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摘要

在此, 我们提出了一种从简单的起始材料中 dihydroxyphenylalanine biosynthesized 的遗传方法及其在蛋白质共轭中的应用的协议。

摘要

l-dihydroxyphenylalanine (多巴) 是在动物和植物中儿茶酚胺的生物合成中发现的一种氨基酸。由于氨基酸具有特殊的生化特性, 在生物化学应用中具有多种用途。本报告描述了 biosynthesized 巴的遗传合并协议及其在蛋白质共轭中的应用。多巴是由邻苯二酚、丙酮酸和氨的酪氨酸酚裂解酶 (TPL) biosynthesized 的, 而氨基酸则采用进化后的氨酰-tRNA 和氨酰-tRNA 合成产物对的遗传法直接纳入蛋白质中。这种直接的并网系统有效地吸收了多巴与其他天然氨基酸的很少结合, 并具有更好的蛋白质产量比以前的多巴基因合并系统。多巴多巴蛋白结合具有高效性和特异性, 并显示其对各种应用的实用性。该议定书为蛋白质科学家提供了在所需地点对含有巴胺的突变蛋白进行有效生物合成的详细程序, 以及它们用于工业和制药应用的共轭。

引言

巴胺是一种氨基酸, 涉及动物和植物中儿茶酚的生物合成。该氨基酸由酪氨酸羟化酶和分子氧 (O2)1合成 Tyr。由于多巴是一大胺的前驱体, 可以渗透血脑屏障, 它已用于治疗帕金森病2。巴比在贻贝黏附蛋白 (地图) 也被发现, 负责贻贝的胶粘剂物产在湿的情况3,4,5,6,7。Tyr 最初是在地图上发现了几巴的位置编码的, 然后被 tyrosinases8、9转换成了巴比。多巴由于其具有有趣的生化特性, 在各种应用中得到了应用。多巴二羟基组化学上易氧化, 氨基酸容易转化为 l-dopaquinone, 黑色素的前驱体。由于其高 electrophilicity, l-dopaquinone 及其衍生物已被用于交联和共轭与硫醇和胺10,11,12,13。12-醌还可以作为 cycloaddition 反应的二烯, 并已用于 bioconjugation 由应变促进氧化控制 cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14。此外, 二羟基集团可以螯合金属离子, 如 Fe3 +和铜2 +, 和含有多巴的蛋白质已用于药物输送和金属离子传感15,16。

多巴通过使用正交氨酰-tRNA (aa-tRNA) 和氨酰-tRNA 合成酶 (aaRS) 对17 , 并用于蛋白质共轭和交联10,11, 被基因纳入蛋白质,12,13。在本报告中, 介绍了从廉价的起始材料中引入 biosynthesized 的实验结果和协议, 以及它在 bioconjugation 中的应用。biosynthesized 使用 TPL, 从邻苯二酚, 丙酮酸和氨的大肠杆菌开始。biosynthesized 多巴是通过表达一个进化的 aa-tRNA 和 aaRS 对巴比直接纳入蛋白质。此外, 含有多巴的 biosynthesized 蛋白与荧光探针结合, 并交联以产生蛋白质寡聚物。这项协议将是有用的蛋白质科学家, biosynthesize 突变蛋白含有一巴和共轭蛋白质与生化探针或药物的工业和制药应用。

研究方案

1. 质粒结构

  1. 构建一种表达质粒 (pBAD-双 TPL-gfp), 在本构启动子和绿色荧光蛋白 (gfp) 基因的控制下表达柠檬酸杆菌 freundii的 TPL 基因, 并在其控制下对其6标记araBAD 启动子。对于 pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, 使用站点定向的突变协议, 用琥珀密码子 (标记) 替换多巴的站点 (E90) 的密码子。我们在上一份报告18中描述了建造这种质粒的细节。
  2. 构建 tRNA/aaRS 表达质粒 (pEVOL-DHPRS2)18,19用于多巴基因的合并。pEVOL 是一种特殊的质粒载体, 表达了两个 aaRS 基因的独立启动子, 并在前一份报告中描述了质粒的详细信息19。
  3. 使用商业上可用的质粒制备试剂盒获得高纯度质粒 dna。如有必要, 用琼脂糖凝胶电泳检查准备的 dna 纯度。

2. 文化准备

  1. 穿孔
    1. 用电控大肠杆菌DH10β菌株进行实验。将每种质粒 DNA 的1µL (pEVOL-DHPRS2 和 pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) 添加到20µL 的合格细胞中。用吸管将它们轻轻地混合成均匀的混合物。
    2. 将混合物转移到电穿孔小试管。把试管放在电穿孔室里。将试管推入室内, 使试管室接触牢固。
    3. 冲击试管, 使用25µF 和2.5 伏的0.1 厘米小试管。
    4. 加入1毫升的 prewarmed 超级最佳汤 (SOC), 含有 2% (w/v) 胰蛋白胨, 0.5% (瓦特/v) 酵母提取物, 10 毫米氯化钠, 2.5 毫米氯化钾, 10 毫米氯化镁2, 和20毫米葡萄糖, 到试管, 并转移细胞到培养管。用颤抖的方法在37摄氏度的1小时内孵化, 以拯救细胞。
    5. 在含有35µg/毫升氯霉素和100µg/毫升氨苄西林的溶源性汤 (LB) 琼脂板上传播 10-100 µL 的获救细胞。孵育细胞在37°c 16 小时。
  2. 起动机培养制剂
    1. 接种5毫升含有抗生素的 LB 培养基中的单个转化的菌落。用颤抖的方法在37摄氏度孵化出12小时的蚁群。

3. 生物合成系统对 GFP-E90DOPA 的表达和纯化

  1. 生物合成系统 GFP-E90DOPA 的表达
    1. 将起始培养 (2 毫升) 转移到100毫升的 PA-5052 中等20 (50 毫米 Na2HPO4, 50 毫米2PO4, 25 毫米 [NH4]2所以4, 2 毫米 MgSO4, 0.1% [w/v] 痕量金属, 0.5% [瓦特/v] 甘油,0.05% [瓦特/v] 葡萄糖, 和 5% [w/v] 氨基酸 [pH 7.25]) 含有35µg/毫升氯霉素, 100 µg/毫升氨苄西林, 100 毫米丙酮酸, 10 毫米邻苯二酚, 25 毫米氨, 300 µM dithiothreitol (德勤) 其次是孵化在30°c 与震动。
    2. 当光学密度 (OD) 在550毫微米达到0.8 时, 加入2毫升 0.2% (瓦特/v) l-阿拉伯糖。用颤抖的方法在30摄氏度孵化样品12小时。
    3. 旋转 1.1万 x g 的细胞5分钟, 丢弃上清, 并冻结细胞颗粒在-80 摄氏度。
  2. 细胞裂解
    1. 在冰上解冻细胞颗粒, 并用重悬10毫升的溶解缓冲液中含有50毫米 NaH2PO4 (pH 8.0), 10 毫米咪唑和300毫米氯化钠的细胞。
    2. 油脂实验悬浮细胞在冰上的10分钟使用80% 超声波振幅与脉冲二十五年代和三十五年代。
    3. 在 1.8万 x g 4 摄氏度处旋转细胞裂解液15分钟. 将上清液转移到新鲜的试管中进行提纯并丢弃颗粒。
  3. 镍-NTA 亲和层析法
    1. 加入镍 NTA (nitrilotriacetic 酸) 树脂 (300 µL 树脂悬浮液100毫升培养) 到上清, 并将蛋白质结合到4摄氏度的镍 NTA 树脂上, 轻轻摇动悬浮液 1 h。
    2. 将悬浮液转移到聚丙烯柱上, 用5毫升的洗涤缓冲液洗涤树脂 3x, 其中含有50毫米 NaH2PO4 (pH 8.0)、20毫米咪唑和300毫米氯化钠。
    3. 洗脱蛋白质3x 与300µL 洗脱缓冲器包含50毫米 NaH2PO4 (pH 8.0), 250 毫米咪唑和300毫米氯化钠。
    4. 通过测量 280 nm 的吸光度测定蛋白质浓度。用蛋白质消光系数计算器 (如https://web.expasy.org/protparam/) 和独立测量的 GFP-E90DOPA 计算了 280 nm 的消光系数 (24630 米-1厘米-1);coefficiennt (2630 米-1厘米-1) 为巴胺。作为一种替代方法, 使用布拉德福德蛋白21测定蛋白质浓度。

4. 纯化 GFP-E90DOPA 的齐聚

  1. 在含20毫米 Na300GFP-E90DOPA50 (pH 2) 和4毫米氯化钠的磷酸盐缓冲液中, 添加1µL 的高碘酸钠在 H2O (6 毫米) (1.0 equiv) 到 GFP-E90DOPA) 到8.0 µM (300 HPO) 的溶液中。
  2. 允许齐聚反应以25摄氏度为48小时进行。
  3. 用月桂酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析反应混合物 (SDS 页), 如步骤6所述。

5. GFP-E90DOPA 与炔烃探针的共轭 SPOCQ

  1. 在 H2O (4.0 毫米) (10 ADIBO) 中添加1µL Cy5.5 链接的 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5 equiv)22 . GFP-E90DOPA) 到溶液中的20µL 的 GFP-E90DOPA (20 µM) 在磷酸盐缓冲器含有50毫米 Na2HPO4 (pH 8.0) 和300毫米氯化钠。
  2. 将高碘酸钠的1µL 在 H2O (400 µM) (1.0 equiv GFP-E90DOPA) 中加入反应混合物。
  3. 允许 SPOCQ 反应在25摄氏度进行1小时。如果使用光敏感探头, 请用铝箔覆盖反应容器。

6. 标记的 GFP 的纯化

  1. 通过添加磷酸盐缓冲剂稀释 SPOCQ 反应混合物, 含有50毫米 Na2HPO4 (pH 8.0) 和300毫米氯化钠, 最多500µL。
  2. 将稀释后的溶液转移到离心过滤器旋压柱上。离心机的旋转柱在 1.4万 x g在4°c 15 分钟, 并放弃流经。重复此步骤 3x, 以删除任何多余的 Cy5.5-ADIBO。
  3. 将纯化样品从自旋柱转移到1.5 毫升离心管。
  4. 另外, 对同一缓冲液进行透析纯化。
  5. 将纯化的 GFP 保存在4摄氏度。

7. SDS 页分析和荧光凝胶扫描

  1. 通过添加5µL 蛋白质样品缓冲器 (见材料表) 和2µL (1.00 米) 到13µL 的纯化, 或粗, 标记为 GFP (13.6 µM 或0.38 毫克/毫升), 为 SDS 页分析准备蛋白质样品。对于寡聚 gfp 的分析, 使用更高浓度的 gfp (67.8 µM 或1.9 毫克/毫升)。变性蛋白质的孵化, 在95°c 10 分钟。
  2. 将 4%-12% 双三页凝胶盒 (购买的预制凝胶盒) 放置到电泳单元中, 并添加一个正在运行的缓冲器 (见材料表)。加载蛋白质样品和分子量标记。在 200 v 进行电泳 35-40 分钟。
    注意: 通过在黑暗中执行所有的过程, 避免对蛋白质样品的任何曝光, 以尽量减少荧光探针的光漂白。
  3. 使用荧光扫描仪进行荧光成像。将蛋白质凝胶从电泳中包裹起来, 放在荧光扫描仪上。使用适当的波长设置扫描凝胶。对于 Cy5.5, 请选择扫描仪软件中提供的 Cy5 模式。
  4. 用商业蛋白染色试剂染色凝胶。

8. 胰蛋白酶消化 MALDI 分析

  1. 孵育100µL 的纯化 GFP-E90DOPA (2.2 毫克/毫升或80µM) 在一个缓冲区中含有50毫米三 HCl (pH 8.0), 0.1% (w/v) SDS, 25 毫米, 在60°c 为 1 h。
  2. 在2O (IAA, 4.0 米) (500 equiv GFP-E90DOPA) 中添加1µL Iodoacetamide 在同一缓冲区中的纯化 GFP-E90DOPA 溶液 (80 µM)。在25摄氏度的混合物中孵育30分钟, 保护光线。
  3. 通过加入胰蛋白酶 (1:100 蛋白酶到基质蛋白比值 [w/w]) 来消化 GFP-E90DOPA 样品, 并在37摄氏度的4小时内孵化反应混合物。
  4. 采用 C18自旋柱的标准脱盐法纯化消化肽样品。
  5. 以 alpha-cyano-4-hydroxycinnamic 酸 (CHCA) 为基质23, 通过对基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (MALDI) 的报告协议, 对消化肽进行分析。

结果

图 1显示了从 TPL 直接并入 biosynthesized 的表达系统。进化的 aa-tRNA 和 aaRS 对的基因被放置在质粒中, 而 gfp 基因 (GFP-E90TAG) 包含琥珀密码子在位置90位于另一个质粒中, 以评估多巴的加入 gfp 荧光。TPL 基因被放置在含有 GFP 基因和组成性表达的同一个表达质粒中, 以最大程度地提高巴比生物合成的产量。利用该表达系统筛选了巴比生物合成的最佳条件。本...

讨论

在本议定书中, 介绍了巴胺的生物合成和直接加入。这种方法中使用的细菌细胞可以合成额外的氨基酸, 并将其用作蛋白质合成的非自然构造块。非自然氨基酸的遗传融合一直是生物进化的关键技术, 具有扩展的遗传密码。然而, 这种方法在技术上是不完整的, 正在修改, 以提高整合效率, 并尽量减少扰动的内源翻译系统。最近, 该方法取得了重大进展, 通过重新分配密码子 24,

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了全球前沿研究项目 (NRF-2015M3A6A8065833) 的支持, 并通过韩国政府资助的韩国国家研究基金会 (2018R1A6A1A03024940) (NRF) 进行了基础科学研究项目。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGoptionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10βInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser BIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Pyrocatechol, 99%SAMCHUNP138725 g
Ammonium sulfate, 99%SAMCHUNA0943500 g
pyruvic acid, 98%Alfa AesarA13875100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%SAMCHUNS08911 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%SAMCHUNP11271 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%SAMCHUND0092500 g
Glycerol, 99%SAMCHUNG02691 kg
Trace metal mix a5 with coSigma9294925 mL
L-Proline, 99%SAMCHUNP125725 g
L-Phenylalanine, 98.5%SAMCHUNP198225 g
L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
L-Arginine, 98%SAMCHUNA114925 g
L-Glutamine, 98%JUNSEI27340-031025 g
L-Asparagine monohydrate, 99%SAMCHUNA119825 g
L-MethionineJUNSEI73190-041025 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%SAMCHUNH060425 g
L-Threonine, 99%SAMCHUNT293825 g
L-LeucineJUNSEI87070-031025 g
Glycine, 99%SAMCHUNG028625 g
L-Glutamic acid, 99%SAMCHUNG023325 g
L-Alanine, 99%SAMCHUNA154325 g
L-Isoleucine, 99%SAMCHUNI104925 g
L-Valine, 99%SAMCHUNV008825 g
L-SerineSAMCHUNS244725 g
L-Aspartic acidSAMCHUNA120525 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%SAMCHUNL059225 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 millilitersSONIC & MATERIALSVCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112 well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging SystemSyngeneG BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%SAMCHUND1070250 g
IodoacetamideSigmaI61255 g
Trypsin Protease, MS GradeThermofisher900575 x 20 µg/pack
C-18 spin columnsThermofisher8987025/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%SAMCHUNA0125500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigmaC202010 g
Trifluoroacetic acid, 99%SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targetsBruker8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometerBruker

参考文献

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