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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour produire des Gram négatif Escherichia coli (e.coli) sphéroplastes et Gram positif Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastes pour visualiser clairement et rapidement caractériser interactions peptide-bactéries. Cela fournit une méthode systématique pour définir la membrane localisation et translocation des peptides.

Résumé

L’utilisation de la microscopie confocale comme une méthode pour évaluer les modèles de localisation de peptide au sein de bactéries est généralement inhibée par les limites de résolution des microscopes légers classiques. Comme la résolution d’un microscope donnée ne peut être facilement améliorée, nous présentons des protocoles afin de transformer le petit bâtonnet Gram-négatif Escherichia coli (e. coli) et Gram-positives Bacillus megaterium (b. megaterium) en plus, facilement imagés des formes sphériques appellent sphéroplastes ou protoplastes. Cette transformation permet aux observateurs de rapidement et clairement déterminer si les peptides se loger dans la membrane bactérienne (c.-à-d., localisation de membrane) ou traversent la membrane pour entrer dans la cellule (c.-à-d., translocation). Avec cette approche, nous présentons aussi une méthode systématique pour caractériser les peptides comme membrane de localisation ou de translocation. Bien que cette méthode peut être utilisée pour une variété de peptides actifs membrane et souches bactériennes, nous démontrent l’utilité de ce protocole en observant l’interaction de Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobien (AMP), à e. coli sphéroplastes et b. megaterium protoplastes.

Introduction

Peptides antimicrobiens (ampères) ont attiré l’attention en raison de leur utilisation potentielle comme alternatives aux antibiotiques conventionnels1,2,3,4,5. Ampères tuent les bactéries soit translocation à travers la membrane cellulaire et en interaction avec des composants intracellulaires tels que les acides nucléiques ou de perméabiliser la membrane provoquer des fuites de cellule contenu6. Outre leur utilisation comme les antibiotiques, les ampères de translocation peut-être être adaptée pour les demandes de livraison de drogue parce qu’ils peuvent traverser sans interruption de la membrane cellulaire imperméable7,8. Nous, donc, chercher à comprendre les mécanismes fondamentaux d’AMP d’action pour jeter les bases pour leur utilisation dans la conception de médicaments.

Microscopie confocale offre un moyen d’évaluer les modèles de localisation des amplis fluorescent étiquetés dans des cellules bactériennes pour mieux comprendre leur mécanisme d’action9,10,11,12, 13 , 14. par marquage de la membrane des bactéries, on peut déterminer si un peptide fluorescent étiqueté se localise à la membrane ou l’espace intracellulaire d’une cellule bactérienne. Cependant, cette technique est limitée par la petite taille et la tige forme des bactéries, ce qui peut rendre difficile en raison des limites de résolution des microscopes lumière conventionnelles et l’orientation variable des bactéries sur la diapositive15d’imagerie.

L’objectif de la méthode présentée est de permettre d’améliorer la visualisation des modèles de localisation peptide fluorescent étiquetés à l’aide de la microscopie confocale. Visualisation est renforcée en tournant la petite, mince, en forme de bâtonnet Gram-négatif Escherichia coli (e. coli) et Gram-positives Bacillus megaterium (b. megaterium) bactéries dans des formes sphériques, élargies dénommé sphéroplastes (pour les souches Gram-négatifs) et protoplastes (pour les souches Gram positifs)16,17,18,19,20,21. Sphéroplastes et protoplastes sont plus faciles à l’image à cause de leur augmentation de la taille et leur forme symétrique, ce qui rend l’orientation d’une bactérie sur une lame non pertinents pour son imagerie. En outre, nous présentons une approche systématique pour analyser quantitativement les données de microscopie confocale afin de caractériser les amplis comme une membrane localisation ou de translocation. Application de ces méthodes rend plus facile à distinguer fluorescent étiqueté modèles de localisation de peptide. Les protocoles présentés ici peuvent servir à évaluer la localisation d’une variété de membrane active agents autres que les amplis, y compris les peptides de pénétration cellulaire.

Un avantage de cette technique est qu’il permet de mieux comprendre le mécanisme d’action des amplis sur le plan de cellule unique, qui peut révéler la hétérogénéité de cellule-à15, par opposition à d’autres essais de fluorescence communément utilisé pour identifier les mécanismes d’action des amplis, qui fournissent seulement en vrac estimations9,22,23,24,25. L’utilisation de sphéroplastes et de protoplastes afin d’évaluer l’entrée de cellule de AMP est notamment utile26 parce qu’ils sont plus physiologiquement pertinents15 que les autres modèles utilisés pour évaluer l’entrée de cellule, tels que les lipides vésicules24.

Protocole

1. préparation de la solution

NOTE : Préparer des solutions décrites aux étapes 1,1 et 1,9 et 1,8 – 1.11 afin de produire des sphéroplastes d’e. coli et b. megaterium protoplastes, respectivement.

  1. Préparer 1 M Tris-Cl, pH 7,8 en dissolvant 10,34 Tris HCl et 4,17 g de Tris OH dans 50 mL de dH2O dans un flacon de 125 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
  2. Préparer la solution A (20 mM MgCl2, 0,7 M de sucrose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) en dissolvant 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) et 11,98 g de saccharose (342.3 g/mol) à 25 mL dH2O dans une fiole de mL 125. Ajouter 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) et régler le volume à 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
  3. Préparer la solution B (10 mM MgCl2, 0,8 M de sucrose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissoudre 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) et 13,69 g de saccharose (342.3 g/mol) à 25 mL dH2O dans une fiole de mL 125. Ajouter 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) et régler le volume à 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
  4. Préparer 0,8 M de sucrose en dissolvant 13,69 g de saccharose (342.3 g/mol) dans 50 mL dH2O dans une fiole de mL 125. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
  5. Préparer la désoxyribonucléase 5 mg/mL j’ai (DNase j’ai) en dissolvant 0,015 g DNase I dans 3 mL de dH2O dans un ballon jaugé de 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané. Solution aliquote dans des microtubes et conserver à-20 ° C.
  6. Préparer l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,125 M, pH 8,0 en dissolvant disodium EDTA g 0,698 déshydrater (372.2 g/mol) dans 15 mL dH2O dans un flacon de 125 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
  7. Préparer 600 cephalexin µg/mL en dissolvant 0,03 g d’hydrate de la céfalexine (365.404 g/mol) dans 50 mL de dH2O dans un flacon de 125 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à 4 ° C.
  8. Préparer lysozyme de 5 mg/mL en dissolvant le lysozyme de 0,015 g dans 3 mL de dH2O dans un ballon jaugé de 50 mL. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané. Solution aliquote dans des microtubes et conserver à-20 ° C.
  9. Préparer 3 % p/v Trypticase Soy Broth (TSB) en dissolvant les 30 g de BST dans 1 L de dH2O dans un flacon de 2 L. Partie aliquote de la solution dans des fioles contenant 25 mL ou 100 mL du BST pour être utilisé dans la préparation des sphéroplastes d’e. coli ou les protoplastes megaterium b. , , respectivement. Flacons d’autoclave pour stériliser le milieu liquide. TSB stérile peut être conservé à température ambiante ou 4 ° C.
  10. Préparer la solution C (1 M de sucrose, maléate de 0,04 M, 0.04 M MgCl2, pH 6,5) en dissolvant 34,23 g de saccharose (342.3 g/mol), l’acide maléique 0,46 g (116.07 g/mol) et 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dans 100 mL de dH2O dans un ballon jaugé de 250 mL. Ajuster le pH à 6,5. Stériliser par filtration à travers un filtre de seringue 25 mm 0,2 µm de membrané et stocker dans un tube conique à température ambiante.
  11. Préparez 200 mL de milieu de protoplaste en mélangeant 100 mL 3 % p/v du BST et 100 mL solution C dans une bouteille de verre de 1 L. Autoclave pour stériliser la solution et stocker à température ambiante.

2. préparation de la Culture au jour le jour

Remarque : Effectuez les articles 2-4 à l’aide des techniques appropriées de stériles. Si vous le souhaitez, une souche bactérienne peut contenir un plasmide de résistance aux antibiotique réduire la contamination potentielle. Si vous utilisez une souche avec la résistance aux antibiotique, ajouter les antibiotiques nécessaires aux étapes 2.1, 3.1, 3.2 et 4.1-4.4.

  1. Préparer une culture durant la nuit en choisissant une seule colonie de bactéries à l’aide d’un embout de la pipette stérile et de le placer dans un tube à culture 14 mL contenant de 2 à 3 mL de 3 % p/v du BST. Incuber à 37 ° C, et en agitant pendant 16 à 21 h.

3. préparation des sphéroplastes Gram négatif Escherichia coli

  1. Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer la nuit culture au 1/100 dans 25 mL de 3 % p/v TSB et incuber la solution bactérienne à 37 ° C, et en agitant pendant environ 2,5 h, jusqu'à ce que la solution a atteint une densité optique de 0,5 à 0,8 à 600 nm. Mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre.
  2. Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer cette culture 01:10 à 30 mL de 3 % p/v TSB et incuber à 37 ° C, et en agitant pendant 2,5 h en présence de 60 cephalexin de µg/mL (347,4 g/mol) pour produire des filaments unicellulaires d’environ 50 – 150 µm de longueur , qui sont observables sous un grossissement de X 1 000, à l’aide d’un microscope optique (Figure 1 b).
  3. Récolter les filaments en centrifugeant la solution bactérienne à x 1 500 g, 4 ° C pendant 4 min. décanter et éliminer le surnageant, réservant le culot.
  4. Laver les filaments en ajoutant doucement 1 mL de 0,8 M de sucrose, en veillant à ne pas déranger le culot. Incuber pendant 1 min et puis jeter le liquide surnageant sans déranger le culot.
  5. Ajouter 150 µL de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL du lysozyme de 5 mg/mL, 30 µL de 5 mg/mL DNase I, ainsi que 120 µL de 0,125 M EDTA dans leurs respectifs afin de la pastille et incuber la solution à température ambiante pendant 10 min.
  6. Ajouter 1 mL de solution A progressivement pendant 1 min dans la solution préparée dans 3.5 à l’aide d’une micropipette tandis que doucement, agitant la solution à la main. Incuber la solution pendant 4 min à température ambiante.
  7. Mettre 7 mL de la solution B de 4 ° C en deux tubes coniques 15 mL. Ajouter une quantité égale de la solution préparée en 3,6 millions à chacun de ces deux tubes. Centrifuger la solution à 1 500 g, 4 ° C pendant 4 min.
  8. À l’aide d’une pipette sérologique, retirez soigneusement tous sauf 1–2 mL du surnageant sans déranger le culot. Resuspendre le culot de pipetage doucement et descendre à l’aide d’une micropipette P1000. Examinez-la pour voir la formation de sphéroplastes en observant l’échantillon à un grossissement de X 1 000, à l’aide d’un microscope optique (Figure 1).
  9. Stocker les sphéroplastes à-20 ° C pendant une semaine ou jusqu'à ce qu’ils ont passé par 3 cycles de gel-dégel.

4. préparation des protoplastes de Gram positif megaterium b.

  1. Dans un ballon jaugé de 250 mL, diluer la nuit culture 1 : 1 000 dans 100 mL de 3 % p/v TSB et incuber la solution bactérienne à 37 ° C, tout en agitant pendant environ 4,5 h, jusqu'à ce que la solution a atteint une densité optique de 0,9–1.0 à 600 nm. Mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre.
  2. Versez la culture liquide dans deux tubes conique de 50 mL et centrifuger à 2 000 x g, 4 ° C pendant 10 min.
  3. À l’aide d’une pipette sérologique, jeter le surnageant de deux tubes coniques. Resuspendre chaque culot dans 2,5 mL de milieu de protoplastes et combiner les solutions remises en suspension dans un tube conique unique. Distribuer la solution combinée de remises en suspension dans un flacon de 125 mL.
  4. Ajouter 1 mL de lysozyme de 5 mg/mL et incuber pendant 1 heure à 37 ° C, et en agitant.
  5. Surveiller la croissance des protoplastes sous un grossissement de x 1 000, à l’aide d’un microscope optique, notant toute irrégularité, tels que les bactéries qui apparaissent comme des tiges gonflées au lieu de sphères (Figure 2). À l’aide d’une pipette sérologique, transvaser la solution dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 2 000 x g, 4 ° C pendant 10 min.
  6. Éliminer le surnageant et remettre en suspension l’extrait concentré dans 5 mL de milieu de protoplastes. Stocker des protoplastes à-20 ° C pendant une semaine ou jusqu'à ce qu’ils ont passé par 3 cycles de gel-dégel.

5. préparation de la Solution de Peptide et Membrane colorant pour l’imagerie

  1. Solution de peptide
    1. Dans un tube à centrifuger enveloppé dans du papier d’aluminium, dissoudre 2 mg de FITC étiqueté BF2 P11A 800 µL dH2O. utilisation d’un peptide contenant au moins un résidu tryptophane afin de réaliser des mesures de concentration de protéine.
    2. Par spectrophotométrie, mesurer l’absorbance de la solution de peptide à 280 nm en triple exemplaire. Calculer la concentration de peptide en utilisant le coefficient d’extinction molaire pour le tryptophane (5 700/Mcm).
    3. Diluer la concentration de peptide dans dH2O à une concentration finale de 100 – 200 µM. entreposer dans un tube à centrifuger à-20 ° C enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière.
  2. Colorant de membrane
    1. Dans un tube à centrifuger, préparation d’un stock de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) en dissolvant 5 mg de di-8-ANEPPS en 843.3 µL de DMSO. Conserver à 4 ° C, enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière.
    2. Dans un tube à centrifuger, préparer 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS en ajoutant 3 µL de 10 mM di-8-ANEPPS à 997 µL DMSO. Stocker dans un tube à centrifuger à 4 ° C, enveloppé dans du papier d’aluminium pour protéger de la lumière.

6. visualisation des sphéroplastes d’e. coli et des protoplastes megaterium b. à l’aide de la microscopie confocale

  1. Pipetter 5 µL de sphéroplastes ou protoplastes sur une lame de verre revêtu de poly-L-lysine. Ajouter 2 µL de FITC étiqueté AMP (100 à 200 µM) à la diapositive et incuber pendant 3 min, abri de la lumière.
  2. Ajouter 1 µL de la membrane colorant di-8-ANEPPS (0,03 mM) dans la diapositive et incuber pendant 3 min, abri de la lumière. Couvrir avec une lamelle de verre et sceller avec le vernis à ongles.
  3. Allumer le laser confocal de microscope et argon. Ajuster le laser à argon pour 20 % de la puissance et de transmission de 20 %.
  4. Définissez les gammes de longueur d’onde d’émission de 499 – 532 nm et 670 – 745 nm pour le canal d’émission peptide marqué FITC et la membrane di-8-ANEPPS-étiqueté colorant d’émission canal, respectivement.
  5. Les protoplastes image ou sphéroplastes (Figure 1 et Figure 2) avec un objectif X 63. Utiliser des logiciels d’imagerie pour obtenir 8 bits, 512 x 512 composite z-empiler les images composées de 0,5 µm de tranches de l’intégralité des sphéroplastes ou des protoplastes.
    Remarque : Prendre un examen attentif pour réduire l’émission cordeau tout en imagerie de sphéroplastes et de protoplastes. Voir la discussion pour plus de détails.

7. caractérisation de la localisation de l’AMP

  1. Ouvrez l’image composite z-pile dans les logiciels d’imagerie. Repérez la tranche du centre-la plupart des sphéroplastes ou protoplaste et placez une région circulaire d’intérêt (ROI) (0,3 µm de diamètre) sur la membrane (1 ROI), un au centre des sphéroplastes ou protoplaste (retour sur investissement 2) et un de sphéroplastes ou protoplaste à mesurer la fluorescence de fond (3 ROI) (Figure 5). Éviter d’inclure des pixels saturés. L’intensité de fluorescence à chaque ROI peut être calculée par le logiciel d’imagerie.
    Remarque : Dans les instances lorsque peptide ne pas localiser à la totalité de la membrane, tirer les ROI 1 sur une surface de la membrane où le peptide est localisé.
  2. Utiliser l’équation suivante pour déterminer le ratio d’intensité de fluorescence du peptide intracellulaire à l’intensité de fluorescence de peptide membrane :
    figure-protocol-12764
    Remarque : L’intensité de fluorescence en ROI 3 est soustraite d’intensités de fluorescence en 2 de ROI et ROI 1 pour tenir compte de la fluorescence de fond.

Résultats

En agrandissant les bactéries et en les rendant sphérique, nous pouvons facilement distinguer peptides localiser à la membrane bactérienne ou déplacer facilement à travers la membrane bactérienne. Les limites de résolution des microscopes lumière conventionnelles rendent difficile de distinguer si les peptides signaux proviennent de la membrane ou l’espace intracellulaire chez les bactéries normales parce que les signaux localisées dans la membrane seront semblent se chevauch...

Discussion

Les protocoles présentés ici rendent possible pour les chercheurs d’obtenir plus rapidement grandes tailles d’échantillon d’images bactériennes parce que les bactéries sphériques, élargies sont beaucoup plus faciles à repérer, orienter et l’image. Cette capacité accrue pour recueillir des données est utile à plusieurs égards. Tout d’abord, elle permet une analyse quantitative plus systématique des schémas de localisation de peptide. Alors que les tendances qualitatives peuvent démontrer de plus ...

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts ne sont déclarés.

Remerciements

Recherche a été financée par l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID-NIH) prix R15AI079685.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Trizma hydrocloride (Tris HCl)SigmaT3253
Trizma base (Tris OH)SigmaT1503
Magnesium chlorideSigmaM8266
SucroseSigmaS7903
LysozymeSigmaL6876
Deoxyribonuclease ISigmaD4527
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma106361Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrateSigmaC4895
AmpicillinFisher ScientificBP1760
BBL Trypticase soy brothFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificCustom ordered
di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acidSigmaM0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Laser scanning confocal microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5 IIFor image acquisition
Leica Application Suite, Advanced FluorescenceLeica MicrosystemsFor image processing

Références

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