Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para produzir Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) spheroplasts e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastas claramente Visualizar e caracterizar rapidamente interações de peptídeo-bactérias. Isso fornece um método sistemático para definir membrana localizando e se peptídeos.

Resumo

O uso da microscopia confocal como um método para avaliar padrões de localização de peptídeo dentro bactérias comumente é inibido nos limites de resolução de microscópios de luz convencionais. Como a resolução de um microscópio de determinado não pode ser facilmente reforçada, apresentamos os protocolos para transformar a pequena bacilares Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) em formas esféricas maiores, facilmente imagens chamado spheroplasts ou protoplastas. Esta transformação permite que os observadores rapidamente e claramente determinar se peptídeos apresentar-se na membrana bacteriana (ou seja, localização de membrana) ou atravessam a membrana para entrar na célula (ou seja, se). Com esta abordagem, também apresentamos um método sistemático de caracterização de peptídeos como membrana localizando ou se. Enquanto este método pode ser usado para uma variedade de peptídeos de membrana-ativo e cepas bacterianas, demonstramos a utilidade do presente protocolo, observando a interação de Buforin II P11A (BF2 P11A), um peptídeo antimicrobiano (AMP), com e. coli SPHEROPLASTS e b. megaterium protoplastas.

Introdução

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) ganharam atenção devido ao seu potencial uso como alternativas para os antibióticos convencionais^1,2,3,4,5. Amplificadores de matam as bactérias, ou se através da membrana celular e interagindo com componentes intracelulares, como os ácidos nucleicos ou por permeabilizing da membrana, causando vazamento de célula conteúdo⁶. Além de sua utilização como antibióticos, se AMPs pode ser adaptado para aplicações de entrega de dr

Protocolo

1. preparação da solução

Nota: Prepare soluções descritas nos passos 1.1 – 1.9 e 1.8 – 1.11 para produzir spheroplasts de e. coli e b. megaterium protoplastas, respectivamente.

1. Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 10,34 Tris HCl e 4,17 g de Tris OH em 50 mL de dH₂O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
2. Prepare a solução A 20 mM MgCl₂, 0,7 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 0,10 g MgCl₂ (95,2 g/mol) e sacarose g 11,98 (342.3

Resultados

Ampliando as bactérias e tornando-os esféricos, podemos facilmente distinguir peptídeos localizar à membrana bacteriana ou translocar prontamente através da membrana bacteriana. Os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais torná-lo desafiador para distinguir se o peptídeo sinais surgem da membrana ou espaço intracelular de bactérias normais porque sinais localizados na membrana aparecerá para coincidir com o espaço intracelular (Figura 3...

Discussão

Os protocolos aqui apresentados torná-lo viável para os investigadores mais rapidamente obter maiores tamanhos de amostra de imagens bacterianas porque as bactérias alargadas, esféricas são mais fáceis de localizar, orientar e da imagem. Melhorada a capacidade de coletar dados é valiosa em vários aspectos. Em primeiro lugar, permite uma análise quantitativa mais sistemática dos padrões de localização de peptídeo. Enquanto tendências qualitativas podem ser demonstradas de pequenos conjuntos de imagens, apen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma hydrocloride (Tris HCl)	Sigma	T3253
Trizma base (Tris OH)	Sigma	T1503
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Sucrose	Sigma	S7903
Lysozyme	Sigma	L6876
Deoxyribonuclease I	Sigma	D4527
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	106361	Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement
Cephalexin hydrate	Sigma	C4895
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760
BBL Trypticase soy broth	Fisher Scientific	B11768
BF2 P11A FITC	NeoScientific	Custom ordered
di-8-ANEPPS	Biotium	61012
DMSO	Sigma	34869	Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement
Maleic acid	Sigma	M0375
Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane	Pall Corporation	4192
Laser scanning confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5 II	For image acquisition
Leica Application Suite, Advanced Fluorescence	Leica Microsystems		For image processing