第三星果蝇中枢神经系统活动的电生理记录

摘要

该协议描述了一种方法来记录果蝇中枢神经系统的电活动下降, 以实现对药理剂、神经蛋白基因突变的经济高效和方便的检测,和尚未探索的生理途径的作用。

摘要

目前可用的杀虫剂大多针对无脊椎动物神经蛋白的神经系统和基因突变, 往往会产生有害的后果, 然而目前记录个人神经系统活动的方法动物是昂贵和费力的。这种吸电极制剂制备的第三和第三世界星幼虫中枢神经系统,是一个可追踪的系统, 用于测试神经活性物质的生理效果, 确定各种神经的生理作用中枢神经系统活性的途径, 以及基因突变对神经功能的影响。这种体外制剂只需要适度的解剖技能和电生理专业知识, 就能产生昆虫神经元活动的重现性记录。然后, 包括多肽在内的多种化学调节剂可以直接应用于有生理盐水的溶液中的神经系统, 以测量对中枢神经系统活性的影响。此外, 基因技术, 如 GAL4/UAS 系统, 可以独立应用或与药理剂结合使用, 以确定特定离子通道、转运体或受体对节肢动物中枢神经系统功能的作用。在这种情况下, 本文所述的检测方法对杀虫剂毒理学家、昆虫生理学家和发育生物学家都有重要的意义, d . 黑色素瘤是其已建立的模型生物。该协议的目的是描述一种电生理方法, 以便能够测量模型昆虫果蝇的中枢神经系统的电发生, 这对于测试多种科学假设。

引言

这种方法的总体目标是使研究人员能够快速测量模型昆虫果蝇中枢神经系统 (cns) 的电成因. 该方法可靠、快速、经济高效, 可进行生理和毒理学实验.中枢神经系统是生命所必需的, 因此, 在理解或改变神经功能的过程中, 对适当神经功能至关重要的生理途径已被广泛探索。节肢动物中枢神经系统内信号通路的特性使得发现了几种化学杀虫剂, 这些杀虫剂扰乱无脊椎动物的神经功能, 以诱发死亡率, 同时限制目标外的后果。因此, 测量昆虫神经活动的能力对昆虫毒理学和生理学领域非常感兴趣, 因为神经系统是大多数已部署杀虫剂¹的目标组织。然而, 昆虫神经系统基础知识和应用知识的持续增长需要先进的神经生理技术, 这些技术的可行性有限, 因为目前的技术是劳动密集型的, 需要高昂的费用, 昆虫神经细胞系有限, 或对大多数节肢动物的中央突触的访问有限。目前, 大多数昆虫神经蛋白的特性要求对目标进行克隆, 并在随后的药物发现和电生理记录中异种表达, 如昆虫内整流钾通道2所述, 昆虫神经胺受体³, 蚊虫电压敏感 k⁺通道⁴, 等。为了满足异源表达的需求和低功能表达的可能性, bloomquist 和他的同事们的目的是诱导培养的 spopoptera (sf21) 细胞中的神经元表型, 作为一种新的方法。杀虫剂发现^5,6。这些方法为新化学的发展提供了有效的方法, 但它们往往为药理剂的鉴定、杀虫剂抗药性的识别机制和特性的表征创造了不可逾越的瓶颈基本的生理原理。在这里, 我们描述了一种外体内方法, 它能够记录一种具有可塑性遗传学^{7、8、9 和}已知神经表达模式的模型昆虫的电活动复合^{物 10,11, 12,以便}能够表征神经水平的阻力机制, 新开发的药物的作用方式, 和其他毒理学研究。

果蝇 d . 黑色素瘤是定义昆虫神经系统或杀虫剂作用机理的常用模型生物, 已被确立为适合毒理学^{研究的模型生物}13, 药理学 14 ¹⁵、^神经生理学¹⁶和病理生理学^17,18, 19^,20个过程的脊椎动物。d. 黑色素瘤是一种全代谢昆虫, 它进行完全的蜕变, 包括幼虫和木偶阶段, 才到达生殖成虫阶段。在整个发育过程中, 神经系统在不同的生命阶段经历了重大的重塑, 但幼虫中枢神经系统将是这一方法的重点。完全发育的幼虫中枢神经系统是解剖简单的胸腔和腹部段融合并形成腹侧神经节, 这代表了一系列重复的和几乎相同的神经元单位 21^,22。下移运动神经来源于食管下神经节的尾端, 并下降到神经的身体壁肌肉和幼虫的内脏器官。图 1描述了幼虫嗜酸性粒细胞的大体解剖。

嗜酸性粒血脑屏障 (bbb) 在胚胎发生结束时发展, 由会阴间胶质细胞 (spg)²¹形成。spg 细胞形成了许多类似丝状的过程, 扩散到建立一个连续的, 非常平坦的, 内皮样的片, 涵盖整个嗜酸性粒细胞cns²³。五合子bbb 与脊椎动物 bbb 有相似之处, 其中包括通过控制营养物质和异种生物进入 cns 21 来保持神经微环境的稳态.这是可靠的神经传递和功能的先决条件, 然而 bbb 对中枢神经系统的保护限制了合成药物、大多数肽和其他异生物的渗透 24^{,25, 这}引入了潜在的潜力小分子调制器的优点时存在的问题。该方法使用一个简单的横截面来破坏这个屏障, 并提供随时的药理访问中央突触。
所述方法的最大优点是该系统固有的简单性、可重现性和相对较高的吞吐量。该协议相对容易掌握, 设置所需的空间很少, 只需要最初的财政投入, 这将减少到试剂和消耗品。此外, 所描述的方法是完全修正, 以记录家庭苍蝇的中央下降神经活动, 家蝇 26 .

研究方案

1. 设备和材料

1. 准备电生理钻机所需的组件 (见材料表), 以对五血子核细胞进行吸电极记录。
   注: 在实验之前, 有必要建造用于解剖五丁宁管的室, 并在录音过程中用于在盐水中沐浴神经节。下面提供了箱体结构的逐步轮廓。
2. 准备幼虫室。
   1. 用热板融化黑蜡。
   2. 将2毫升的熔融蜡倒进最大体积为 2-2.5 ml 的腔中。
   3. 让蜡冷却和硬化约2小时。
   4. 使用剃须刀片在硬化蜡上雕刻一个孔, 其体积为 500μl, 其表面积约为 0.5 cm 2, 深度约为0.25 厘米^.

2. 设备和软件配置

注: 细胞外记录的设置简要说明如下。

1. 准备解剖和记录设备。
   1. 将组织制备、显微镜、吸力电极、微机械手、光源放置在法拉第保持架内, 以减少噪音并消除多余的电场 (图 2)。
   2. 将 (最好是焊丝) 接地和正导线连接到分别连接到浴缸和微电极支架的屏蔽鳄鱼夹上。
      注: 焊接和暴露的电线可以用铝箔覆盖, 以减少噪音。
   3. 将接地线和正线连接到 ac/dc 差分放大器的输入 1.
   4. 通过将数据采集系统的输入1的 bayonet neill-concelman (bnc) 电缆连接到放大器的通道1输出, 将数据采集系统连接到 ac/dc 差分放大器。
      注: 建议在数据采集软件和放大器之间加入 50/60 hz 噪声消除器。需要使用 bnc t 型连接器。
   5. 如果需要, 通过将音频监视器的输入1连接到数据采集软件的输入 1, 将音频监视器包含到设置中。
   6. 用盐水填充10毫升注射器, 并将其连接到电极支架的压力端口。
      注: 确保注射器、ag/agcl 颗粒和电极开口之间不存在气泡。
2. 准备用于解剖和录制的软件。
   注: 软件设置方法的大纲基于材料表中列出的采集/分析软件, 该软件将对原始电气输出进行数字化, 并将数据转换为峰值频率。但是, 可以使用其他软件, 也可以使用多个记录转换。
   1. 打开获取/分析软件。
   2. 点击主工具栏中的 "设置", 然后选择 "通道设置", 这将打开一个对话框。
   3. 将总通道数减少到三个。
   4. 对于通道 1, 选择 100 mv 的范围。
   5. 对于通道 2, 单击将打开下拉菜单的 "计算" 选项卡。选择 "循环测量", 这将打开第二个对话框。
   6. 选择通道1作为源。然后在下拉菜单测量中, 选择事件时的单位峰值。最后, 在检测设置区域中, 从下拉菜单中选择简单阈值。
   7. 要将电活动转换为以赫兹表示的速率图,^必须在算术模式下设置第三个通道: 在输入窗口中, 键入 "1000*smoothsec(ch2,2)"。然后选择作为单位下拉菜单赫兹。
      注: 成功的录音可以用多个不同的录音设置进行, 但 "事件中的单位尖峰和简单的阈值" 可能是最简单的, 因为它允许为每个人调整背景活动以上的阈值记录。在 "自定义源输入" 设置下的录制可提高数据的重现性, 前提是录制之间的后台活动没有差异。
   8. 关闭对话框以返回主屏幕。y 轴应该用赫兹表示, x 轴应该用时间表示。

3. 幼虫嗜酸性粒细胞的解剖和制备

注: 幼虫中枢神经系统解剖的方法在 hafer 和调度²⁷中有清晰的说明, 但这些先前公布的方法减少了对测量尖峰频率很重要的下降神经元的长度。在这里, 概述了一个额外的方法来切除幼虫中枢神经系统, 保持长, 完整的下降神经元。

1. 盐水准备。
   1. 在 mm^{28 中}准备对以下物质的解剖和记录生理盐水: 157 氯化钠, 3 kcl, 2 cacl₂, 4 2-[4-(2-羟乙基) 哌嗪-1-乙基] 乙氨酸 (hepes);滴定 ph 值为7.25。
2. 解剖幼虫嗜酸性粒细胞。
   1. 识别并从培养小瓶中提取一个流浪的第三层果蝇, 并将其放入200μl 的生理盐水中 (图 3 a)。
   2. 用一双细钳抓住嘴钩, 用第二双钳子抓住的腹部 (图 3b)。
      注意: 不要对腹部施加太大的压力, 因为这会导致磁石的薄角质层撕裂。
   3. 轻轻拉口钩和腹部向不同的方向, 将的尾端与头部区域分开, 露出的内脏 (图 3 c)。
      注: 中枢神经系统将与气管和消化道交织在一起。不要将中枢神经系统从任何组织中切断, 以防止切断下降的外周神经。
   4. 用钳子将中枢神经系统从消化道和气管中取出 (图 3d)。
   5. 如有必要, 用 vannas 弹簧剪刀手动横切脑叶后的中枢神经系统, 破坏血脑屏障。
      注: 这应该根据所使用的化学品的物理化学特性来进行。图 4 a中的红线是建议的横截面点和横截面的中枢神经系统, 具有完整的下降外周神经干, 如图 4 b 所示。在完成步骤3.2.5 后, 横切的中枢神经系统已准备好进行实验。

4.果蝇中枢神经系统的细胞外记录。

1. 准备中枢神经系统进行记录。
   1. 将玻璃移液器电极从硼硅酸盐玻璃毛细血管拉到 5-15 mω的电阻。
   2. 将横切的中枢神经系统插入含200μl 盐水的蜡室。夹紧未涂布的昆虫引脚, 将鳄鱼夹焊接到地线上, 并将销钉插入盐水中以完成电路。
   3. 使用微机械手, 将电极定向到横切的中枢神经系统的尾端。在接触外周神经干之前, 通过调整采集/分析软件中的阈值水平来消除背景噪声的记录。
   4. 通过对注射器施加轻微的负压, 将任何方便的外周神经绘制到吸入电极中。
      注: 基线发射频率与被吸引到电极中的神经元数量相关, 在电极中, 更多的神经元经常会导致电极的电阻增加。
2. 开始中枢神经系统降低神经活动的细胞外记录。
   1. 在数据采集软件上开始记录, 并监控基准发射频率。在收集基准发射速率数据之前, 允许射击速率平衡5分钟。
   2. 如果控制处理的发射模式不是类似于图 5a所示的爆裂模式, 则放弃准备和记录。
      注: 射击模式的改变表明中央模式生成器的活动异常或不稳定, 这可能会改变神经功能。
   3. 5分钟后, 加入200μl 的盐水 + 车辆, 使室内总体积达到 400μl, 开始记录控制射击速率。
   4. 建立基线后 (3-5分钟), 提取200μl 的盐水, 并添加在盐水中溶解的实验剂200μl。
      注: 二甲基亚硫醚 (dmso) 是亲脂性化合物的推荐溶剂, 不应超过 0.1% v/ v.
   5. 以连续的方式应用药物浓度 (低至高浓度), 并在选定的时间内记录每个浓度 (由调查人员^{根据药物的}化学特性确定 29)。在采集分析软件中标注这一药物应用时间点, 包括药物和最终浓度的注释。
      注: 氯化萘的射击活动在解剖后30-50 后将下降约 10-20, 因此, 应进行适当的未经治疗的控制, 药物治疗不应超过这一时间段。
3. 分析数据。
   注: 可以对收集到的数据进行多重分析, 例如动作电位^{爆发 29}的变化、尖峰波形振幅和时间过程, 以及确定药物治疗后的平均尖峰频率 26^,30,31,32. 最常见的是确定药物在规定时间内对平均尖峰频率的影响, 详情如下。
   1. 通过选择整个感兴趣的区域 (即药物治疗时间段) 来计算平均尖峰频率, 并通过位于获取/分析的主工具栏上的 "datapad" 自动确定平均尖峰频率软件。
   2. 确定药物治疗后中枢神经系统的平均尖峰频率为车辆控制的平均尖峰频率 (基线)。计算药物治疗后的射击率变化百分比的公式: (治疗频率/基线频率) x100。
   3. 使用每个浓度的平均尖峰频率或控制发射百分比, 用标准的图形软件构造浓度响应曲线。
   4. 执行统计分析 (例如,未配对t-测试), 以确定时间点、浓度或药物治疗之间的重要性。
      注: 生成和分析集中响应曲线有两种主要方法。第一种方法是每个单独的制剂一个浓度。在这里, 单浓度的峰值率被归一化为基线峰值率的每个制剂。由于记录时间缩短, 减少了准备工作的好处, 而陷阱增加了解剖时间, 因为这种方法将包括每个浓度5-7 个单独的 cns 制剂, 以及平均数据上更大的误差条设置。第二种方法是每个单独制剂的多个浓度。在这里, 每3-5 浓度的峰值率被归一化为相同的基线峰值率。其好处是, 对药物浓度的复制物的解剖时间较少, 变异性较小, 而陷阱是快速作用药物的要求和以前药物浓度治疗对随后的化学治疗的未知影响。

结果

使用具有一致重现性的细胞外抽吸电极可以记录会角内神经下降引起的外周神经的自发活动。切除和横切的食心细胞壳体的自发活动产生了一种循环模式, 以1-2 秒的发射爆发, 约为1秒的近静止活动。例如, 中枢神经系统在 0.5-1 s 时接近静止 (1-2 hz), 然后在大约1秒内突然 (10-400 hz), 然后返回到近静止状态 (1-2 hz) 0.5-1 s (图 5a)。这种射击模式?...

讨论

相关视频和文本中提供的详细信息提供了关键步骤, 以记录嗜酸性粒细胞的活性和穗放电频率. 解剖效果是该方法最关键的方面, 因为短或少量的降神经元将降低基线发射速率, 这将导致复制之间的巨大差异。然而, 一旦解剖技术已经掌握, 与此检测收集的数据是高度可重现性和可修正的各种学科。对所述方法的一个修改是纳入了一个自动浓缩系统, 该系统将防止需要将盐水和化学溶液?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster (strain OR)	Bloomington Drosophila Stock Center	2376
Vibration isolation table	Kinetic Systems	9200 series
Faraday Cage	Kinetic Systems	N/A
Dissecting Microscope on a Boom	Nikon	SMZ800N	Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier	ADInstruments	AM3000H	The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor	ADInstruments	AM3300
Hum Bug Noise Eliminator	A-M Systems	726300
Data Acquisition System (PowerLab)	ADInstruments	PL3504	Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software	ADInstruments	N/A - Online Download
Fiber Optic Lights	Edmund Optics	89-740	Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator	World Precision Instruments	M325
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH715	Different models are acceptable
BNC cables	World Precision Instruments	multiple based on size
Glass Capillaries	World Precision Instruments	PG52151-4
Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-1000	Also can use Narashige PC-100
Black Wax	Carolina Biological Supply	974228
Non-coated insect pins, size #2	Bioquip	1208S2
Fince Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03