제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

요약

이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

초록

현재 사용할 수 있는 살충제의 대부분 신 경계 대상 고 무척 추 동물 신경 단백질의 유전자 변이 자주 해로운 결과, 아직 개인의 신경 활동을 기록에 대 한 현재 메서드 동물 비용과 힘 드는입니다. 이 흡입 초파리 melanogaster 의 제 3 탈피 애벌레 중앙 신경의 전극 준비는 neuroactive 에이전트, 다양 한 신경의 생리 적 역할을 결정의 생리 적 효과 테스트 하기 위한 세공 시스템 신경 기능을 유전자 변이의 영향으로 CNS 활동 경로 이 비보 전 준비 필요 생성 곤충 신경 활동의 재현 녹음 하만 보통을 electrophysiological 지식과 기술 해 부 합니다. 다양 한 화학 변조기, 펩 티 드를 포함 하 여 다음 CNS 활동에 영향을 측정 하기 위해 생리 식 염 수 솔루션의 신 경계에 직접 적용할 수 있습니다. GAL4/UAS 시스템 등 추가, 유전자 기술, 독립적으로 또는 특정 이온 채널, 전송기, 또는 arthropod CNS 기능 수용 체의 역할을 결정 하기 위해 약리 작용에 적용할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 여기에 설명 된 분석 실험 살충제 독물학, 곤충 생리학, 발달 생물학자는 D. melanogaster 설립된 모델 유기 체는 중요 한 관심입니다. 이 프로토콜의 목표는 다양 한 과학적 테스트를 위한 유용한 모델 곤충, 초파리 melanogaster에서 중앙 신경 시스템의 electrogenesis의 측정 수 있도록 electrophysiological 메서드를 설명 하는 가설입니다.

서문

이 방법의 전반적인 목표는 신속 하 게 모델 곤충, 초파리 melanogaster에서 중앙 신경 조직 (CNS)의 electrogenesis를 측정 하는 연구자 수 있도록입니다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는, 빠르고, 비용 효율적인 생리 및 독성에 관한 실험. 을 수행 하 CNS 신경 기능 이해 하거나 신경 기능을 수정 하기 위해에서 광범위 하 게 탐험 되어 대 한 삶과 중요 한 생리 적 경로 따라서,에 대 한 필수적입니다. Arthropod CNS 내의 신호 통로의 특성은 오프 대상 결과 제한 하는 동안 사망을 유발 하는 무척 추 동물 신경 기능을 방해 하는 살충제의 여러 화학 클래스의 검색을 활성화 하 고 있다. 따라서, 신 경계 이기 때문에 대상 조직 배포 된 살충제¹의 대부분의 곤충 독성 학 그리고 생리학의 분야에 상당한 관심의 곤충의 신경 활동을 측정 하는 능력이 이다. 그러나, 곤충 신 경계에 관한 기본 지식과 적용된의 성장 필요 때문에 현재 기술 노동 집약 높은 비용을 요구 타당성에서 제한 된 고급 신경 생리학 기술을 계속 곤충 신경 세포는 제한, 및/또는 대부분 절지동물의 중앙 시 냅 스에 대 한 제한 된 액세스입니다. 현재, 대부분 곤충 신경 단백질의 특성 필요 해야 복제 및 heterologously에 대 한 표현 후속 약물 발견 및 electrophysiological 녹음, 곤충 안으로 정류기 칼륨 채널^{2 설명 했다 대상} , 곤충 ryanodine 수용 체³, 모기 전압에 민감한 K⁺ 채널⁴, 그리고 다른 사람. 분리 식에 대 한 요구와 낮은 기능 식에 대 한 가능성을 완화 하기 위해 Bloomquist와 동료에 신경 표현 형을 유도 하는 목적으로 경작 Spodoptera frugiperda (Sf21) 셀에 대 한 새로운 방법으로 살충제 발견^5,6. 새로운 화학의 발전에 대 한 유효한 접근을 제공 하는 이러한 방법은 아직 그들은 자주 약리학 대리인, 살충제 저항, 및 특성의 메커니즘을 식별 특성에 대 한 극복 병목을 만들 기본적인 생리 적 원리. 여기, ex vivo 메서드는 전성 유전학^7,,89 모델 곤충에서 전기 활동의 기록 및 신경의 알려진된 식 패턴 설명 단지^10,,1112 신경, 새로 개발된 된 약물의 행동의 모드 및 기타 독성 학적 연구의 수준에서 저항 메커니즘의 특성을 사용 하도록.

과일 파리 D. melanogaster, 곤충의 신경 시스템 또는 행동의 살충제 메커니즘을 정의 하기 위한 일반적인 모델 유기 체 이며^{14 독물학13, 약리학의 연구에 대 한 적절 한 모델 생물으로 설립 되었습니다. ,15}, 신경 생리학¹⁶및 척추 동물의 병 태 생리^17,18,19,20 프로세스. D.melanogaster 는 완전 변 태, 애벌레 및 번데기 단계를 포함 하 여 생식 성인 무대에 도달 하기 전에 수행 하는 holometabolous 곤충. 발달 과정을 통해 신 경계 다른 생활 단계에서 중요 한 개장 겪 습 하지만 애벌레 CNS이이 방법론의 초점이 될 것입니다. 완전 개발된 애벌레 CNS와 융합 되 고 반복 하 고 거의 동일한 neuromeric 단위^21,22의 배열을 나타내는 복 부 신경 절을 형성 하는 흉부와 복 부 세그먼트 해부학 간단 하다. 하강 하는 모터 신경 subesophageal 신경의 꼬리 끝에서 시작 하 고 몸 벽 근육과 내장 기관 애벌레의 자극 하. 그림 1 에서는 애벌레 초파리 CNS의 심한 해부학을 설명합니다.

Drosophila 혈액-뇌 장벽 (BBB) embryogenesis의 끝에 발전 하 고 subperineurial glial 세포 (SPG)²¹에 의해 형성 된다. SPG 셀 전체 초파리 CNS²³를 포함 하는 연속, 단조로운, 내 피 같은 시트를 확립을 밖으로 확산 하는 수많은 filopodia 같은 프로세스를 형성 합니다. Drosophila BBB CNS²¹에 영양분과 xenobiotics의 항목을 조절 하 여 신경 microenvironment의 항상성 유지 포함 척추 BBB에 유사점이 있다. 이것은 신뢰할 수 있는 신경 전송 및 기능에 대 한 필수 아직 합성 마약, 대부분 펩 티 드, 그리고 다른 xenobiotics^24,25, 소개 하는 잠재력의 침투를 제한 하는 BBB로 CNS의 보호 potencies 작은 분자 변조기를 특성화 하는 때 문제. 메서드를 사용 하 여 간단한 transection이이 장벽이 고 준비 약리 액세스 중앙 시 냅 스를 제공.
설명된 하는 방법론의 가장 큰 힘은 단순, 재현성, 및이 시스템에 내재 된 상대적으로 높은 처리 능력. 프로토콜은 상대적으로 마스터 하 게 쉬운, 설치 작은 공간을 필요로 하 고 초기 금융 입력만 필요는 시 약 및 소모품을 줄일 수 있다. 또한, 설명 방법은 완전히 집 파리, 파리 자리 부채²⁶. 의 중앙 하강 신경 활동을 기록 하는 amendable

프로토콜

1. 장비 및 재료

1. 전기 생리학 장비 초파리 CNS의 흡입 전극 녹음을 수행의 필수 구성 요소 ( 재료의 테이블에에서 나열 된)를 준비 합니다.
   참고: 이전에 실험, 필요는 초파리 CNS의 해 부에 대 한 챔버를 구성 하 고 녹음 동안 염 분에 중추를 입욕 하는 데 사용할. 챔버 건설의 단계별 개요는 아래 제공 됩니다.
2. 애벌레 챔버를 준비 합니다.
   1. 뜨거운 접시를 사용 하 여 블랙 왁 스를 녹여.
   2. 최대 볼륨의 2-2.5 mL 챔버로 녹 인된 왁 스의 2 개 mL를 붓으십시오.
   3. 왁 스 쿨 하 고 약 2 시간에 대 한 강화.
   4. 면도날을 사용 하 여 약 0.5 c m² 의 표면적과 약 0.25 cm의 깊이 500 µ L의 볼륨을 개최 한다 강화 된 왁 스에 구멍을 개척.

2. 장비 및 소프트웨어 구성

참고: 세포 외 기록의 설치 아래 간략하게 설명 되어 있습니다.

1. 해 부와 녹음 장비를 준비 합니다.
   1. 조직 준비, 현미경, 흡입 전극, micromanipulators, 소음을 줄이기 위해 외부 전기 분야 (그림 2)를 패러데이 새 장 안에 광원을 배치 합니다.
   2. 연결 (솔더 선호) 지상과 긍정적인 와이어에 차폐 된 악어 클립 목욕 및 microelectrode 홀더에 각각 연결 됩니다.
      참고: 납땜 및 노출 전선 노이즈를 줄이기 위해 알루미늄 호 일로 덮여 수 있습니다.
   3. 지상과 긍정적인 와이어 입력 1 ac/DC 차동 증폭기. 의 연결
   4. 데이터 수집 시스템 을 앰프의 채널 1 출력 데이터 수집 시스템의 입력된 1에서 고정 닐-Concelman (BNC) 케이블을 연결 하 여 ac/DC 차동 증폭기에 연결할.
      참고: 데이터 수집 소프트웨어와 증폭기 사이 50/60 Hz 노이즈 제거 기를 통합 하기 위하여 추천 된다. BNC T-커넥터의 사용이 필요 합니다.
   5. 원하는 경우, 데이터 수집 소프트웨어의 1 입력 오디오 모니터의 입력된 1을 연결 하 여 설치 프로그램에 오디오 모니터를 포함 합니다.
   6. 식 염 수와 10 mL 주사기를 전극 홀더의 압력 포트에 연결.
      주: 아무 공기 방울 주사기, Ag/AgCl 펠 릿 및 전극 오프닝 사이 존재 확인.
2. 해 부 및 기록을 위한 소프트웨어를 준비 합니다.
   참고: 소프트웨어 설치에 대 한 방법의 개요 원시 전기 출력을 디지털화 하 고 주파수 스파이크를 데이터 변환 재료의 테이블에 에서 나열 된 수집/분석 소프트웨어에 기반. 그러나, 다른 소프트웨어를 사용할 수 있습니다 그리고 다중 녹음 변환을 사용할 수 있습니다.
   1. 수집/분석 소프트웨어를 엽니다.
   2. 주 도구 모음에서 "설정"에 클릭을 선택 "채널 설정" 대화 상자가 열립니다.
   3. 3 전체 채널의 수를 줄입니다.
   4. 100의 범위를 선택 하는 채널 1에 대 한 mV.
   5. 채널 2에 대 한 드롭 다운 메뉴를 열 것 이다 "계산" 탭 클릭. 선택 "순환 측정," 두 번째 대화 상자가 열립니다.
   6. 원본으로 채널 1을 선택 합니다. 드롭다운 메뉴 측정 단위 스파이크에서 이벤트를 선택 합니다. 마지막으로, 검색 설정 영역에서 드롭 다운 메뉴에서에서 선택 간단한 임계값.
   7. 에 변환 하려면 전기 활동 헤르츠 표현 속도 플롯, 3^rd 채널 산술 모드로 설정 해야 합니다: 입력된 창에 "1000*smoothsec(ch2,2)"에 입력. 단위 메뉴 헤르츠 드롭다운으로 선택 합니다.
      참고: 성공적인 녹음 여러 다른 녹음 설정을 수행할 수 있습니다 하지만 "이벤트 및 간단한 임계값에서 단위 스파이크" 가능성이 가장 쉬운, 그것은 각 개인에 대 한 백그라운드 작업 위에 임계값의 조정에 대 한 수 있기 때문 녹음입니다. "사용자 정의-소스 입력"의 설정에서 녹음 하는 백그라운드 작업은 기록 사이 다른 가정 데이터의 재현성 증가.
   8. 메인 화면으로 돌아가려면 대화 상자를 닫습니다. Y 시간에 Hz와 x 축에 표현 되어야 합니다.

3. 해 부 고 애벌레 초파리 CNS 준비

참고: 애벌레 CNS 절 개 방법 Hafer 및 Schedl²⁷, 명확 하 게 설명 되어 있지만 이러한 이전 게시 방법 스파이크 주파수를 측정 하기 위한 중요 한 하강 뉴런의 길이 줄일. 여기, 유지, 그대로 내림차순 뉴런 애벌레 CNS 소비 세를 추가 하는 방법 요약.

1. 염 분 준비입니다.
   1. 해 부 및 m m²⁸에 다음에 염 분 녹음 준비: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl₂, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 산 (HEPES); 7.25 pH 적정
2. CNS 애벌레 초파리 해 부.
   1. 식별 하 고 식 염 수 (그림 3A)의 200 µ L로 방황 3 탈피 초파리 melanogaster 문화 유리병 및 장소에서 추출.
   2. 미세 집게의 쌍을 가진 입 고리를 잡고 집게 (그림 3B)의 두 번째 쌍은 구 더 기의 복 부를 파악.
      참고:이 구 더 기의 cuticular 박막의 끊어지고 발생할 수 있는 복 부에 너무 많은 압력을 적용 되지 않습니다.
   3. 부드럽게 당겨 입 후크 및 복 부 머리 지역에서 구 더 기의 꼬리 끝을 분리 하 고 구 더 기 (그림 3C)의 내장을 노출 하는 서로 다른 방향으로.
      참고: CNS 됩니다 될 고리로 기관지 및 소화 관. 하강 주변 신경 절단을 방지 하기 위해 어떤 조직에서 CNS를 잘라 하지 마십시오.
   4. 집게 (그림 3D)와 소화 기관에서 CNS를 애타게.
   5. 필요한 경우 수동으로 욕실이 봄이 위 CNS 뇌 돌출부에 후부를 transecting 하 여 혈액 두뇌 방 벽을 방해.
      참고:이 행해져야 한다 사용 되 고 화학의 physiochemical 속성에 따라. 그림 4A 에 빨간색 라인 제안된 transection 포인트 이며 그림 4B에서 표시 된 그대로 내림차순 주변 신경 줄기와 transected CNS. Transected CNS 3.2.5 단계의 완료 후 실험에 대 한 준비가 되어있습니다.

4. 세포 외 기록 초파리 CNS의.

1. 녹음에 대 한 CNS를 준비 합니다.
   1. 5-15 m ω 저항에 붕 규 산 유리 모 세관에서 유리 피 펫 전극 당겨.
   2. 염 분의 200 µ L을 포함 하는 왁 스 챔버에 transected CNS를 삽입 합니다. 접지 와이어를 납땜 하는 악어 클립 uncoated 곤충 핀을 클램프 하 고 회로 완료 하려면 식 염 수에 핀을 삽입 합니다.
   3. micromanipulators을 사용 하 여, 동양 transected CNS의 꼬리 끝에 전극. 주변 신경 줄기를 문의 하기 전에 수집/분석 소프트웨어에서 임계값을 조정 하 여 기록의 배경 잡음을 제거 합니다.
   4. 주사기에 약간의 부정적인 압력을 적용 하 여 흡입 전극에 어떤 편리한 주변 신경을 그립니다.
      참고: 주파수를 발사 초기에 더 신경 자주 발생할 증가 저항 전극의 전극으로 당겨 뉴런의 수에 상관 된다.
2. CNS 하강 하는 신경 활동의 extracellular 녹음을 시작 합니다.
   1. 데이터 수집 소프트웨어에 녹음을 시작 하 고 주파수를 발사 하는 기준선을 모니터링 합니다. 초기 발사 속도 데이터를 수집 하기 전에 5 분 동안 equilibrate를 발사 속도 허용 합니다.
   2. 없으면 제어 치료의 발사의 패턴 그림 5A에 표시 된 것과 유사한 붕괴 패턴 준비 및 녹음을 삭제 합니다.
      참고: 변경된 패턴 발사의 신경 기능을 변경할 수 있는 중앙 패턴 발생기의 비정상적 이거나 불안정 한 활동을 제안 합니다.
   3. 5 분 후 식 염 수 + 챔버의 총 볼륨 녹음 제어 속도 발사 하려면 400 µ L을가지고 차량 200 µ L를 추가 합니다.
   4. 기준선 설립된 (3-5 분) 후 식 염 수의 200 µ L를 철회 하 고 염 분에서 solubilized 실험 에이전트의 200 µ L를 추가 합니다.
      참고: 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 질 성 화합물에 대 한 권장된 용 매 이며 0.1% v/v를 초과 해서는 안됩니다.
   5. 직렬 방식 (높은 농도 낮은) 약물 농도 적용 하 고 각 농도 (약²⁹의 화학적 특성에 따라 조사에 의해 결정) 선택 기간에 대 한 기록. 약물과 최종 농도 포함 하는 코멘트를 포함 하 여이 시간 포인트 획득/분석 소프트웨어에서 약물 응용 프로그램의 레이블을 지정 합니다.
      참고: CNS의 활동을 발사 거절 됩니다 약 10-20%로 30 ~ 50 분 후 해 부 후 따라서 적절 한 치료 컨트롤 실행 되어야 한다, 그리고 약물 치료는이 기간을 초과 하지 않아야 합니다.
3. 데이터를 분석 합니다.
   참고: 여러 분석 활동 전위 버스트²⁹, 스파이크 파형 진폭 및 시간 코스, 그리고 약물 치료^26,30 후 평균 스파이크 주파수 결정의 변화와 같은 수집 된 데이터에 수행할 수 있습니다. ^{, 31 , 32}. 가장 일반적인 마약 아래 설명 하는 시간의 지정된 된 기간 동안 평균 스파이크 주파수는 영향 결정 이다.
   1. (즉, 약물 치료 기간)의 전체 영역을 선택 하 여 평균 스파이크 주파수 평면 및 자동으로 수집/분석의 주요 도구 모음에 있는 "Datapad" 통해 의미 스파이크 주파수 결정 소프트웨어입니다.
   2. 차량 제어 (초기)의 평균 스파이크 주파수에 약물 치료 후 CNS의 평균 스파이크 주파수를 결정 합니다. 수식으로 약물 치료 후 속도 발사 비율 변경 계산: (주파수/기준 주파수 처리) × 100.
   3. 각 농도 대 한 제어의 평균 스파이크 주파수 또는 퍼센트 발사를 사용 하 여 그래프 소프트웨어 표준 농도 응답 곡선을 건설 하기 위하여.
   4. 통계 분석을 수행 (예: 짝이 없는 t-테스트) 의미 시간 포인트, 농도, 또는 약물 치료를 결정 하.
      참고: 생성 농도 응답 곡선을 분석 하기 위한 두 가지 기본 방법이 있습니다. 첫 번째 방법은 개별 준비 당 한 농도 이다. 여기, 단일 농도의 스파이크 속도 각 준비에 대 한 초기 스파이크 속도 정규화 됩니다. 혜택 감소 때문에 준비의 아래로 실행 기록 시간 단축, 함정 증가 하는 동안 해 부 시간이 있기 때문에이 방법의 농도, 당 5-7 개별 CNS 준비 구성 됩니다 및 평균된 데이터에 더 큰 오류 막대 설정 합니다. 두 번째 방법은 개별 준비 당 여러 농도입니다. 여기, 각각 3-5 농도의 스파이크 속도 같은 초기 스파이크 속도 정규화 됩니다. 장점은 적은 해 부 시간 고 함정 후속 화학 치료에 이전 약물 농도 처리의 빠른 행동 약물 및 알 수 없는 영향의 요구는 더 적은 가변성 사이 약물 농도 대 한 복제 합니다.

결과

일관 된 재현성 extracellular 흡입 전극을 사용 하 여 초파리 중추 신 경계에서에서 발생 하는 하강 주변 신경의 자발적인 활동을 기록할 수 있습니다. 삭제 및 transected 초파리 CNS의 자발적인 활동 생산 발사의 약 1 1-2 s와 붕괴의 주기적 패턴 무부하 활동 근처의 s. 예를 들어 CNS는 무부하 (1 ~ 2 Hz) 0.5-1 근처 뒤 약 1 s, 그리고 근처 무부하 상태 (1 ~ 2 Hz) 다음 반환에 ?...

토론

관련된 비디오에 세부 사항을 제공 하 고 활동 및 스파이크를 기록 하기 위해 주요 단계 방전 주파수 비보 전 초파리 CNS의 텍스트를 제공. 해 부 효능은 짧은 또는 몇 하강 신경 초기 발사 속도 큰 차이 복제를 줄일 것입니다 때문에 방법의 가장 중요 한 측면 이다. 그러나, 일단 절 개 기술을 마스터 되었습니다,이 분석 결과와 수집 된 데이터는 매우 재현 가능 하 고 다양 한 분야에 대...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster (strain OR)	Bloomington Drosophila Stock Center	2376
Vibration isolation table	Kinetic Systems	9200 series
Faraday Cage	Kinetic Systems	N/A
Dissecting Microscope on a Boom	Nikon	SMZ800N	Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier	ADInstruments	AM3000H	The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor	ADInstruments	AM3300
Hum Bug Noise Eliminator	A-M Systems	726300
Data Acquisition System (PowerLab)	ADInstruments	PL3504	Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software	ADInstruments	N/A - Online Download
Fiber Optic Lights	Edmund Optics	89-740	Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator	World Precision Instruments	M325
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH715	Different models are acceptable
BNC cables	World Precision Instruments	multiple based on size
Glass Capillaries	World Precision Instruments	PG52151-4
Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-1000	Also can use Narashige PC-100
Black Wax	Carolina Biological Supply	974228
Non-coated insect pins, size #2	Bioquip	1208S2
Fince Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03