慢性血栓栓塞性肺动脉高压大型动物模型中急性右心衰竭的诱导和表型分析

摘要

我们提出了一种方案，用于在慢性肺动脉高压的大型动物模型中诱导和表型急性右心衰竭。该模型可用于测试治疗干预，开发右心指标或提高对急性右心衰竭病理生理学的理解。

摘要

慢性肺动脉高压 （PH） 背景下急性右心衰竭 （ARHF） 的发展与较差的短期结局相关。右心室的形态学和功能表型在 ARHF 患者血流动力学受损的背景下尤为重要。在这里，我们描述了一种在前面描述的大型动物模型中诱导ARHF的方法，并且使用金标准方法（即压力 - 体积PV环）和临床上可用的非侵入性方法（即超声心动图）对右心室功能进行动态，动态地进行右心室功能的表型。慢性PH首先通过左肺动脉结扎和右下叶栓塞与生物胶水诱导猪，每周一次，持续5周。16周后，ARHF通过使用生理盐水连续充血，然后反复肺栓塞诱导，直到收缩压与全身压力之比达到0.9或直到收缩期全身压力降至90 mmHg以下。多巴酚丁胺输注可恢复血流动力学（从2.5μg/kg/min至7.5μg/kg/min）。在每种情况期间进行PV环和超声心动图检查。每种情况需要大约40分钟的诱导，血流动力学稳定和数据采集。在9只动物中，2只在肺栓塞后立即死亡，7只完成了实验方案，这说明了模型的学习曲线。该模型诱导平均肺动脉压力增加3倍。PV-环分析显示，容量负荷后脑室-动脉耦合得以保留，急性肺栓塞后减少，多巴酚丁胺复位。超声心动图采集可以高质量地量化右心室形态和功能参数。我们在模型中发现了右心室缺血性病变。该模型可用于比较不同的治疗方法，或在ARHF的背景下验证右心室形态和功能的非侵入性参数。

引言

急性右心衰竭 （ARHF） 最近被定义为一种急进综合征，伴有右心室 （RV） 充盈受损和/或房车流量输出减少导致全身性充血¹。ARHF可能发生在几种疾病中，例如左侧心力衰竭，急性肺栓塞，急性心肌梗死或肺动脉高压（PH）。在 PH 病例中，ARHF 发病与 40% 的短期死亡或紧急肺移植风险相关^2，3，4。在这里，我们描述了如何在慢性肺动脉高压的情况下创建ARHF的大型动物模型，以及如何使用超声心动图和压力容积环评估右心室。

ARHF的病理生理学特征包括房车压力超负荷、容量超负荷、房车输出量减少、中心静脉压升高和/或全身压降低。在慢性 PH 中，尽管肺血管阻力增加，但 RV 收缩力最初增加，从而可以保留心输出量。因此，在慢性PHPH的ARHF背景下，右心室可以产生接近等系统的压力，特别是在正性肌力支持下。综上所述，ARHF对慢性PH值和使用正性肌力药物的血流动力学恢复导致急性RV缺血性病变的发展，正如我们最近在大型动物模型⁵中描述的那样。正性肌力药物的增加导致能量需求增加，可能进一步发展缺血性病变，并最终导致终末器官功能障碍的发展和不良的临床结果。然而，对于如何管理 PH 值的 ARHF 患者尚无共识，主要是关于液体管理、正性肌力药物和体外循环支持的作用。因此，急性右心衰竭的大型动物模型可能有助于提供ARHF临床管理的临床前数据。

作为量化对治疗反应的第一步，需要简单且可重复的方法来对右心室进行表型分析。迄今为止，对于如何更好地对ARHF患者的RV形态和功能进行表型尚未达成共识。评估房车收缩力（即内在收缩能力）和心室-动脉耦合（即，通过心室后负荷归一化收缩力;心室适应性指标）的金标准方法是分析压力-容积 （PV） 环路。这种方法是两次侵入性的，因为它需要右心导管插入术，并使用插入下腔静脉的球囊短暂减少RV前负荷。在临床实践中，需要非侵入性和可重复的方法来评估右心室。心脏磁共振 （CMR） 被认为是右心室无创评估的金标准。在重症监护病房 （ICU） 接受治疗的慢性 PH 型 ARHF 患者中，由于患者血流动力学状况不稳定，CMR 的使用可能受到限制。此外，每天多次（包括晚上）的重复CMR评估可能由于其成本和有限的可用性而受到限制。相反，超声心动图允许对ICU患者进行非侵入性，可重复和低成本的RV形态学和功能评估。

大型动物模型非常适合进行临床前研究，重点是侵入性血流动力学参数与非侵入性参数之间的关系。大型白猪的解剖结构接近人类。因此，人类中描述的大多数超声心动图参数在猪中是可以量化的。人心和猪心之间存在一些微小的差异，在超声心动图研究中必须考虑这些差异。猪表现为体性右心动过，心脏轴微逆时针旋转。结果，顶端4室视图变为顶端5室视图，声学窗口位于xiphoid阑尾下方。此外，胸骨旁长轴和短轴视图声学窗位于胸骨的右侧。

在这里，我们描述了一种在慢性血栓栓塞PH的大型动物模型中诱导ARHF并使用多巴酚丁胺恢复血流动力学的新方法。我们还报告了多巴酚丁胺血流动力学恢复后2-3小时内模型中存在的RV缺血性病变。此外，我们描述了如何在每种条件下获取RV PV环和超声心动图RV参数，从而提供有关RV形态和功能动态变化的见解。由于先前已经描述了慢性血栓栓塞PH的大型动物模型和PV环方法⁶，因此将简要介绍这些部分。此外，我们报告了超声心动图评估的结果，这些结果在猪模型中被认为可能很困难。我们将解释在模型中实现重复超声心动图的方法。

本研究中报道的ARHF对慢性PH的模型可用于比较不同的治疗策略。RV表型方法可用于模拟临床相关情况的其他大型动物模型，例如急性肺栓塞⁷，RV心肌梗死⁸，急性呼吸窘迫综合征⁹ 或与左心室衰竭相关的右心衰竭¹⁰ 或左心室机械循环支持¹¹。

研究方案

该研究符合国家医学研究学会的实验动物护理原则，并得到了玛丽·兰内隆格医院当地动物实验伦理委员会的批准。

1. 慢性血栓栓塞性PH值

1. 诱导慢性血栓栓塞PH，如前所述^6，12。
2. 简而言之，在约20公斤大白猪（sus scrofa）中诱导慢性血栓栓塞PH模型。在第0周（闭合心心包）通过左胸切开术进行左肺动脉结扎;并每周对右下肺动脉进行栓塞（每周0.2 mL至0.4 mL），使用由1 mL软组织胶（包括N-丁基-2-氰基丙烯酸酯和2 mL脂质造影剂（脂醇）组成的混合溶液，持续5周。
3. 在左肺动脉结扎时的第0周进行仇外切除术，以提高超声心动图的可行性。为此，在xiphoid过程前面进行4cm纵向切口。使用透热刀去除仇外过程。用跑步缝合线关闭皮下计划和皮肤。
4. 在第 10 周，使用上述相同方案（步骤 1.2），进行额外的右下叶肺栓塞。
5. 在最后一次右下叶栓塞术（第 16 周）后 6 周执行 ARHF 诱导（第 6 节）模型，以避免急性肺栓塞引起的急性右心病变。
   注意:可以使用其他大型动物模型进行右心衰竭，或者在慢性血栓栓塞PH模型中诱导其他病理状况。

2. 动物定位和导管放置

1. 如前所述进行全身麻醉⁶。
   1. 简单地说，让动物禁食12小时。然后肌内注射盐酸氯胺酮（30mg / kg）进行预用用。通过耳静脉静脉静脉推注芬太尼（0.005mg / kg），丙泊酚（2mg / kg）和西沙曲库铵（0.3mg / kg），并用7法国探针无选择性地插管猪。
   2. 通过吸入2%异氟醚，连续输注芬太尼（0.004mg / kg）和丙泊酚（3mg / kg）维持全身麻醉。
2. 全身麻醉诱导后，将猪放在背上，前腿稍微展开，以便获得胸骨旁超声心动图（第3节）。
3. 在放置无菌区域之前，将设备电极放在手臂和腿上（超声心动图，用于血流动力学采集的工作站）。
4. 使用Seldinger方法将8法鞘放入颈静脉^中13。
   1. 将 18 G （1.3 mm x 48 mm） 静脉导管引入颈静脉。
      1. 在残留物上方 2 cm 处的中线上以 45° 的方向进行经皮穿刺。
      2. 获得静脉反流后，将导丝插入导管（0.035英寸/ 0.089毫米，180厘米，倾斜）。
      3. 通过透视检查验证导丝是否正确放置在上腔静脉中，并将导丝上的8-法国护套置于上腔静脉中。
         注意:当导丝沿着脊柱的右缘穿过下腔静脉时，导丝被正确放置。
5. 对右股动脉血管进行分割，将充满液体的导管引入右股动脉进行连续体压监测，并将球囊扩张导管通过股静脉插入下腔静脉，如下所示。
   1. 在腹股沟处进行4厘米的横向切口。
   2. 放置贝克曼牵开器，并使用Debackey镊子和Metzenbaum剪刀分割股静脉和股动脉的前脸。
   3. 在直接视觉控制下将20 G导管放入股动脉中，并将其连接到带有充满液体的导管的一次性换能器，以获得连续的全身血压监测。
      注意:平均血压应持续高于60 mmHg。
   4. 使用18 G导管在透视控制下将导丝（0.035英寸/ 0.089 mm，180cm，倾斜）通过下腔静脉插入股静脉。
   5. 在荧光镜控制下，在心包内水平通过下腔静脉在导丝上插入球囊扩张导管。
6. 使用前后视图使用C型臂进行透视控制。将球囊的可见标记物放在隔膜水平正上方，置于透视控制下。放置球囊时取下导丝。
7. 在静脉扩张球囊导管周围缝制一个带有5.0聚丙烯单丝缝合线的钱包，以避免股静脉出血。

3. 超声心动图

1. 在动物定位和放置导管（第2节）后立即对仍在全身麻醉和机械通气的动物中进行超声心动图检查。
2. 在呼气末性呼吸暂停期间，以电影循环形式获取至少 3 个心脏周期的每个超声心动图视图。
3. 获取二维和组织多普勒模式下的所有视图。
4. 获取西腓特工艺下的顶端5室视图。
5. 获取胸骨右侧的胸骨旁短轴和长轴视图。
6. 使用连续和脉冲多普勒模式获取瓣膜流。
7. 获取外侧三尖瓣环以及侧侧和隔膜二尖瓣环的组织多普勒信号。
   注意:使用最新的人体超声心动图评估指南进行超声心动图采集和解释¹⁴。

4. 右心导管插入术

1. 在心脏回声（第 3 节）和获得压力-容积回路之前（第 5 节）进行右心导管插入术
2. 将 Swan-Ganz 导管连接到一次性换能器。
3. 将 Swan-Ganz 导管引入先前插入颈静脉的颈静脉 8 型法式鞘（第 2.4 节），并获得平均右心房、右心室和肺动脉压力。如果需要，将导管置于透视检查下。
   注意:检查充满液体的导管是否用盐水吹扫良好，并去除气泡以避免压力信号阻尼。
4. 将Swan-Ganz导管放入肺动脉后，按照制造商的说明使用热稀释法测量心输出量;同时测量心率以进行每搏量计算。
   1. 确保生理盐水在4°C，以避免高估心输出量。
   2. 将一次性传感器连接到 PV 回路工作站，以便实时采集来自充满液体的导管的压力。

5. 使用电导法采集压力体积回路

注:本节以前发布过¹⁵。

1. 在透视控制下将电导管引入右心室。
   1. 使用压力-体积回路的" 实时"采集来验证质量信号。
2. 激活足够的电极以获得最佳信号（即，具有生理形状的逆时针PV环路）。
3. 根据制造商的说明（血导率、平行体积、行程体积校准 = α 校准）跟进工作流程的压力和体积校准步骤。
   注意:使用Swan-Ganz导管的外部行程可以针对每种情况重复;而其他校准步骤只能执行一次。
4. 在气末呼吸暂停期间，在稳定状态和急性前负荷减少（即，下腔静脉急性闭塞）期间获得 PV 环家族。
5. 每种情况至少执行3次采集（稳定+IVC闭塞）。

6.通过容量和压力过载诱导急性右心衰竭（图1）。

1. 使用3步生理盐水输注（约2小时）诱导容量超负荷。
   1. 开始首次输注 15 mL/kg 生理盐水，并自由流动输注输出。
   2. 在每次输注结束后5分钟后进行测量（右心导管插入术，PV环和超声心动图）。
   3. 测量结束后立即开始第二次15 mL / kg的容量输注。
   4. 测量结束后立即开始第三次输注30 mL / kg盐水。
      注意:容量负荷可诱发血流动力学受损或肺水肿，具体取决于所使用的动物模型。在该模型中，容量负荷揭示了适应性反应，其特征在于增加心输出量，稳定的右心房压力和保留的脑室 - 动脉耦合。
      注意:如果呼吸或血流动力学耐受性差，可以停止容量负荷。
2. 通过反复性肺栓塞诱发压力过载。
   1. 在透视控制下，通过颈鞘将5个法国血管造影导管插入右下叶肺动脉。
   2. 用推注 0.15 mL 的混合溶液栓塞右下肺动脉，该混合溶液由 1 mL 软组织胶（包括 N-丁基-2-氰基丙烯酸酯和 2 mL 脂质造影剂组成）。用10毫升生理盐水冲洗导管。
   3. 栓塞后 2 分钟使用全身压力和肺动脉压力评估血流动力学反应。
   4. 每 2 分钟重复 0.15 mL 栓塞，直至血流动力学受损（即收缩压<90 mmHg 或收缩压肺压超过收缩期全身压比 >0.9）。
      注意:肺栓塞可诱发严重的血流动力学损害，有时不可逆，导致立即死亡。在开始栓塞步骤之前，准备好开始血流动力学支持（多巴酚丁胺方案或肾上腺素，以防循环停止）。准备好启动PV环路和超声心动图监测。由于这一步骤可能与严重的血流动力学损害有关，因此可以避免使用 Swan-Ganz 导管进行右心导管插入术，以便更快地开始多巴酚丁胺支持。

7. 用多巴酚丁胺诱导恢复全身血流动力学

1. 达到血流动力学受损并进行 PV 环和超声心动图采集后，以 2.5 μg/kg/min 开始多巴酚丁胺输注。
   注意:其他药物或治疗可以在此时开始。
2. 等待 10 至 15 分钟，以稳定血流动力学。
3. 进行右心导管插入术、PV 环和超声心动图采集。
4. 增加多巴酚丁胺输注的剂量至5μg/kg/min。
5. 等待15分钟，以获得血流动力学稳定并重复采集。
6. 重复右心导管插入术、PV 环和超声心动图采集。
7. 增加多巴酚丁胺输注剂量至7.5μg/kg/min。
   注意:可以开始其他剂量，药物或治疗。

8. 安乐死和心脏组织采集

1. 在方案结束时，使用振荡锯进行正中胸骨切开术。
2. 打开心包并注射氯化钾的致命溶液（0.2 g / kg）。
3. 收获心灵;选择左右心室自由壁的样本进行病理学和分子评估。
   注:以前曾报道过右心室病理评估和统计的方法⁵。

结果

可行性
我们描述了先前报道的大型动物CTEPH模型中连续9次ARHF诱导手术的结果⁵。该协议的持续时间约为6小时才能完成，包括麻醉诱导，安装，血管通路/导管放置，诱导容量/压力超负荷和血流动力学恢复，数据采集和安乐死。每种血流动力学条件需要大约40分钟才能实现疾病的诱导，血流动力学稳定和数据采集。

讨论

我们描述了一种在大型动物模型中模拟ARHF对慢性PH的主要病理生理学特征的方法，包括体积和压力超载以及多巴酚丁胺的血流动力学恢复。我们还报告了如何获取血流动力学和成像数据，以对方案期间产生的每种情况下右心室的动态变化进行表型分析。这些方法可以提供背景数据，以建立ARHF领域的未来研究方案，特别是关于流体管理和正性肌力支持。

诱导血流动力学损害是?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Radiofocus Introducer II	Terumo	RS+B80K10MQ	catheter sheath
Equalizer, Occlusion Ballon Catheter	Boston Scientific	M001171080	ballon for inferior vena cava occlusion
Guidewire	Terumo	GR3506	0.035; angled
Vigilance monitor	Edwards	VGS2V	Swan-Ganz associated monitor
Swan-Ganz	Edwards	131F7	Swan-Ganz catheter 7 F; usable lenghth 110 cm
Echocardiograph; Model: Vivid 9	General Electrics	GAD000810 and H45561FG	Echocardiograph
Probe for echo, M5S-D	General Electrics	M5S-D	Cardiac ultrasound transducer
MPVS-ultra Foundation system	Millar	PL3516B49	Pressure-volume loop unit; includes a powerLab16/35, MPVS-Ultra PV Unit, bioamp and bridge amp and cables
Ventricath 507	Millar	VENTRI-CATH-507	conductance catheter
Lipiodol ultra-fluid	Guerbet	306 216-0	lipidic contrast dye
BD Insyte Autoguard	Becton, Dickinson and Company	381847	IV catheter
Arcadic Varic	Siemens	A91SC-21000-1T-1-7700	C-arm
Prolene 5.0	Ethicon	F1830	polypropilene monofil