稀释隔夜文化 1:1, 000 在100毫升 3% w/v 和孵化细菌溶液在37°c, 而颤抖约4.5 小时, 直到解决方案已达到0.9 毫微米的光学密度的一.使用分光光度计测量光学密度。
  2. 把液体培养成两个50毫升圆锥管和离心机在 2000 x g, 4 °c 10 分钟。
  3. 使用血清吸管, 从两个圆锥管中去掉上清。并用重悬2.5 毫升原生质体培养基中的每个颗粒, 并将悬浮溶液组合成一个圆锥管。在125毫升的烧瓶中用吸管将悬浮溶液混合。
  4. 加入1毫升5毫克/毫升溶菌酶和孵育1小时在37摄氏度, 而颤抖。
  5. 用光镜观察1,000x 放大后原生质体的生长情况, 注意任何不规则的现象, 如出现肿胀棒而不是球体的细菌 (图 2)。使用血清吸管, 将溶液转移到15毫升圆锥管, 离心机在 2000 x g, 4 °c 10 分钟。
  6. 醒酒5毫升原生质体培养基上清液并重新悬浮颗粒。将原生质体贮存在-20 摄氏度以上, 直到他们经历了3次冻融循环。

5. 制备多肽溶液和膜染料用于成像

  1. 肽溶液
    1. 在用铝箔包裹的离心管中, 溶解2毫克 FITC 标记为 BF2 P11A 800 µL dH2o 使用含有至少一色氨酸残留物的肽, 以进行蛋白质浓度测量。
    2. Spectrophotometrically, 测量 280 nm 的多肽溶液的吸光度。用摩尔消光系数计算色氨酸 (5700/立方米) 的肽浓度。
    3. 将 dH2O 的肽浓度稀释至最终浓度的100–200µM. 贮存在一个离心管在-20 °c 包裹在铝箔, 以防止光线。
  2. 膜染料
    1. 在离心管中, 通过将5毫克的 di-8-ANEPPS 溶解在亚砜的843.3 µL 中, 准备10毫米 di-8-ANEPPS (592.9 克/摩尔) 的股票。储存在4°c 包裹在铝箔, 以防止光线。
    2. 在离心管中, 通过增加3µL 10 毫米 di-8-ANEPPS 到997µL 亚砜, 准备1毫升0.03 毫米 di-8-ANEPPS。贮存在一个离心管在4°c 包裹在铝箔, 以防止光线。

6. 应用共焦显微术对大肠杆菌Spheroplasts 和巨大原生质体的可视化研究

  1. 吸管5µL spheroplasts 或原生质体在聚 l-赖氨酸涂层玻璃滑动。添加2µL FITC 标记安培 (100-200 µM) 到幻灯片和孵化3分钟保护免受光照。
  2. 添加1µL 的膜染料 di-8-ANEPPS (0.03 毫米) 的幻灯片和孵化3分钟保护免受光照。用玻璃盖玻片盖上, 用指甲油封住。
  3. 打开共焦显微镜和氩激光。将氩激光器调整为20% 功率输出和20% 传输。
  4. 分别设置 FITC 标记肽发射通道和 di-8-ANEPPS-labeled 膜染料发射通道的 499–532 nm 和 670–745 nm 的发射波长范围。
  5. 图像原生质体或 spheroplasts (图 1和图 2) 与63X 目标。使用成像软件获得8位, 512 x 512 复合 z 叠加图像由0.5 µm 切片整体的 spheroplast 或原生质体。
    注意: 在成像 spheroplasts 和原生质体时, 要仔细考虑减少放射出血。有关详细信息, 请参阅讨论。

7. 安培定位的表征

  1. 在成像软件中打开复合 z 堆栈图像。找到 spheroplast 或原生质体的中心-多数切片, 并将一个循环区域 (roi) (0.3 µm 直径) 放在膜上 (roi 1), 一个位于 spheroplast 或原生质体的中心 (roi 2), 一个远离 spheroplast 或原生质体来测量背景荧光 (ROI 3) (图 5)。避免包含饱和像素。每个 ROI 的荧光强度都可以通过成像软件来计算。
    注意: 如果肽不局部化到膜的整体, 在肽被本地化的膜区域上绘制 ROI 1。
  2. 使用以下等式确定细胞内肽荧光强度与膜肽荧光强度的比值:
    figure-protocol-5367
    注: roi 3 中的荧光强度从 roi 2 和 roi 1 中的荧光强度中减去, 以说明背景荧光。

结果

通过扩大细菌和使它们球状, 我们可以很容易地区分是否多肽定位到细菌膜或容易植物常常将跨细菌膜。常规光学显微镜的分辨率限制使它具有挑战性, 以区分是否在正常细菌的细胞膜或细胞内空间出现多肽信号, 因为在膜上定位的信号似乎会与细胞内空间 (图 3A)。相比之下, spheroplasts (2–5µm) 和原生质体 (2–3µm) 的扩大大小与正常的细菌相比, 通常只...

讨论

这里提出的协议使研究人员能够更快地获得更大的细菌图像样本量, 因为扩大的球形细菌更容易定位、定位和图像。这种提高收集数据的能力在几个方面是有价值的。首先, 它能够对多肽定位模式进行更系统的定量分析。虽然从较小的图像集可以证明质量趋势, 但只有大量高质量图像的样本集显示了本地化模式中更微妙的趋势, 如肽 translocates 与本地化的细胞百分比膜。此外, 能够更好地解决内部荧?...

披露声明

不声明利益冲突。

致谢

研究得到了国家过敏和传染性疾病研究所 (NIH-NIAID) 奖 R15AI079685 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Trizma hydrocloride (Tris HCl)SigmaT3253
Trizma base (Tris OH)SigmaT1503
Magnesium chlorideSigmaM8266
SucroseSigmaS7903
LysozymeSigmaL6876
Deoxyribonuclease ISigmaD4527
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma106361Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrateSigmaC4895
AmpicillinFisher ScientificBP1760
BBL Trypticase soy brothFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificCustom ordered
di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acidSigmaM0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Laser scanning confocal microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5 IIFor image acquisition
Leica Application Suite, Advanced FluorescenceLeica MicrosystemsFor image processing

参考文献

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