Inducción y fenotipado de la insuficiencia cardíaca derecha aguda en un modelo animal grande de hipertensión pulmonar tromboembólica crónica

Resumen

Presentamos un protocolo para inducir y fenotipar una insuficiencia cardíaca derecha aguda en un modelo animal grande con hipertensión pulmonar crónica. Este modelo se puede utilizar para probar intervenciones terapéuticas, para desarrollar métricas del corazón derecho o para mejorar la comprensión de la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca derecha aguda.

Resumen

El desarrollo de insuficiencia cardíaca derecha aguda (ARHF) en el contexto de la hipertensión pulmonar crónica (HP) se asocia con malos resultados a corto plazo. El fenotipado morfológico y funcional del ventrículo derecho es de particular importancia en el contexto del compromiso hemodinámico en pacientes con ARHF. Aquí, describimos un método para inducir ARHF en un modelo animal grande previamente descrito de PH crónica, y para fenotipar, dinámicamente, la función ventricular derecha utilizando el método estándar de oro (es decir, bucles pv de presión-volumen) y con un método no invasivo clínicamente disponible (es decir, ecocardiografía). La HP crónica se induce primero en cerdos por ligadura de la arteria pulmonar izquierda y embolia del lóbulo inferior derecho con pegamento biológico una vez a la semana durante 5 semanas. Después de 16 semanas, la ARHF es inducida por cargas sucesivas de volumen con solución salina seguida de embolia pulmonar iterativa hasta que la relación entre la presión pulmonar sistólica sobre la presión sistémica alcanza 0,9 o hasta que la presión sistémica sistólica disminuye por debajo de 90 mmHg. La hemodinámica se restaura con infusión de dobutamina (de 2,5 μg/kg/min a 7,5 μg/kg/min). Los bucles fotovoltaicos y la ecocardiografía se realizan durante cada afección. Cada condición requiere alrededor de 40 minutos para la inducción, la estabilización hemodinámica y la adquisición de datos. De 9 animales, 2 murieron inmediatamente después de la embolia pulmonar y 7 completaron el protocolo, que ilustra la curva de aprendizaje del modelo. El modelo indujo un aumento de 3 veces en la presión media de la arteria pulmonar. El análisis pv-loop mostró que el acoplamiento ventriculo-arterial se conservó después de la carga de volumen, disminuyó después de la embolia pulmonar aguda y se restauró con dobutamina. Las adquisiciones ecocardiográficas permitieron cuantificar parámetros ventriculares derechos de morfología y función con buena calidad. Se identificaron lesiones isquémicas del ventrículo derecho en el modelo. El modelo se puede utilizar para comparar diferentes tratamientos o para validar parámetros no invasivos de la morfología y función del ventrículo derecho en el contexto de la ARHF.

Introducción

La insuficiencia cardíaca derecha aguda (ARHF) se ha definido recientemente como un síndrome rápidamente progresivo con congestión sistémica resultante de un llenado deficiente del ventrículo derecho (RV) y/o una reducción de la producción de flujo de ^RV1. La ARHF puede ocurrir en varias afecciones, como insuficiencia cardíaca del lado izquierdo, embolia pulmonar aguda, infarto agudo de miocardio o hipertensión pulmonar (HP). En el caso de la HP, el inicio de la ARHF se asocia con un riesgo del 40% de mortalidad a corto plazo o trasplante pulmonar ^urgente2,3,4. Aquí, describimos cómo crear un modelo animal grande de ARHF en el contexto de la hipertensión pulmonar crónica y cómo evaluar el ventrículo derecho utilizando ecocardiografía y asas presión-volumen.

Las características fisiopatológicas de ARHF incluyen sobrecarga de presión de RV, sobrecarga de volumen, una disminución en la salida de RV, un aumento en la presión venosa central y / o una disminución en la presión sistémica. En la HP crónica, hay un aumento inicial en la contractilidad de RV que permite preservar el gasto cardíaco a pesar del aumento de la resistencia vascular pulmonar. Por lo tanto, en el contexto de arHF en la HP crónica, el ventrículo derecho puede generar presiones casi isosistémicas, particularmente bajo soporte inotrópico. En conjunto, la ARHF sobre la HP crónica y la restauración hemodinámica con inotropos conducen al desarrollo de lesiones isquémicas agudas de RV, como se describió recientemente en nuestro modelo animal ^grande5. El aumento de inotropos crea una mayor demanda energética que puede desarrollar aún más lesiones isquémicas y, finalmente, conducir al desarrollo de disfunción del órgano final y malos resultados clínicos. Sin embargo, no hay consenso sobre cómo manejar a los pacientes con ARHF en la HP, principalmente con respecto al manejo de líquidos, los inotropos y el papel del soporte circulatorio extracorpóreo. En consecuencia, un modelo animal grande de insuficiencia cardíaca derecha aguda puede ayudar a proporcionar datos preclínicos sobre el manejo clínico de la ARHF.

Como primer paso para cuantificar la respuesta a la terapia, se necesitan métodos simples y reproducibles para fenotipar el ventrículo derecho. Hasta la fecha, no hay consenso sobre cómo fenotipar mejor la morfología y función del RV de los pacientes con ARHF. El método estándar de oro para evaluar la contractilidad de RV (es decir, la capacidad intrínseca para contraerse) y el acoplamiento ventriculo-arterial (es decir, contractilidad normalizada por la poscarga ventricular; un índice de adaptación ventricular) es el análisis de los bucles de presión-volumen (PV). Este método es dos veces invasivo porque requiere cateterismo cardíaco derecho y una reducción transitoria de la precarga de RV utilizando un balón insertado en la vena cava inferior. En la práctica clínica, se necesitan métodos no invasivos y repetibles para evaluar el ventrículo derecho. La resonancia magnética cardíaca (CMR) se considera el estándar de oro para la evaluación no invasiva del ventrículo derecho. En pacientes con ARHF en PH crónica que se manejan en la unidad de cuidados intensivos (UCI), el uso de CMR puede ser limitado debido a la condición hemodinámica inestable del paciente; además, las evaluaciones repetidas de CMR, varias veces al día, incluso por la noche, pueden verse limitadas debido a su costo y disponibilidad limitada. Por el contrario, la ecocardiografía permite evaluaciones de morfología y función de RV no invasivas, reproducibles y de bajo costo en pacientes de UCI.

Los modelos animales de gran tamaño son ideales para realizar estudios preclínicos centrados en la relación entre parámetros hemodinámicos invasivos y parámetros no invasivos. La gran anatomía del cerdo blanco está cerca de los humanos. En consecuencia, la mayoría de los parámetros ecocardiográficos descritos en humanos son cuantificables en cerdos. Existen algunas variaciones menores entre el corazón humano y el corazón de cerdo que deben tenerse en cuenta para los estudios ecocardiográficos. Los cerdos presentan una dextrocardia constitucional y una rotación ligeramente en sentido contrario a las agujas del reloj del eje cardíaco. Como resultado, la vista apical de 4 cámaras se convierte en una vista apical de 5 cámaras y la ventana acústica está situada debajo del apéndice xifoide. Además, las ventanas acústicas paraesternales de eje largo y corto están situadas en el lado derecho del esternón.

Aquí, describimos un método novedoso para inducir ARHF en un modelo animal grande de PH tromboembólico crónico y para restaurar la hemodinámica utilizando dobutamina. También informamos lesiones isquémicas rv rv presentes en el modelo dentro de las 2-3 horas posteriores a la restauración hemodinámica con dobutamina. Además, describimos cómo adquirir bucles fotovoltaicos de RV y parámetros de RV ecocardiográficos en cada condición, proporcionando información sobre los cambios dinámicos en la morfología y función de RV. Como se describió previamente el modelo animal grande de PH tromboembólico crónico y los métodos ^pv-loop6, estas secciones se describirán brevemente. Además, se informaron los resultados de las evaluaciones ecocardiográficas que se consideran potencialmente difíciles en modelos porcinos. Explicaremos los métodos para lograr ecocardiográficos repetidos en el modelo.

El modelo de ARHF sobre la HP crónica reportado en este estudio se puede utilizar para comparar diferentes estrategias terapéuticas. Los métodos de fenotipado de RV pueden utilizarse en otros modelos animales de gran tamaño que imitan situaciones clínicamente relevantes como la embolia pulmonar ^aguda7, el infarto de miocardio de ^RV8, el síndrome de dificultad respiratoria ^aguda9 o la insuficiencia cardíaca derecha asociada a insuficiencia ventricular ^izquierda10 o soporte circulatorio mecánico ventricular ^izquierdo11.

Protocolo

El estudio cumplió con los principios del cuidado de animales de laboratorio según la Sociedad Nacional de Investigación Médica y fue aprobado por el comité de ética local para experimentos con animales en el Hospital Marie Lannelongue.

1. PH tromboembólico crónico

1. Inducir la HP tromboembólica crónica como se ha descrito ^{anteriormente6,12}.
2. Brevemente, inducir un modelo de HP tromboembólico crónico en alrededor de 20 kg de cerdos blancos grandes (sus scrofa). Realizar una ligadura de la ligadura de la arteria pulmonar izquierda a través de una toracotomía izquierda en la semana 0 (pericardio cerrado); y realizar semanalmente una embolización de la arteria pulmonar del lóbulo inferior derecho (0,2 mL a 0,4 mL por semana) con una solución mixta compuesta por 1 mL de pegamento de tejidos blandos incluyendo N-butil-2-cianoacrilato y 2 mL de colorante de contraste lipídico (lipiodol) durante 5 semanas.
3. Realizar una xifoïdectomía en la semana 0 en el momento de la ligadura de la arteria pulmonar izquierda para mejorar la viabilidad de la ecocardiografía. Para hacer esto, realice una incisión longitudinal de 4 cm frente al proceso xifoide. Retire el proceso de xifoides con un cuchillo de diatermia. Cierre el plan subcutáneo y la piel con una sutura de carrera.
4. Realice una embolia pulmonar adicional del lóbulo inferior derecho en la semana 10 utilizando el mismo protocolo explicado anteriormente (paso 1.2).
5. Realizar el modelo de inducción ARHF (sección 6) 6 semanas después de la última embolización del lóbulo inferior derecho (semana 16) para evitar lesiones cardíacas derechas agudas inducidas por embolias pulmonares agudas.
   NOTA: Se puede utilizar otro modelo animal grande de insuficiencia cardíaca derecha, o se pueden inducir otras afecciones patológicas en el modelo de HP crónico-tromboembólico.

2. Posicionamiento de animales y colocación de catéteres

1. Realizar anestesia general como se describió ^{anteriormente6}.
   1. Brevemente, deje que el animal ayune durante 12 h. Luego realice una inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina (30 mg / kg) para la premedicación. Realizar un bolo intravenoso de fentanilo (0,005 mg/kg), Propofol (2 mg/kg) y cisatracurio (0,3 mg/kg) por vía intravenosa a través de una vena del oído e intubar de forma no selectiva al cerdo con una sonda francesa de 7.
   2. Mantener la anestesia general con isoflurano al 2% inhalado, infusión continua de fentanilo (0,004 mg/kg) y propofol (3 mg/kg).
2. Después de la inducción de la anestesia general, coloque al cerdo boca arriba con las patas delanteras ligeramente extendidas para permitir la adquisición ecocardiográfica paraesternal (sección 3).
3. Coloque los electrodos del dispositivo en los brazos y las piernas (ecocardiógrafo, estación de trabajo para adquisiciones hemodinámicas) antes de la colocación de los campos estériles.
4. Coloque una vaina de 8 franceses en la vena yugular utilizando el método de ^Seldinger13.
   1. Introduzca un catéter intravenoso de 18 G (1,3 mm x 48 mm) en la vena yugular.
      1. Realizar una punción percutánea en la línea media a 2 cm por encima del manubrio con una orientación de 45°.
      2. Después de obtener un reflujo venoso, inserte un alambre guía en el catéter (0.035 pulgadas / 0.089 mm, 180 cm, en ángulo).
      3. Verifique la colocación correcta del alambre guía en la vena cava superior con fluoroscopia y deseche la vaina de 8 franceses en el alambre guía en la vena cava superior.
         NOTA: El alambre guía se coloca correctamente cuando pasa a través de la vena cava inferior a lo largo del borde derecho de la columna vertebral.
5. Realice una división de los vasos femorales derechos para introducir un catéter lleno de líquido en la arteria femoral derecha para un monitoreo continuo de la presión sistémica y un catéter de dilatación con balón en la vena cava inferior a través de la vena femoral de la siguiente manera.
   1. Realice una incisión transversal de 4 cm en la ingle.
   2. Coloque un retractor de Beckman y divida la cara anterior de la vena femoral y de la arteria femoral con una pinza Debackey y unas tijeras Metzenbaum.
   3. Coloque un catéter de 20 G en la arteria femoral bajo control visual directo y conéctelo a un transductor desechable con un catéter lleno de líquido para obtener un monitoreo continuo de la presión arterial sistémica.
      NOTA: La presión arterial media debe estar continuamente por encima de 60 mmHg.
   4. Use un catéter de 18 G para insertar un alambre guía (0.035 pulgadas / 0.089 mm, 180 cm, en ángulo) en la vena femoral a través de la vena cava inferior bajo control fluoroscópico.
   5. Inserte un catéter de dilatación con balón en el alambre guía a través de la vena cava inferior a nivel intrapericárdico bajo control fluoroscópico.
6. Realice el control fluoroscópico con un brazo en C utilizando una vista anteroposterior. Coloque los marcadores visibles del balón inmediatamente por encima del nivel del diafragma bajo control fluoroscópico. Retire el alambre guía cuando se coloque el globo.
7. Cose un bolso con una sutura de monofilamento de polipropileno 5.0 alrededor del catéter de balón de dilatación venosa para evitar el sangrado de la vena femoral.

3. Ecocardiografía

1. Realizar la ecocardiografía inmediatamente después del posicionamiento del animal y la colocación del catéter (sección 2) en animales aún bajo anestesia general y ventilación mecánica.
2. Adquiera cada vista ecocardiográfica en formato de bucle de cine durante al menos 3 ciclos cardíacos durante la apnea espiratoria final.
3. Adquiera todas las vistas en los modos Doppler de 2 dimensiones y tejido.
4. Adquiera la vista apical de 5 cámaras bajo el proceso xifoide.
5. Adquiera las vistas paraesternales de eje corto y largo en el lado derecho del esternón.
6. Adquirir flujo valvular utilizando modos Doppler continuo y pulsado.
7. Adquirir señales Doppler tisulares del anillo tricúspide lateral y del anillo mitral lateral y septal.
   NOTA: Utilice las últimas guías para la evaluación ecocardiográfica en humanos para adquisiciones e interpretaciones ^{ecocardiográficas14}.

4. Cateterismo cardíaco derecho

1. Realizar el cateterismo cardíaco derecho después del eco cardíaco (sección 3) y antes de las adquisiciones del asa presión-volumen (sección 5)
2. Conecte el catéter Swan-Ganz al transductor desechable.
3. Introducir el catéter Swan-Ganz en la vaina yugular 8-Francesa previamente insertada en la vena yugular (sección 2.4) y adquirir presiones medias de la arteria auricular derecha, ventricular derecha y pulmonar. Coloque el catéter bajo fluoroscopia si es necesario.
   NOTA: Verifique que los catéteres llenos de líquido estén bien purgados con solución salina y retire las burbujas de aire para evitar la amortiguación de la señal de presión.
4. Después de colocar el catéter Swan-Ganz en la arteria pulmonar, mida el gasto cardíaco con el método de termodilución según lo explicado por las instrucciones del fabricante; medir simultáneamente la frecuencia cardíaca para el cálculo del volumen sistólico.
   1. Asegúrese de que la solución salina esté a 4 °C para evitar la sobreestimación del gasto cardíaco.
   2. Conecte el transductor desechable a la estación de trabajo pv-loop para la adquisición en vivo de presiones derivadas de catéteres llenos de líquido.

5. Adquisición del bucle de volumen de presión utilizando el método de conductancia

NOTA: Esta sección ha sido publicada ^{anteriormente15}.

1. Introducir el catéter de conductancia en el ventrículo derecho bajo control fluoroscópico.
   1. Verifique la señal de calidad utilizando la adquisición " en vivo" de bucles presión-volumen.
2. Activar electrodos adecuados para obtener una señal óptima (es decir, bucles fotovoltaicos en sentido contrario a las agujas del reloj con forma fisiológica).
3. Seguimiento de los pasos de calibración de presión y volumen del flujo de trabajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (conductividad sanguínea, volumen paralelo, calibración del volumen sistólico = calibración alfa).
   NOTA: El accidente cerebrovascular externo con el catéter Swan-Ganz se puede repetir para cada condición; mientras que los otros pasos de calibración se pueden realizar una sola vez.
4. Adquirir familias de bucle PV en estados estables y durante la reducción aguda de la precarga (es decir, la oclusión aguda de la vena cava inferior) durante la apnea espiratoria final.
5. Realizar al menos 3 adquisiciones por condición (constante + oclusión IVC).

6. Inducción de insuficiencia cardíaca derecha aguda por sobrecarga de volumen y presión (Figura 1).

1. Inducir sobrecarga de volumen utilizando una infusión salina de 3 pasos (alrededor de 2 h).
   1. Comience la primera infusión de 15 ml/kg de solución salina con una salida de infusión de flujo libre.
   2. Realizar las mediciones (cateterismo cardíaco derecho, PV-loops y ecocardiográfico) 5 min después de la estabilización hemodinámica después del final de cada infusión.
   3. Inicie la segunda infusión de volumen de 15 ml/kg inmediatamente después del final de las mediciones.
   4. Comience la infusión de tercer volumen de 30 ml/kg de solución salina inmediatamente después del final de las mediciones.
      PRECAUCIÓN: La carga de volumen puede inducir compromiso hemodinámico o edema pulmonar dependiendo del modelo animal utilizado. En este modelo, la carga de volumen reveló una respuesta adaptativa caracterizada por el aumento del gasto cardíaco, la presión auricular derecha estable y el acoplamiento ventriculo-arterial preservado.
      NOTA: La carga de volumen se puede detener en caso de mala tolerancia respiratoria o hemodinámica.
2. Inducir sobrecarga de presión con embolia pulmonar iterativa.
   1. Inserte un catéter angiográfico francés 5 a través de la vaina yugular en la arteria pulmonar del lóbulo inferior derecho bajo control fluoroscópico.
   2. Embolizar la arteria pulmonar del lóbulo inferior derecho con un bolo de 0,15 mL de una solución mixta compuesta por 1 mL de pegamento de tejidos blandos incluyendo N-butil-2-cianoacrilato y 2 mL de colorante de contraste lipídico. Lave el catéter con 10 ml de solución salina.
   3. Evaluar la respuesta hemodinámica 2 minutos después de la embolización utilizando la presión sistémica y la presión arterial pulmonar.
   4. Repetir embolias de 0,15 ml cada 2 minutos hasta obtener compromiso hemodinámico (es decir, presión sistémica sistólica <90 mmHg o presión pulmonar sistólica sobre la relación de presión sistémica sistólica >0,9).
      PRECAUCIÓN: La embolia pulmonar puede inducir un compromiso hemodinámico grave, a veces irreversible, que conduce a la muerte inmediata. Antes de comenzar el paso de embolización, prepárese para comenzar el soporte hemodinámico (protocolo de dobutamina o epinefrina en caso de paro circulatorio). Prepárese para iniciar los bucles fotovoltaicos y el monitoreo ecocardiográfico. Como este paso puede estar asociado con un compromiso hemodinámico grave, se puede evitar el cateterismo cardíaco derecho con el catéter Swan-Ganz para comenzar el soporte de dobutamina antes.

7. Inducir la restauración de la hemodinámica sistémica con dobutamina

1. Después de alcanzar el compromiso hemodinámico y realizar bucles PV y adquisiciones ecocardiográficas, comience la infusión de dobutamina a 2,5 μg / kg / min.
   NOTA: Se pueden iniciar otros medicamentos o tratamientos en este momento.
2. Espere de 10 a 15 minutos para la estabilización hemodinámica.
3. Realizar cateterismo cardíaco derecho, PV-loops y adquisiciones ecocardiográficas.
4. Aumente la dosis de infusión de dobutamina a 5 μg/kg/min.
5. Espere 15 minutos para la estabilización hemodinámica y las adquisiciones repetidas.
6. Repetir el cateterismo cardíaco derecho, las asas PV y las adquisiciones ecocardiográficas.
7. Aumente la dosis de infusión de dobutamina a 7,5 μg/kg/min.
   NOTA: Se pueden iniciar otras dosis, medicamentos o tratamientos.

8. Eutanasia y recolección de tejido cardíaco

1. Al final del protocolo, realice una esternotomía mediana utilizando una sierra oscilante.
2. Abra el pericardio e inyecte una solución letal de cloruro de potasio (0,2 g/kg).
3. Cosecha el corazón; seleccionar muestras de las paredes libres del ventrículo derecho e izquierdo para evaluaciones patológicas y moleculares.
   NOTA: Los métodos para las evaluaciones patológicas del ventrículo derecho y para las estadísticas fueron reportados ^previamente5.

Resultados

Viabilidad
Describimos los resultados de 9 procedimientos consecutivos de inducción de ARHF en un modelo CTEPH de animales grandes previamente ^reportado5. La duración del protocolo fue de alrededor de 6 horas para completarse, incluyendo la inducción de anestesia, la instalación, el acceso vascular / colocación de catéteres, la inducción de sobrecarga de volumen / presión y la restauración hemodinámica, la adquisición de datos y la eu...

Discusión

Describimos un método para modelar las principales características fisiopatológicas de arHF en la HP crónica en un modelo animal grande que incluye sobrecarga de volumen y presión y restauración hemodinámica con dobutamina. También informamos cómo adquirir datos hemodinámicos y de imágenes para fenotipar los cambios dinámicos del ventrículo derecho en cada condición creada durante el protocolo. Estos métodos pueden proporcionar datos de fondo para construir futuros protocolos de investigación en el campo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Radiofocus Introducer II	Terumo	RS+B80K10MQ	catheter sheath
Equalizer, Occlusion Ballon Catheter	Boston Scientific	M001171080	ballon for inferior vena cava occlusion
Guidewire	Terumo	GR3506	0.035; angled
Vigilance monitor	Edwards	VGS2V	Swan-Ganz associated monitor
Swan-Ganz	Edwards	131F7	Swan-Ganz catheter 7 F; usable lenghth 110 cm
Echocardiograph; Model: Vivid 9	General Electrics	GAD000810 and H45561FG	Echocardiograph
Probe for echo, M5S-D	General Electrics	M5S-D	Cardiac ultrasound transducer
MPVS-ultra Foundation system	Millar	PL3516B49	Pressure-volume loop unit; includes a powerLab16/35, MPVS-Ultra PV Unit, bioamp and bridge amp and cables
Ventricath 507	Millar	VENTRI-CATH-507	conductance catheter
Lipiodol ultra-fluid	Guerbet	306 216-0	lipidic contrast dye
BD Insyte Autoguard	Becton, Dickinson and Company	381847	IV catheter
Arcadic Varic	Siemens	A91SC-21000-1T-1-7700	C-arm
Prolene 5.0	Ethicon	F1830	polypropilene monofil