Induzione e fenotipizzazione dell'insufficienza cardiaca destra acuta in un modello animale di ipertensione polmonare tromboembolica cronica

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per indurre e fenotipizzare un'insufficienza cardiaca destra acuta in un modello animale di grandi dimensioni con ipertensione polmonare cronica. Questo modello può essere utilizzato per testare interventi terapeutici, per sviluppare metriche cardiache giuste o per migliorare la comprensione della fisiopatologia acuta dell'insufficienza cardiaca destra.

Abstract

Lo sviluppo di insufficienza cardiaca destra acuta (ARHF) nel contesto dell'ipertensione polmonare cronica (PH) è associato a scarsi esiti a breve termine. La fenotipizzazione morfologica e funzionale del ventricolo destro è di particolare importanza nel contesto della compromissione emodinamica nei pazienti con ARHF. Qui, descriviamo un metodo per indurre ARHF in un modello animale di grandi dimensioni precedentemente descritto di PH cronico e al fenotipo, dinamicamente, funzione ventricolare destra usando il metodo gold standard (cioè loop PV pressione-volume) e con un metodo clinicamente disponibile non invasivo (cioè ecocardiografia). Il PH cronico viene indotto per la prima volta nei suini dalla legatura dell'arteria polmonare sinistra e dall'embolia del lobo inferiore destro con colla biologica una volta alla settimana per 5 settimane. Dopo 16 settimane, l'ARHF è indotto da un successivo carico di volume utilizzando soluzione salina seguita da embolia polmonare iterativa fino a quando il rapporto tra la pressione polmonare sistolica e la pressione sistemica raggiunge 0,9 o fino a quando la pressione sistemica sistolica diminuisce al di sotto di 90 mmHg. L'emodinamica viene ripristinata con l'infusione di dobutamina (da 2,5 μg/kg/min a 7,5 μg/kg/min). I loop fotovoltaici e l'ecocardiografia vengono eseguiti durante ogni condizione. Ogni condizione richiede circa 40 minuti per l'induzione, la stabilizzazione emodinamica e l'acquisizione dei dati. Su 9 animali, 2 sono morti subito dopo l'embolia polmonare e 7 hanno completato il protocollo, che illustra la curva di apprendimento del modello. Il modello ha indotto un aumento di 3 volte della pressione media dell'arteria polmonare. L'analisi PV-loop ha mostrato che l'accoppiamento ventricolo-arterioso è stato preservato dopo il carico di volume, diminuito dopo embolia polmonare acuta ed è stato ripristinato con dobutamina. Le acquisizioni ecocardiografiche hanno permesso di quantificare i parametri ventricolari giusti di morfologia e funzione con buona qualità. Abbiamo identificato lesioni ischemiche ventricolari destre nel modello. Il modello può essere utilizzato per confrontare diversi trattamenti o per convalidare parametri non invasivi della morfologia e della funzione ventricolare destra nel contesto dell'ARHF.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca destra acuta (ARHF) è stata recentemente definita come una sindrome rapidamente progressiva con congestione sistemica derivante da un riempimento ventricolare destro (RV) alterato e/o da una ridotta uscita del flusso ^RV1. L'ARHF può verificarsi in diverse condizioni come insufficienza cardiaca sinistra, embolia polmonare acuta, infarto miocardico acuto o ipertensione polmonare (PH). Nel caso del PH, l'esordio dell'ARHF è associato a un rischio del 40% di mortalità a breve termine o di trapianto polmonare ^urgente2,3,4. Qui, descriviamo come creare un grande modello animale di ARHF nel contesto dell'ipertensione polmonare cronica e come valutare il ventricolo destro usando l'ecocardiografia e i loop pressione-volume.

Le caratteristiche fisiopatologiche dell'ARHF includono il sovraccarico di pressione del camper, il sovraccarico del volume, una diminuzione della uscita del camper, un aumento della pressione venosa centrale e / o una diminuzione della pressione sistemica. Nel PH cronico, c'è un aumento iniziale della contrattilità del camper che consente di preservare la gittata cardiaca nonostante l'aumento della resistenza vascolare polmonare. Pertanto, nel contesto dell'ARHF sul PH cronico, il ventricolo destro può generare pressioni quasi isosistematiche, in particolare sotto supporto inotropo. Nel loro insieme, l'ARHF sul PH cronico e il ripristino emodinamico con inotropi portano allo sviluppo di lesioni ischemiche acute del RV, come recentemente descritto nel nostro modello animale di grandi ^dimensioni5. L'aumento degli inotropi crea un aumento della domanda energetica che può sviluppare ulteriormente lesioni ischemiche e infine portare allo sviluppo di disfunzioni dell'organo terminale e scarsi risultati clinici. Tuttavia, non vi è consenso su come gestire i pazienti con ARHF su PH, principalmente per quanto riguarda la gestione dei liquidi, gli inotropi e il ruolo del supporto circolatorio extracorporeo. Di conseguenza, un modello animale di grandi dimensioni di insufficienza cardiaca destra acuta può aiutare a fornire dati pre-clinici sulla gestione clinica dell'ARHF.

Come primo passo per quantificare la risposta alla terapia, sono necessari metodi semplici e riproducibili per fenotipare il ventricolo destro. Ad oggi, non c'è consenso su come migliorare il fenotipo della morfologia e della funzione del camper dei pazienti con ARHF. Il metodo gold standard per valutare la contrattilità RV (cioè la capacità intrinseca di contrarsi) e l'accoppiamento ventricolo-arterioso (cioè la contrattilità normalizzata dal postcarico ventricolare; un indice di adattamento ventricolare) è l'analisi dei loop pressione-volume (PV). Questo metodo è due volte invasivo perché richiede il cateterismo cardiaco destro e una riduzione transitoria del precarico RV utilizzando un palloncino inserito nella vena cava inferiore. Nella pratica clinica sono necessari metodi non invasivi e ripetibili per valutare il ventricolo destro. La risonanza magnetica cardiaca (CMR) è considerata il gold standard per la valutazione non invasiva del ventricolo destro. Nei pazienti con ARHF con PH cronico che sono gestiti in unità di terapia intensiva (ICU), l'uso di CMR può essere limitato a causa della condizione emodinamica instabile del paziente; inoltre, le valutazioni ripetute della CMR, più volte al giorno, anche di notte, possono essere limitate a causa del suo costo e della sua limitata disponibilità. Al contrario, l'ecocardiografia consente valutazioni morfologiche e funzionali del camper non invasive, riproducibili e a basso costo nei pazienti in terapia intensiva.

I modelli animali di grandi dimensioni sono ideali per eseguire studi preclinici incentrati sulla relazione tra parametri emodinamici invasivi e parametri non invasivi. La grande anatomia del maiale bianco è vicina agli umani. Di conseguenza, la maggior parte dei parametri ecocardiografici descritti nell'uomo sono quantificabili nei suini. Esistono alcune variazioni minori tra cuore umano e maiale che devono essere prese in considerazione per gli studi ecocardiografici. I maiali presentano una destrocardia costituzionale e una rotazione leggermente antiorario dell'asse cardiaco. Di conseguenza, la vista apicale a 4 camere diventa una vista apicale a 5 camere e la finestra acustica si trova sotto l'appendice xifoide. Inoltre, le finestre acustiche parasternali ad asse lungo e corto si trovano sul lato destro dello sterno.

Qui, descriviamo un nuovo metodo per indurre ARHF in un grande modello animale di PH tromboembolico cronico e per ripristinare l'emodinamica usando la dobutamina. Riportiamo anche lesioni ischemiche RV presenti nel modello entro 2-3 ore dal ripristino emodinamico con dobutamina. Inoltre, descriviamo come acquisire loop fotovoltaici RV e parametri RV ecocardiografici in ogni condizione fornendo approfondimenti sui cambiamenti dinamici nella morfologia e nella funzione del RV. Poiché il modello animale di grandi dimensioni del PH tromboembolico cronico e i metodi PV-loop sono stati precedentemente ^descritti6, queste sezioni saranno brevemente descritte. Inoltre, abbiamo riportato i risultati di valutazioni ecocardiografiche che sono ritenute potenzialmente difficili nei modelli suini. Spiegheremo i metodi per ottenere ecocardiografia ripetuta nel modello.

Il modello di ARHF sul PH cronico riportato in questo studio può essere utilizzato per confrontare diverse strategie terapeutiche. I metodi di fenotipizzazione RV possono essere utilizzati in altri modelli animali di grandi dimensioni che imitano situazioni clinicamente rilevanti come l'embolia polmonare ^acuta7, l'infarto miocardico ^RV8, la sindrome da distress respiratorio ^acuto9 o l'insufficienza cardiaca destra associata a insufficienza ventricolare ^sinistra10 o supporto circolatorio meccanico ventricolare ^sinistro11.

Protocollo

Lo studio è conforme ai principi della cura degli animali da laboratorio secondo la National Society for Medical Research ed è stato approvato dal comitato etico locale per gli esperimenti sugli animali presso l'ospedale Marie Lannelongue.

1. PH tromboembolico cronico

1. Indurre PH tromboembolico cronico come descritto in ^{precedenza6,12}.
2. In breve, indurre un modello di PH trombo-embolico cronico in circa 20 kg di suini bianchi di grandi dimensioni (sus scrofa). Eseguire una legatura della legatura dell'arteria polmonare sinistra attraverso una toracotomia sinistra alla settimana 0 (pericardio chiuso); ed eseguire settimanalmente un'embolizzazione dell'arteria polmonare del lobo inferiore destro (da 0,2 ml a 0,4 ml a settimana) con una soluzione mista composta da 1 mL di colla dei tessuti molli tra cui N-butil-2-cianoacrilato e 2 ml di colorante di contrasto lipidico (lipiodol) per 5 settimane.
3. Eseguire una xifoidectomia alla settimana 0 al momento della legatura dell'arteria polmonare sinistra per migliorare la fattibilità dell'ecocardiografia. Per fare questo, eseguire un'incisione longitudinale di 4 cm davanti al processo xifoide. Rimuovere il processo xifoide usando un coltello di diatermia. Chiudere il piano sottocutaneo e la pelle con una sutura in esecuzione.
4. Eseguire un'ulteriore embolia polmonare del lobo inferiore destro alla settimana 10 utilizzando lo stesso protocollo spiegato sopra (passaggio 1.2).
5. Eseguire il modello di induzione ARHF (sezione 6) 6 settimane dopo l'ultima embolizzazione del lobo inferiore destro (settimana 16) al fine di evitare lesioni cardiache acute destre indotte da embolie polmonari acute.
   NOTA: È possibile utilizzare altri modelli animali di grandi dimensioni di insufficienza cardiaca destra o altre condizioni patologiche possono essere indotte nel modello di PH cronico-tromboembolico.

2. Posizionamento degli animali e posizionamento del catetere

1. Eseguire l'anestesia generale come descritto in ^precedenza6.
   1. In breve, lascia che l'animale digiuni per 12 ore. Quindi eseguire un'iniezione intramuscolare di ketamina cloridrato (30 mg / kg) per la premedicazione. Eseguire un bolo endovenoso di fentanil (0,005 mg/kg), Propofol (2 mg/kg) e cisatracurio (0,3 mg/kg) per via endovenosa attraverso una vena dell'orecchio e intubare in modo non selettivo il maiale con una sonda francese 7.
   2. Mantenere l'anestesia generale con isoflurano al 2% inalato, infusione continua di fentanil (0,004 mg/kg) e propofol (3 mg/kg).
2. Dopo l'induzione dell'anestesia generale, posizionare il maiale sulla schiena con le zampe anteriori in una posizione leggermente dilatata per consentire l'acquisizione ecocardiografica parasternale (sezione 3).
3. Posizionare gli elettrodi del dispositivo sulle braccia e sulle gambe (ecocardiografo, postazione di lavoro per acquisizioni emodinamiche) prima del posizionamento dei campi sterili.
4. Posizionare una guaina 8-francese nella vena giugulare utilizzando il metodo ^Seldinger13.
   1. Introdurre un catetere IV da 18 G (1,3 mm x 48 mm) nella vena giugulare.
      1. Eseguire una puntura percutanea sulla linea di mezzo a 2 cm sopra il manubrio con un orientamento di 45°.
      2. Dopo aver ottenuto un reflusso venoso, inserire un filo guida nel catetere (0,035 pollici / 0,089 mm, 180 cm, angolato).
      3. Verificare il corretto posizionamento del filo guida nella vena cava superiore con fluoroscopia e smaltire la guaina 8-francese sul filo guida nella vena cava superiore.
         NOTA: Il filo guida è posizionato correttamente quando passa attraverso la vena cava inferiore lungo il bordo destro della colonna vertebrale.
5. Eseguire una divisione dei vasi femorali giusti per introdurre un catetere pieno di liquido nell'arteria femorale destra per un monitoraggio continuo della pressione sistemica e un catetere di dilatazione a palloncino nella vena cava inferiore attraverso la vena femorale come segue.
   1. Eseguire un'incisione trasversale di 4 cm all'inguine.
   2. Posizionare un divaricatore Beckman e dividere la faccia anteriore della vena femorale e dell'arteria femorale usando una pinza Debackey e forbici Metzenbaum.
   3. Posizionare un catetere da 20 G nell'arteria femorale sotto controllo visivo diretto e collegarlo a un trasduttore monouso con un catetere pieno di liquido per ottenere un monitoraggio sistemico continuo della pressione sanguigna.
      NOTA: La pressione sanguigna media deve essere continuamente superiore a 60 mmHg.
   4. Utilizzare un catetere da 18 G per inserire un filo guida (0,035 pollici / 0,089 mm, 180 cm, angolato) nella vena femorale attraverso la vena cava inferiore sotto controllo fluoroscopico.
   5. Inserire un catetere di dilatazione a palloncino sul filo guida attraverso la vena cava inferiore a livello intrapericardico sotto controllo fluoroscopico.
6. Eseguire il controllo fluoroscopico con un braccio a C utilizzando una vista anteroposteriore. Posizionare i marcatori visibili del palloncino immediatamente sopra il livello del diaframma sotto controllo fluoroscopico. Rimuovere il filo guida quando il fumetto è posizionato.
7. Cucire una borsa con una sutura monofilamento in polipropilene 5.0 attorno al catetere a palloncino di dilatazione venosa per evitare il sanguinamento dalla vena femorale.

3. Ecocardiografia

1. Eseguire l'ecocardiografia subito dopo il posizionamento dell'animale e il posizionamento del catetere (sezione 2) in animali ancora in anestesia generale e ventilazione meccanica.
2. Acquisire ogni vista ecocardiografica in formato cine loop per almeno 3 cicli cardiaci durante l'apnea espiratoria finale.
3. Acquisisci tutte le viste in modalità 2-dimension e Tissue Doppler.
4. Acquisire la vista apicale a 5 camere sotto il processo xifoide.
5. Acquisisci le viste parasternali dell'asse corto e lungo sul lato destro dello sterno.
6. Acquisire il flusso valvolare utilizzando le modalità Doppler continua e pulsata.
7. Acquisire segnali Doppler tissutali dell'anulus tricuspide laterale e dell'anulus mitrale laterale e settale.
   NOTA: utilizzare le più recenti linee guida per la valutazione ecocardiografica nell'uomo per acquisizioni e interpretazioni ecocardiografiche14.

4. Cateterizzazione cardiaca destra

1. Eseguire il cateterismo cardiaco destro dopo l'eco cardiaca (sezione 3) e prima delle acquisizioni del ciclo pressione-volume (sezione 5)
2. Collegare il catetere Swan-Ganz al trasduttore monouso.
3. Introdurre il catetere Swan-Ganz nella guaina giugulare 8-francese precedentemente inserita nella vena giugulare (sezione 2.4) e acquisire pressioni medie dell'arteria atriale destra, ventricolare destra e polmonare. Posizionare il catetere sotto fluoroscopia, se necessario.
   NOTA: Controllare che i cateteri riempiti di liquido siano ben spurgati con soluzione salina e rimuovere le bolle d'aria per evitare lo smorzamento del segnale di pressione.
4. Dopo aver posizionato il catetere Swan-Ganz nell'arteria polmonare, misurare la gittata cardiaca con il metodo di termodiluizione come spiegato dalle istruzioni del produttore; misurare contemporaneamente la frequenza cardiaca per il calcolo del volume dell'ictus.
   1. Assicurarsi che la soluzione salina sia a 4 °C per evitare sovrastima della gittata cardiaca.
   2. Collegare il trasduttore monouso alla stazione di lavoro PV-loop per l'acquisizione in tempo reale di pressioni derivate da cateteri riempiti di fluido.

5. Acquisizione del loop del volume di pressione utilizzando il metodo della conduttanza

NOTA: questa sezione è stata pubblicata in ^precedenza15.

1. Introdurre il catetere di conduttanza nel ventricolo destro sotto controllo fluoroscopico.
   1. Verificare il segnale di qualità utilizzando l'acquisizione " in tempo reale" di loop pressione-volume.
2. Attivare elettrodi adeguati per ottenere un segnale ottimale (cioè loop fotovoltaici in senso antiorario con forma fisiologica).
3. Seguire le fasi di calibrazione della pressione e del volume del flusso di lavoro secondo le istruzioni del produttore (conduttività del sangue, volume parallelo, calibrazione del volume della corsa = calibrazione alfa).
   NOTA: La corsa esterna con il catetere Swan-Ganz può essere ripetuta per ogni condizione; mentre le altre fasi di calibrazione possono essere eseguite una sola volta.
4. Acquisire famiglie PV-loop in stati stazionari e durante la riduzione acuta del precarico (cioè occlusione acuta della vena cava inferiore) durante l'apnea espiratoria finale.
5. Eseguire almeno 3 acquisizioni per condizione (occlusione costante + IVC).

6. Induzione di insufficienza cardiaca destra acuta da sovraccarico di volume e pressione (Figura 1).

1. Indurre un sovraccarico di volume utilizzando un'infusione salina in 3 fasi (circa 2 ore).
   1. Iniziare la prima infusione di 15 ml/kg di soluzione salina con un'uscita di infusione a flusso libero.
   2. Eseguire le misurazioni (cateterismo cardiaco destro, PV-loop ed ecocardiografia) 5 minuti dopo la stabilizzazione emodinamica dopo la fine di ogni infusione.
   3. Iniziare l'infusione del secondo volume di 15 ml/kg subito dopo la fine delle misurazioni.
   4. Iniziare l'infusione di terzo volume di 30 ml/kg di soluzione salina subito dopo la fine delle misurazioni.
      ATTENZIONE: Il carico di volume può indurre compromissione emodinamica o edema polmonare a seconda del modello animale utilizzato. In questo modello, il carico volumetrico ha rivelato una risposta adattativa caratterizzata da aumento della gittata cardiaca, pressione atriale destra stabile e accoppiamento ventricolo-arterioso preservato.
      NOTA: Il carico di volume può essere interrotto in caso di scarsa tolleranza respiratoria o emodinamica.
2. Indurre sovraccarico di pressione con embolia polmonare iterativa.
   1. Inserire un catetere angiografico francese 5 attraverso la guaina giugulare nell'arteria polmonare del lobo inferiore destro sotto controllo fluoroscopico.
   2. Embolizzare l'arteria polmonare del lobo inferiore destro con un bolo di 0,15 mL di una soluzione mista composta da 1 mL di colla dei tessuti molli tra cui N-butil-2-cianoacrilato e 2 mL di colorante di contrasto lipidico. Lavare il catetere con 10 ml di soluzione salina.
   3. Valutare la risposta emodinamica 2 minuti dopo l'embolizzazione utilizzando la pressione sistemica e la pressione dell'arteria polmonare.
   4. Ripetere embolie di 0,15 ml ogni 2 minuti fino ad ottenere la compromissione emodinamica (cioè pressione sistemica sistolica <90 mmHg o pressione polmonare sistolica sul rapporto di pressione sistemica sistolica >0,9).
      ATTENZIONE: L'embolia polmonare può indurre un grave compromesso emodinamico, a volte irreversibile, portando alla morte immediata. Prima di iniziare la fase di embolizzazione, essere pronti per iniziare il supporto emodinamico (protocollo dobutamina o epinefrina in caso di arresto circolatorio). Essere pronti ad avviare i pv-loop e il monitoraggio ecocardiografico. Poiché questo passaggio può essere associato a una grave compromissione emodinamica, il cateterismo cardiaco destro utilizzando il catetere Swan-Ganz può essere evitato in modo da iniziare prima il supporto alla dobutamina.

7. Indurre il ripristino dell'emodinamica sistemica con dobutamina

1. Dopo aver raggiunto la compromissione emodinamica ed aver eseguito loop fotovoltaici e acquisizioni ecocardiografiche, iniziare l'infusione di dobutamina a 2,5 μg/kg/min.
   NOTA: Altri farmaci o trattamenti possono essere avviati in questo momento.
2. Attendere da 10 a 15 minuti per la stabilizzazione emodinamica.
3. Eseguire cateterismo cardiaco destro, pv-loop e acquisizioni ecocardiografiche.
4. Aumentare la dose di infusione di dobutamina a 5 μg/kg/min.
5. Attendere 15 minuti per la stabilizzazione emodinamica e le acquisizioni ripetute.
6. Ripetere il cateterismo cardiaco destro, i loop fotovoltaici e le acquisizioni ecocardiografiche.
7. Aumentare la dose di infusione di dobutamina a 7,5 μg/kg/min.
   NOTA: Possono essere avviate altre dosi, farmaci o trattamenti.

8. Eutanasia e raccolta di tessuti cardiaci

1. Alla fine del protocollo, eseguire una sternotomia mediana utilizzando una sega oscillante.
2. Aprire il pericardio e iniettare una soluzione letale di cloruro di potassio (0,2 g/kg).
3. Raccogli il cuore; selezionare campioni delle pareti libere ventricolari destra e sinistra per valutazioni patologiche e molecolari.
   NOTA: I metodi per le valutazioni patologiche del ventricolo destro e per le statistiche sono stati precedentemente ^riportati5.

Risultati

Fattibilità
Descriviamo i risultati di 9 procedure consecutive di induzione ARHF in un modello CTEPH di grandi animali precedentemente ^riportato5. La durata del protocollo è stata di circa 6 ore per essere completata, compresa l'induzione dell'anestesia, l'installazione, l'accesso vascolare / posizionamento del catetere, l'induzione del sovraccarico di volume / pressione e il ripristino emodinamico, l'acquisizione dei dati e l'eutanasia. Ogni ...

Discussione

Descriviamo un metodo per modellare le principali caratteristiche fisiopatologiche dell'ARHF sul PH cronico in un modello animale di grandi dimensioni, tra cui sovraccarico di volume e pressione e ripristino emodinamico con dobutamina. Abbiamo anche riportato come acquisire dati emodinamici e di imaging per fenotipizzare i cambiamenti dinamici del ventricolo destro ad ogni condizione creata durante il protocollo. Questi metodi possono fornire dati di base per costruire futuri protocolli di ricerca nel campo dell'ARHF, in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Radiofocus Introducer II	Terumo	RS+B80K10MQ	catheter sheath
Equalizer, Occlusion Ballon Catheter	Boston Scientific	M001171080	ballon for inferior vena cava occlusion
Guidewire	Terumo	GR3506	0.035; angled
Vigilance monitor	Edwards	VGS2V	Swan-Ganz associated monitor
Swan-Ganz	Edwards	131F7	Swan-Ganz catheter 7 F; usable lenghth 110 cm
Echocardiograph; Model: Vivid 9	General Electrics	GAD000810 and H45561FG	Echocardiograph
Probe for echo, M5S-D	General Electrics	M5S-D	Cardiac ultrasound transducer
MPVS-ultra Foundation system	Millar	PL3516B49	Pressure-volume loop unit; includes a powerLab16/35, MPVS-Ultra PV Unit, bioamp and bridge amp and cables
Ventricath 507	Millar	VENTRI-CATH-507	conductance catheter
Lipiodol ultra-fluid	Guerbet	306 216-0	lipidic contrast dye
BD Insyte Autoguard	Becton, Dickinson and Company	381847	IV catheter
Arcadic Varic	Siemens	A91SC-21000-1T-1-7700	C-arm
Prolene 5.0	Ethicon	F1830	polypropilene monofil