Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Abstract

La maggior parte degli insetticidi attualmente disponibili di destinazione il sistema nervoso e mutazioni genetiche delle proteine neurali invertebrati marini producono spesso conseguenze deleterie, eppure gli attuali metodi per la registrazione delle attività del sistema nervoso di un individuo animale è costoso e laborioso. Questa aspirazione elettrodo preparazione del terza-instar larvale sistema nervoso centrale di Drosophila melanogaster, è un sistema trattabile per testare gli effetti fisiologici di agenti neuroattivi, determinazione del ruolo fisiologico di vari neurale percorsi di attività del SNC, come pure l'influenza delle mutazioni genetiche alla funzione neurale. Questa preparazione ex vivo richiede solo moderato abilità e competenza elettrofisiologico di dissezione generare riproducibile registrazioni dell'attività neuronale degli insetti. Un'ampia varietà di modulatori chimici, compresi peptidi, quindi può essere applicata direttamente al sistema nervoso in soluzione con la soluzione fisiologica per misurare l'influenza sull'attività CNS. Tecnologie più ulteriormente, genetiche, come il sistema GAL4/UAS, possono essere applicati in modo indipendente o in tandem con gli agenti farmacologici per determinare il ruolo dei canali ionici specifici, trasportatori o recettori alla funzione CNS dell'artropodo. In questo contesto, i saggi descritti nel presente documento sono di notevole interesse per tossicologi di insetticida, insetto fisiologi e biologi inerente allo sviluppo, per cui d. melanogaster è un organismo modello stabilito. L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo elettrofisiologico per consentire la misurazione della electrogenesis del sistema nervoso centrale nell'insetto modello, Drosophila melanogaster, che è utile per testare una diversità di scientifico ipotesi.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo approccio è quello di consentire ai ricercatori di misurare rapidamente l'electrogenesis del sistema nervoso centrale (CNS) nell'insetto modello, Drosophila melanogaster. Questo metodo è affidabile, veloce e conveniente per eseguire esperimenti fisiologici e tossicologici. Lo SNC è essenziale per la vita e di conseguenza, le vie fisiologiche critiche per la corretta funzione neurale sono stati esplorati estesamente nel tentativo di comprendere o modificare la funzione neurale. Caratterizzazione delle vie di segnalazione all'interno del SNC dell'artropodo ha permesso la scoperta di diverse classi di chimiche di insetticidi che interrompono la funzione neurale invertebrati marini per indurre la mortalità limitando le conseguenze fuori bersaglio. Così, la capacità di misurare l'attività neurale degli insetti è di notevole interesse nel campo della fisiologia e tossicologia degli insetti poiché il sistema nervoso è il tessuto dell'obiettivo della maggioranza degli insetticidi distribuito¹. Ancora, ha continuato la crescita della conoscenza fondamentale ed applicata per quanto riguarda il sistema nervoso degli insetti richiede avanzate tecniche neurofisiologiche che sono limitate nella fattibilità, poiché le tecniche attuali sono lavoro intensivo e richiedono una spesa elevata, insetto linee cellulari neurali sono limitate, e/o di accesso limitato per le sinapsi centrali della maggior parte degli artropodi. Attualmente, la caratterizzazione della maggior parte delle proteine neurali dell'insetto richiede l'obiettivo di essere clonato e heterologously espresse per successive drug discovery e registrazioni elettrofisiologiche, come è stato descritto per i canali di potassio insetto raddrizzatore² , insetto rianodina recettore³, zanzara tensione-sensibili K⁺ canali⁴e altri. Per attenuare il requisito per l'espressione eterologa e il potenziale di espressione funzionale basso, Bloomquist e colleghi mirati a indurre un fenotipo neuronale in Spodoptera frugiperda (Sf21) cellule coltivate come un nuovo metodo per insetticida scoperta^5,6. Questi metodi forniscono un valido approccio per lo sviluppo della nuova chimica, ma creano spesso un collo di bottiglia insormontabile per la caratterizzazione degli agenti farmacologici, identificazione dei meccanismi di resistenza agli insetticidi e caratterizzazione dei principi fisiologici fondamentali. Qui, descriviamo un metodo di ex vivo che consente la registrazione dell'attività elettrica da un insetto di modello che ha malleabile genetica^7,8,9 e modelli di nota espressione di neurale complessi^10,11,12 per consentire la caratterizzazione dei meccanismi di resistenza a livello del nervo, la modalità d'azione dei farmaci di nuova concezione e altri studi tossicologici.

Moscerino della frutta, d. melanogaster, è un organismo modello comune per la definizione di sistemi neurali insetti o insetticida meccanismo d'azione ed è stato stabilito come organismo modello particolarmente adatto per lo studio di tossicologici¹³, farmacologici^{14 ,15}, neurofisiologici¹⁶e patofisiologici^17,18,19,20 processi di vertebrati. Melanogaster è un insetto olometaboli che esegue la metamorfosi completa, tra cui una fase larvale e pupal prima di raggiungere la fase adulta riproduttiva. Durante tutto il processo di sviluppo, il sistema nervoso subisce rimodellamento significativo alle diverse fasi della vita, ma il CNS larvale sarà al centro di questa metodologia. Lo SNC larvale pienamente sviluppato è anatomicamente semplice con segmenti toracici ed addominali che si fondono e formano il ganglio ventrale, che rappresenta una matrice di neuromeric ripetute e quasi identica unità^21,22. Decrescente di nervi motori provengono dall'estremità caudale dei gangli subesophageal e scendere a innervare i muscoli della parete del corpo e degli organi viscerali delle larve. Figura 1 descrive l'anatomia lorda del larvale della drosofila CNS.

La Drosophila emato - encefalica (BBB) si sviluppa alla fine dell'embriogenesi ed è formata da subperineurial cellule gliali (SPG)²¹. Le cellule SPG formano numerosi processi di filopodi-come stendere per stabilire un foglio contiguo, molto piatto, endoteliale-like che copre l'intero Drosophila CNS²³. La Drosophila BBB ha somiglianze con i vertebrati BBB, che comprende preservare l'omeostasi del microambiente neurale controllando l'entrata di sostanze nutritive e xenobiotici nel CNS²¹. Questo è un prerequisito per affidabile trasmissione neurale e la funzione, ma la protezione del SNC di BBB limita la permeazione di droghe sintetiche, maggior parte dei peptidi e altri xenobiotici^24,25, che introduce il potenziale problemi che caratterizzano le potenze di modulatori della piccolo-molecola. Il metodo utilizza un transection semplice per interrompere questa barriera e fornire accesso pronto farmacologico per la sinapsi centrali.
La forza più grande della metodologia descritta è la semplicità, riproducibilità e relativamente alto-rendimento capacità inerente a questo sistema. Il protocollo è relativamente facile da padroneggiare, il programma di installazione richiede poco spazio, e solo un input finanziario iniziale è necessario che si riduce a reagenti e materiali di consumo. Inoltre, il metodo descritto è completamente modificabile per registrare l'attività di nervo centrale discendente della mosca domestica, Musca domestica²⁶.

Protocollo

1. attrezzature e materiali

1. Preparare i componenti necessari (elencati in Tabella materiali) dell'impianto di perforazione elettrofisiologia per eseguire registrazioni di aspirazione elettrodo di Drosophila CNS.
   Nota: Prima della sperimentazione, è necessario costruire alloggiamenti per dissezione della drosofila CNS e da utilizzarsi per la balneazione dei gangli in soluzione salina durante le registrazioni. Seguito viene fornito un profilo graduale di costruzione a camera.
2. Preparare la camera larvale.
   1. Fate sciogliere la cera nera con un piatto caldo.
   2. Versare 2 mL di cera fusa in una camera che ha un volume massimo di 2-2,5 mL.
   3. Lasciare raffreddare la cera e indurire per circa 2 h.
   4. Utilizzare una lama di rasoio per ritagliarsi un buco nella cera indurita che conterrà un volume di 500 µ l, che ha una superficie di circa 0,5 cm² e una profondità di circa 0,25 cm.

2. attrezzature e Software di configurazione

Nota: L'impostazione della registrazione extracellulare è brevemente descritto di seguito.

1. Preparare attrezzature per la dissezione e la registrazione.
   1. Posizionare la preparazione dei tessuti, microscopio, aspirazione elettrodo micromanipolatori, sorgente luminosa all'interno della gabbia di Faraday per ridurre rumore ed eliminare campi elettrici estranei (Figura 2).
   2. Collegare (preferibilmente saldare) terra e fili positivi sul schermato morsetti a coccodrillo che verranno connesso al titolare della vasca e microelettrodo, rispettivamente.
      Nota: Fili saldati ed esposti possono essere coperto con foglio di alluminio per ridurre il rumore.
   3. Collegare la terra e fili positivi all'ingresso 1 dell'amplificatore differenziale AC/DC.
   4. Collegare il sistema di acquisizione dati all'amplificatore differenziale AC/DC collegando un cavo Bayonet Neill-Concelman (BNC) da ingresso 1 del sistema di acquisizione dati per l'uscita del canale 1 dell'amplificatore.
      Nota: Si consiglia di incorporare un eliminatore di rumore 50/60 Hz tra il software di acquisizione dati e l'amplificatore. L'utilizzo di un connettore di BNC T è richiesto.
   5. Se lo si desidera, è possibile includere un monitor audio nell'installazione collegando ingresso 1 del monitor audio all'ingresso 1 del software di acquisizione dati.
   6. Riempire la siringa da 10 mL con soluzione fisiologica e collegarlo alla presa di pressione della pinza porta elettrodo.
      Nota: Garantire l'esistenza senza bolle d'aria tra la siringa, il pellet di Ag/AgCl e l'apertura dell'elettrodo.
2. Preparare il software per la registrazione e la dissezione.
   Nota: Il contorno dei metodi per l'installazione del software è basato sul software di acquisizione/analisi elencati nella Tabella materiali che digitalizzare l'uscita elettrica raw e convertire i dati per frequenza di spike. Tuttavia, altri software può essere utilizzato e più conversioni di registrazione possono essere utilizzate.
   1. Aprire il software di acquisizione/analisi.
   2. Fare clic su "setup" dalla barra degli strumenti principale e selezionare "Impostazioni canale", che apriranno una finestra di dialogo.
   3. Ridurre il numero di canali totali a tre.
   4. Per il canale 1, selezionare un intervallo di 100 mV.
   5. Canale 2, fare clic sulla scheda "calcolo" che si aprirà un menu a discesa. Selezionare "misure cicliche", che apriranno una seconda finestra di dialogo.
   6. Selezionare il canale 1 come origine. Su misura dal menu a discesa, selezionare quindi picco di unità in occasione di eventi. Infine, nell'area impostazioni di rilevamento, dal menu a discesa selezionare soglia semplice.
   7. Per convertire l'attività elettrica in una trama di frequenza espressa in hertz, il canale 3^rd deve essere impostato in modalità aritmetiche: nella finestra di input, digitare in "1000*smoothsec(ch2,2)". Selezionare, come le unità hertz dal menu a discesa.
      Nota: Le registrazioni di successo possono essere eseguite con configurazioni multiple di registrazione diversi, ma "Unità spike a eventi e semplice soglia" è probabilmente il modo più semplice, poiché esso consente la regolazione della soglia sopra attività in background per ogni individuo registrazione. Registrazioni con l'impostazione del "Custom-sorgente di ingresso" aumentano la riproducibilità dei dati supponendo che l'attività in background non è diverso tra le registrazioni.
   8. Chiudere le finestre di dialogo per tornare alla schermata principale. L'asse y deve essere espressa in Hz e l'asse x in tempo.

3. sezionare e preparare il larvale della drosofila CNS

Nota: Metodi per la dissezione larvale CNS sono chiaramente illustrati nella Hafer e Schedl²⁷, ma questi metodi precedentemente pubblicati riducano la lunghezza dei neuroni discendente che sono importanti per misurare la frequenza di picco. Qui, un altro metodo è descritto per asportare il CNS larvale che mantiene a lungo, neuroni intatti discendenti.

1. Preparazione soluzione fisiologica.
   1. Preparare la dissezione e la registrazione salino al seguente nel mM²⁸: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl₂, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acido (HEPES); titolare pH a 7,25.
2. Sezionare il larvale della drosofila CNS.
   1. Identificare ed estrarre una terza-instar errante Drosophila melanogaster dal flacone di coltura e posto in 200 µ l di soluzione fisiologica (Figura 3A).
   2. Afferrare i ganci di bocca con una coppia di una pinzetta e afferrare l'addome della larva con un secondo paio di pinze (Figura 3B).
      Nota: Non applicare troppa pressione all'addome, poiché ciò può comportare lacerazione dello strato cuticolare sottile della larva.
   3. Tirare delicatamente la bocca ganci e addome in direzioni diverse per separare l'estremità caudale della larva dalla regione della testa ed esporre i visceri di larva (Figura 3).
      Nota: Il CNS sarà essere intrecciato con la trachea e l'apparato digerente. Non tagliare il CNS lontano da qualsiasi tessuto per evitare di tagliare i nervi periferici discendenti.
   4. Prendere in giro il CNS fuori il tratto digestivo e della trachea con forcipe (Figura 3D).
   5. Se necessario, è possibile interrompere la barriera ematoencefalica transecting manualmente il CNS posteriore ai lobi cerebrali con forbici di primavera di Allerød.
      Nota: Questo dovrebbe essere fatto basato sulle proprietà fisico-chimiche del prodotto chimico utilizzato. La linea rossa in Figura 4A è il punto di transection suggerito e il CNS transected con tronchi periferici del nervo intatti discendente, mostrato in Figura 4B. Il CNS transected è pronto per la sperimentazione dopo il completamento del punto 3.2.5.

4. registrazione extracellulare di Drosophila CNS.

1. Preparare il sistema nervoso centrale per la registrazione.
   1. Tirare un elettrodo di pipetta di vetro da tubi capillari in vetro borosilicato ad una resistenza di 5-15 mΩ.
   2. Inserire il CNS transected nella camera di cera che contiene 200 µ l di soluzione fisiologica. Bloccare un pin dell'insetto non rivestito con il morsetto a coccodrillo saldato il filo di terra e inserire il perno nel saline per completare il circuito.
   3. Utilizzando i micromanipolatori, orientare l'elettrodo all'estremità caudale del SNC transected. Eliminare la registrazione di rumore di fondo regolando il livello di soglia del software di acquisizione/analisi prima di contattare i tronchi periferici del nervo.
   4. Disegnare qualsiasi conveniente nervi periferici in aspirazione elettrodo da esercitando una leggera pressione negativa sulla siringa.
      Nota: La linea di base frequenza di infornamento è correlato al numero di neuroni attirata l'elettrodo dove più neuroni spesso causare aumento della resistenza dell'elettrodo.
2. Iniziare la registrazione extracellulare del sistema nervoso centrale discendente attività del nervo.
   1. Avviare la registrazione del software di acquisizione dati e monitorare la frequenza di infornamento della linea di base. Consentire il tasso di infornamento equilibrare per 5 minuti prima di raccogliere dati sulla frequenza di infornamento della linea di base.
   2. Scartare la preparazione e la registrazione se il modello di infornamento di trattamento di controllo non è un modello scoppio simile a quella mostrata in Figura 5A.
      Nota: Modello alterato di infornamento suggerisce attività anormale o instabile del generatore modello centrale, che possa alterare la funzione neurale.
   3. Dopo 5 min, aggiungere 200 µ l di soluzione fisiologica + veicolo per portare il volume totale della camera a 400 µ l per iniziare la registrazione controllo tassi di infornamento.
   4. Dopo la linea di base è stato stabilito (3-5 min), prelevare 200 µ l di soluzione fisiologica e aggiungere 200 µ l dell'agente sperimentale solubilizzato in soluzione salina.
      Nota: Solfossido dimetilico (DMSO) è il solvente raccomandato per composti lipofilici e non deve superare 0,1% v/v.
   5. Applicare le concentrazioni nella droga in modo seriale (basso ad alte concentrazioni) e registrare ogni concentrazione per un periodo selezionato di tempo (determinato dallo sperimentatore basato sulle proprietà chimiche del farmaco²⁹). Etichetta questo punto di tempo di applicazione della droga del software di acquisizione/analisi includendo un commento che include il farmaco e la concentrazione finale.
      Nota: Attività del SNC di infornamento diminuirà di circa il 10-20% dopo 30-50 min dopo la dissezione e pertanto, appropriati controlli non trattati devono essere eseguiti, e trattamenti farmacologici non dovrebbero superare questo periodo di tempo.
3. Analizzare i dati.
   Nota: Analisi Multiple possono essere eseguite sui dati raccolti, quali i cambiamenti nel potenziale di azione raffiche²⁹, ampiezza della forma d'onda di picco e corso di tempo e determinazione a spillo media frequenze dopo droga trattamento^{26,30 , 31 , 32}. il più comune consiste nel determinare l'influenza di un farmaco ha per le frequenze di picco medio in un determinato periodo di tempo, che è descritto di seguito.
   1. Tabuli spike medie frequenze selezionando l'intera regione di interesse (cioè, il trattamento farmacologico, periodo di tempo) e determinare le frequenze di picco media automaticamente attraverso il "Datapad" situato sulla barra degli strumenti principale di acquisizione/analisi software.
   2. Determinare la frequenza di picco media dello SNC dopo trattamento farmacologico per la frequenza di picco medio di controllo del veicolo (linea di base). Calcolare la variazione percentuale del tasso di infornamento dopo trattamento farmacologico con la formula: (trattati frequenza frequenza/Baseline) × 100.
   3. Utilizzare l'infornamento di frequenze o per cento di picco media di controllo per ciascuna concentrazione per costruire una curva di risposta di concentrazione con standard grafici software.
   4. Effettuare analisi statistiche (ad es., spaiati t-test) per determinare la rilevanza tra punti di tempo, le concentrazioni o trattamenti farmacologici.
      Nota: Esistono due metodi principali per la generazione e l'analisi di curve concentrazione-risposta. Il primo metodo è una concentrazione per preparazione individuale. Qui, il tasso di picco della concentrazione singola è normalizzato a tasso di punta della linea di base per ogni preparazione. I benefici sono ridotti malandato della preparazione dovuto ridotto tempo di registrazione, mentre sono aumentati i trabocchetti dissezione tempo perché questo metodo sarà composto da 5-7 singole preparazioni di CNS per concentrazione e barre di errore più grande sui dati medi impostare. Il secondo metodo è più concentrazioni per preparazione individuale. Qui, il tasso di spike per ciascuna delle 3-5 concentrazioni vengono normalizzati per lo stesso tasso di punta della linea di base. I vantaggi sono meno tempo di dissezione e minore variabilità tra replica per le concentrazioni di farmaco, mentre le insidie sono l'esigenza di un impatto di droga e sconosciuto ad azione rapida di precedenti trattamenti di concentrazione di droga sui successivi trattamenti chimici.

Risultati

Attività spontanea dei nervi periferici discendenti derivanti dal sistema nervoso centrale Drosophila possono essere registrate utilizzando elettrodi aspirazione extracellulari con riproducibilità coerente. Attività spontanea di asportata e transected Drosophila CNS produce un modello ciclico di scoppio con s 1-2 di infornamento con circa 1 s di vicino attività quiescente. Per esempio, il CNS è vicino quiescente (1-2 Hz) per 0,5-1 s, seguita da una raffica (100-400 ...

Discussione

I dettagli forniti nel video associato e testo hanno fornito passaggi chiave al fine di registrare l'attività e spike scaricano frequenza di Drosophila CNS ex vivo. L'efficacia di dissezione è l'aspetto più critico del metodo perché breve o pochi neuroni discendenti ridurrà la linea di base tasso che si tradurrà in grandi scostamenti tra repliche di infornamento. Tuttavia, una volta che la tecnica di dissezione è stata masterizzata, i dati raccolti con questa analisi sono altamente riproducibili ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila melanogaster (strain OR)	Bloomington Drosophila Stock Center	2376
Vibration isolation table	Kinetic Systems	9200 series
Faraday Cage	Kinetic Systems	N/A
Dissecting Microscope on a Boom	Nikon	SMZ800N	Multiple scopes can be used; boom stand is critical
AC/DC differential amplifier	ADInstruments	AM3000H	The model 1700 can be used instead of the model 3000
audio monitor	ADInstruments	AM3300
Hum Bug Noise Eliminator	A-M Systems	726300
Data Acquisition System (PowerLab)	ADInstruments	PL3504	Multiple PowerLab models can be used.
Lab Chart Pro Software	ADInstruments	N/A - Online Download
Fiber Optic Lights	Edmund Optics	89-740	Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable
Micromanipulator	World Precision Instruments	M325
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH715	Different models are acceptable
BNC cables	World Precision Instruments	multiple based on size
Glass Capillaries	World Precision Instruments	PG52151-4
Microelectrode Puller	Sutter Instruments	P-1000	Also can use Narashige PC-100
Black Wax	Carolina Biological Supply	974228
Non-coated insect pins, size #2	Bioquip	1208S2
Fince Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03