АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол производить грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) spheroplasts и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) протопласта четко визуализировать и быстро характеризуют пептид бактерии взаимодействий. Это обеспечивает систематический метод для определения мембраны локализации и translocating пептидов.

Аннотация

Использование confocal микроскопии в качестве метода для оценки пептид локализации шаблонов внутри бактерии обычно препятствует резолюции пределы обычных легких микроскопы. Как разрешение для данного Микроскоп невозможно укрепить легко, мы представляем протоколы для преобразования небольшой палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) в больших, легко фотосъемка сферической формы называют spheroplasts или протопласта. Это преобразование позволяет наблюдателям быстро и четко определить пептиды подать себя в бактериальной мембраны (то есть, мембраны локализации) или крест мембраны войти в камеру (например, translocating). С этим подходом мы также представляем систематический метод характеризовать пептидов как мембрана локализации или translocating. Хотя этот метод может быть использован для различных мембраны активных пептидов и бактериальных штаммов, мы продемонстрировать полезность настоящего Протокола путем наблюдать взаимодействие Buforin II P11A (BF2 P11A), антимикробного пептида (AMP), с E. coli Spheroplasts и B. megaterium протопласта.

Введение

Антимикробных пептидов (AMPs) получили внимание из-за их потенциального использования в качестве альтернатив обычные антибиотики1,2,3,4,5. Translocating через клеточную мембрану и взаимодействующих с внутриклеточных компонентов, таких как нуклеиновые кислоты или на permeabilizing мембрану, причиной утечки содержимого ячейки6ампер убивают бактерии. В дополнение к их использования как антибиотики translocating усилители могут быть адаптированы для доставки приложений наркотиков потому, что они могут-непредвиденное крест непроницаемой клеточной мембраны7,8. Мы, таким образом, стремятся понять фундаментальные AMP механизмы действий, чтобы заложить основы для их использования в конструкции снадобья.

Конфокальная микроскопия предлагает способ оценки локализации шаблонов дневно обозначенные усилителей в бактериальных клетках, обеспечивая понимание их механизм действий9,10,,11,12, 13 , 14. путем маркировки мембраны бактерий, можно определить, если дневно обозначенные пептид локализует мембраны или пространство внутриклеточных бактериальных клеток. Однако этот метод ограничен небольшой размер и стержня формы бактерий, которые могут сделать визуализации сложной из-за пределы резолюции обычных легких микроскопов и переменной ориентации бактерии на слайд15.

Цель представленных метода является возможность расширения визуализации дневно обозначенные пептид локализации шаблонов с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация является расширение, превратив маленький, тонкий, палочковидные грамотрицательные Escherichia coli (E. coli) и грамотрицательных Bacillus megaterium (B. megaterium) бактерий в расширенном, сферической формы, именуемый Spheroplasts (для грамотрицательных штаммов) и протопласта (для грамположительных штаммов)16,17,18,19,,2021. Spheroplasts и протопласта легче изображения из-за их увеличение размера и их симметричная форма, которая делает ориентации бактерии на слайде значения для своих изображений. Кроме того мы представляем систематический подход к количественно анализа данных confocal микроскопии для того чтобы характеризовать AMPs как либо мембраны, локализация или translocating. Применение этих методов делает его легче отличить дневно помечены пептид локализации шаблонов. Протоколы, представленные здесь может использоваться для оценки локализации разнообразных мембраны активных агентов помимо усилителей, включая пептиды, проникая в клетки.

Преимущество этой техники является, что он обеспечивает понимание механизма действия усилителей на уровне одной ячейки, который может выявить гетерогенности клеток в15, в отличие от других анализов флуоресценции, обычно используется для идентификации механизмы действия усилителей, которые обеспечивают только массовой оценки9,22,23,24,25. Использование spheroplasts и протопласта для того чтобы оценить AMP запись ячейки является особенно полезным26 потому, что они являются более физиологически соответствующих15 чем другие модели, используемые для оценки записи ячейки, например липидов везикулы24.

протокол

1. решение подготовка

Примечание: Подготовьте решения, описано в шагах, 1,1-1,9 и 1.8 – 1,11 для того чтобы произвести E. coli spheroplasts и B. megaterium протопласта, соответственно.

  1. Подготовка 1 М трис-Cl, pH 7,8, растворяя 10.34 g Tris-HCl и 4.17 г трис OH в dH2O в 125 мл флакон 50 мл. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
  2. Готовят раствор (20 мм MgCl2, 0,7 М сахарозы, 10 мм трис-Cl, pH 7,8) путем растворения 0.10 g MgCl2 (95.2 г/моль) и 11.98 г сахарозы (342.3 г/моль) в 25 мл dH2O в 125 мл флакон. Добавьте 500 мкл 1 М трис-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте громкость до 50 мл. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
  3. Подготовьте решение B (10 мм MgCl2, 0,8 М сахарозы, 10 мм трис-Cl, pH 7,8) путем растворения 0,05 г MgCl2 (95.2 г/моль) и 13.69 г сахарозы (342.3 г/моль) в 25 мл dH2O в 125 мл флакон. Добавьте 500 мкл 1 М трис-Cl (pH 7,8) и отрегулируйте громкость до 50 мл. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
  4. Подготовьте 0,8 М сахарозы, растворяя 13.69 г сахарозы (342.3 г/моль) в 50 мл dH2O в 125 мл флакон. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
  5. Подготовить 5 мг/мл дезоксирибонуклеаза я (DNase я), растворяя 0,015 г DNase I в 3 мл dH2O в 50 мл флакон. Стерилизуйте при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Аликвота решение в отцентрифугировать трубы и хранить при-20 ° C.
  6. Подготовить 0,125 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), рН 8,0, растворяя 0.698 g ЭДТА динатриевая дигидрат (372.2 г/моль) в 15 мл dH2O в 125 мл флакон. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
  7. Подготовка 600 мкг/мл цефалексин, растворяя 0,03 г гидрата цефалексин (365.404 г/моль) в 50 мл dH2O в 125 мл флакон. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при 4 ° C.
  8. Подготовьте 5 мг/мл лизоцима путем растворения 0,015 г лизоцима в 3 мл dH2O в 50 мл флакон. Стерилизуйте при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0,2 мкм. Аликвота решение в отцентрифугировать трубы и хранить при-20 ° C.
  9. Подготовка 3% w/v Trypticase соевый бульон (TSB), растворяя 30 g БСЭ в 1 Л dH2O в колбе 2 Л. Алиготе решение во флаконы, содержащие 25 мл или 100 мл TSB использоваться в подготовке E. coli spheroplasts или B. megaterium протопласта, , соответственно. Фляги автоклав для стерилизации жидкой среды. Стерильные TSB может храниться при комнатной температуре или 4 ° C.
  10. Подготовьте решение C (1 М сахарозы 0,04 М малеат, MgCl 0.04 M2, рН 6,5), растворяя 34.23 г сахарозы (342.3 г/моль), 0,46 г малеиновой кислоты (116.07 г/моль) и 0,38 g MgCl2 (95.21 г/моль) в 100 мл dH2O в 250 мл флакон. Отрегулируйте пэ-аш до 6,5. Стерилизуют при фильтрации через фильтр шприц 25 мм с мембраной 0.2 мкм и хранить в коническую пробирку при комнатной температуре.
  11. Подготовка 200 мл протопластов среднего путем смешивания 100 мл 3% w/v TSB и 100 мл раствора C в стеклянной бутылке 1 Л. Автоклав для стерилизации решение и хранить при комнатной температуре.

2. Подготовка ночь культуры

Примечание: Выполнение разделы 2-4 с использованием соответствующих методов стерильные. При желании, бактериальный штамм может содержать плазмиду для антибиотикорезистентности сокращения масштабов потенциального заражения. Если с помощью штамм с устойчивостью к антибиотикам, добавьте необходимые антибиотики в шагах 2.1, 3.1-3.2 и 4.1-4.4.

  1. Подготовьте на ночь культуры, выбирая один колонии бактерий с помощью стерильной пипеткой кончика и поместив его в пробирку культуры 14 мл, содержащих 2 – 3 мл 3% w/v TSB. Инкубируйте при 37 ° C, при встряхивании для 16 – 21 h.

3. Подготовка грамотрицательные E. coli Spheroplasts

  1. В 250 мл флакон разбавляют ночь культуры масштаба 1: 100 в объеме 25 мл 3% w/v TSB и инкубировать бактериальных решение при 37 ° C, при встряхивании примерно 2,5 часа, до тех пор, пока решение достиг оптическая плотность 0,5 – 0,8 на 600 Нм. Измерение оптической плотности, используя спектрофотометр.
  2. В 250 мл флакон разбавляют этот культуры 1:10 в 30 мл 3% w/v TSB и инкубировать при 37 ° C, при встряхивании для 2,5 ч присутствии 60 мкг/мл цефалексин (347.4 г/моль) для производства одноклеточного нити около 50 – 150 мкм в длину , которые наблюдаются при 1000-кратном с использованием световой микроскоп (рис. 1B).
  3. Урожай нити центрифугированием бактериальных решение на 1500 x g, 4 ° C на 4 мин Decant и отбросить супернатанта, резервируя гранулы.
  4. Вымойте нитей, осторожно добавив 1 мл 0,8 М сахарозы, стараясь не нарушить гранулы. Инкубировать в течение 1 мин, а затем удалить супернатант не нарушая гранулы.
  5. Добавить 150 мкл 1 М трис-Cl (рН 7,8), 120 мкл лизоцима 5 мг/мл, 30 мкл 5 мг/мл DNase я и 120 мкл 0,125 M ЭДТА в их соответствующих для Пелле и Инкубируйте решение при комнатной температуре в течение 10 мин.
  6. Добавьте 1 мл раствора A постепенно более 1 мин в раствор, приготовленный в 3.5 с помощью микропипеткой, в то время как нежно закрученного решение вручную. Инкубируйте решение для 4 мин при комнатной температуре.
  7. Положите 7 мл раствора B 4 ° C в два 15 мл конические трубы. Добавьте равное количество раствор, приготовленный в 3.6 для каждого из этих двух труб. Центрифуга решение на 1500 x g, 4 ° C на 4 мин.
  8. С помощью Серологические Пипетки, осторожно удалите все, кроме 1–2 мл супернатант не нарушая гранулы. Ресуспензируйте гранулы, мягко закупорить вверх и вниз с помощью P1000 микропипеткой. Визуально проверьте spheroplasts формирования, наблюдая выборки в 1000 кратном увеличении с помощью световой микроскоп (рис. 1 c).
  9. Магазин spheroplasts при-20 ° C до недели или до тех пор, пока они прошли через 3 циклов замораживания оттаивания.

4. Подготовка грамположительных B. megaterium протопластов

  1. В 250 мл флакон разбавляют ночь культуры 1:1,000 в 100 мл 3% w/v TSB и инкубировать бактериальных решение при 37 ° C, при встряхивании для приблизительно 4.5 ч до решения оптической плотности 0,9–и 1.0 на 600 Нм. Измерение оптической плотности, используя спектрофотометр.
  2. Налейте жидкость культуры два 50 мл конические трубы и центрифуги на 2000 x g, 4 ° C на 10 мин.
  3. С помощью Пипетки серологические, отбросить супернатант от обоих конические трубы. Ресуспензируйте каждой гранулы в 2,5 мл протопластов среднего и объединить однотрубные коническая ресуспензированы решения. Пипетка комбинированного ресуспензированы решения в 125 мл флакон.
  4. Добавьте 1 mL лизоцима 5 мг/мл и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C, при встряхивании.
  5. Контролировать рост протопласта под 1000 кратном увеличении с помощью световой микроскоп, отметив любые нарушения, такие как бактерии, которые появляются как опухшие стержней вместо сферах (рис. 2). С помощью Пипетки серологические, передать решение 15 мл Конические трубки и центрифуги на 2000 x g, 4 ° C на 10 мин.
  6. Декант супернатант и вновь приостановить гранулы в 5 мл протопластов СМИ. Хранить протопласта при-20 ° C до недели или до тех пор, пока они прошли через 3 циклов замораживания оттаивания.

5. Подготовка решения пептида и мембраны краситель для изображений

  1. Решение пептида
    1. В трубу отцентрифугировать, завернутые в фольгу растворяют 2 мг FITC помечены BF2 P11A 800 мкл dH2O. Использование пептида, содержащие по крайней мере один триптофан остатков с целью проведения измерения концентрации белка.
    2. Спектрофотометрически, измерения оптической плотности раствора пептида в 280 Нм в трех экземплярах. Вычислите концентрация пептида, используя коэффициент молярной вымирания для триптофана (5700/мкм).
    3. Разбавьте концентрация пептида в dH, которую2O до конечной концентрации 100 – 200 мкм. хранить в трубу отцентрифугировать при-20 ° C, завернутые в фольгу для защиты от света.
  2. Краситель мембраны
    1. В трубке отцентрифугировать Подготовьте 10 мм запас ди-8-ANEPPS (592.9 г/моль), растворяя 5 мг ди-8-ANEPPS в 843.3 мкл ДМСО. Хранить при 4 ° C, завернутые в фольгу для защиты от света.
    2. В трубке отцентрифугировать Подготовьте 1 мл 0,03 мм ди-8-ANEPPS путем добавления 3 мкл 10 мм ди-8-ANEPPS 997 мкл ДМСО. Хранить в трубу отцентрифугировать на 4 ° C, завернутые в фольгу для защиты от света.

6. Визуализация E. coli Spheroplasts и B. megaterium протопласта с помощью конфокальная микроскопия

  1. Пипетка 5 мкл spheroplasts или протопласта на слайд поли L-лизин стекла с покрытием. 2 мкл FITC помечены AMP (100-200 мкм) на слайд и Инкубируйте 3 мин, защищенном от света.
  2. 1 мкл мембраны краситель ди-8-ANEPPS (0,03 мм) на слайд и Инкубируйте 3 мин, защищенном от света. Крышка с coverslip стекла и печать с ногтей.
  3. Включите конфокальный лазерный микроскоп и аргон. Отрегулируйте Аргонового лазера мощностью 20% и 20% передач.
  4. Задайте диапазоны выбросов волны 499 – 532 нм и 670-745 Нм для FITC-меченых пептид выбросов канал и канал выбросов краситель ди-8-ANEPPS-меченых мембраны, соответственно.
  5. Протопласта изображения или spheroplasts (рис. 1 и рис. 2) с 63 X цели. Использование изображений программное обеспечение для получения 8-бит, 512 x 512 композитного z стек изображений состоящий из 0,5 мкм ломтика полностью сферопласт или протопластов.
    Примечание: Принять тщательного рассмотрения для уменьшения выбросов через кровь при визуализации spheroplasts и протопласта. Смотрите обсуждение для деталей.

7. характеристика AMP локализации

  1. Откройте изображение композитного z стека в визуализации программного обеспечения. Найдите центр большинство среза сферопласт или протопластов и место один круговой региона интерес (ROI) (0,3 мкм в диаметре) на мембраны (ROI 1), один в центре сферопласт или протопластов (ROI 2) и один от сферопласт или протопластов для измерения фон флюоресценция (ROI 3) (рис. 5). Избегайте включения насыщенных пикселей. Интенсивности флуоресценции в каждом ROI может рассчитываться путем визуализации программного обеспечения.
    Примечание: В случаях когда пептид не локализовать в объеме мембраны, нарисуйте ROI 1 на площади мембраны где локализуется пептида.
  2. Используйте следующее уравнение для определения коэффициента интенсивности флуоресценции внутриклеточных пептид интенсивности флуоресценции пептид мембраны:
    figure-protocol-11584
    Примечание: Интенсивности флуоресценции в ROI 3 вычитается из интенсивности флуоресценции в ROI 2 и ROI 1 для учета фона флуоресценции.

Результаты

Путем увеличения числа бактерий и делая их сферических, мы можно легко отличить пептиды локализовать бактериальной мембраны или легко перемещать через мембрану бактерий. Резолюции пределы обычных легких Микроскопы сделать это сложно отличить ли пептид сигналы возн?...

Обсуждение

Протоколы, представленные здесь сделать возможным для исследователей более быстро получить более крупные выборки бактериальных изображений, потому что увеличены, сферические бактерии являются гораздо проще найти, ориентации и изображения. Это расширение возможностей для сбора данн?...

Раскрытие информации

Отсутствие конфликта интересов объявляются.

Благодарности

Поддержка исследования осуществлялась в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (низ-NIAID) премии R15AI079685.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Trizma hydrocloride (Tris HCl)SigmaT3253
Trizma base (Tris OH)SigmaT1503
Magnesium chlorideSigmaM8266
SucroseSigmaS7903
LysozymeSigmaL6876
Deoxyribonuclease ISigmaD4527
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma106361Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrateSigmaC4895
AmpicillinFisher ScientificBP1760
BBL Trypticase soy brothFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificCustom ordered
di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acidSigmaM0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Laser scanning confocal microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5 IIFor image acquisition
Leica Application Suite, Advanced FluorescenceLeica MicrosystemsFor image processing

Ссылки

  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -. M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -. S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. . Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571 (2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

138permeabilization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены