Genetiche incorporazione di Biosynthesized L-diidrossifenilalanina (DOPA) e la sua applicazione alla proteina coniugazione

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la costituzione genetica di L-diidrossifenilalanina biosynthesized da semplici materiali di partenza e la sua applicazione alla coniugazione di proteina.

Abstract

L-diidrossifenilalanina (DOPA) è un aminoacido presente nella biosintesi delle catecolamine in animali e piante. Grazie alle sue particolari proprietà biochimiche, l'amminoacido ha molteplici usi in applicazioni biochimiche. Questo rapporto descrive un protocollo per la costituzione genetica di biosynthesized DOPA e sua applicazione alla coniugazione di proteina. DOPA biosynthesized da una tirosina fenolo-liasi (TPL) da catecolo, piruvato e ammoniaca, e l'aminoacido è direttamente incorporato nelle proteine con il metodo di incorporazione genetico utilizza un'evoluta amminoacil-tRNA e coppia di aminoacyl-tRNA sintetasi. Questo sistema di incorporazione diretta in modo efficiente incorpora DOPA con piccolo incorporazione di altri amminoacidi naturali e con migliore rendimento di proteine rispetto al precedente sistema di costituzione genetica per DOPA. Coniugazione di proteine con proteine contenenti DOPA è efficiente e site-specific e dimostra la sua utilità per varie applicazioni. Questo protocollo fornisce agli scienziati di proteina con procedure dettagliate per la biosintesi efficiente delle proteine mutanti contenenti DOPA nei siti desiderati e loro coniugazione per applicazioni industriali e farmaceutiche.

Introduzione

DOPA è un aminoacido coinvolto nella biosintesi delle catecolamine in animali e piante. Questo aminoacido è sintetizzato da Tyr idrossilasi della tirosina e ossigeno molecolare (O₂)¹. Perché DOPA è un precursore della dopamina e può permeare la barriera emato - encefalica, è stato utilizzato nel trattamento della malattia di Parkinson². DOPA si trova anche in proteine di adesione di cozza (mappe), che sono responsabili per le proprietà adesive di cozze in condizioni di bagnato^3,4,5,6,7. Tyr è inizialmente codificato nelle posizioni dove DOPA si trova nelle mappe e viene quindi convertito in DOPA da tirosinasi^8,9. Grazie alle sue interessanti proprietà biochimiche, DOPA è stato utilizzato in una varietà di applicazioni. Il gruppo di dihydroxyl della DOPA è chimicamente incline all'ossidazione e l'aminoacido è facilmente convertito in L-dopachinone, un precursore di melanine. A causa della sua elevata electrophilicity, L-dopaquinone e suoi derivati sono stati utilizzati per la reticolazione e la coniugazione con tioli e ammine^10,11,12,13. 1,2-chinoni possono anche funzionare come un diene per reazioni di cicloaddizione e sono stati utilizzati per bioconjugation dal ceppo-promosso ossidazione controllata cyclooctyne-1,2-chinone (SPOCQ) cicloaddizione¹⁴. Inoltre, il gruppo di dihydroxyl possa chelare ioni metallici come Fe^{3 +} e Cu^{2 +}, e proteine contenenti DOPA sono stati utilizzati per la consegna della droga e dello ione del metallo rilevamento^15,16.

DOPA è stato incorporato nelle proteine utilizzando un ortogonale aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) e amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) coppia¹⁷ geneticamente e utilizzato per proteina coniugazione e reticolazione^{10,11, 12,13}. In questo rapporto, i risultati sperimentali e protocolli per la costituzione genetica di DOPA biosynthesized da materie prime a buon mercato e le sue applicazioni per bioconjugation sono descritti. DOPA biosynthesized utilizzando un TPL e a partire da catecolo, piruvato e ammoniaca in Escherichia coli. Biosynthesized DOPA è direttamente incorporato nelle proteine esprimendo una coppia di aa-tRNA e aaRS evoluta per DOPA. Inoltre, la proteina biosynthesized contenenti DOPA site-specifically è coniugata con una sonda fluorescente e reticolati per produrre oligomeri di proteina. Questo protocollo sarà utile per gli scienziati di proteina, di provitamina proteine mutanti contenenti DOPA e coniugato le proteine con sonde biochimici o farmaci per applicazioni industriali e farmaceutiche.

Protocollo

1. plasmide costruzione

1. Costruire un plasmide di espressione (pBAD-dual-TPL-GFP-WT) che esprime il gene TPL dal freundii del citrobatterio sotto il controllo di un promotore costitutivo e il gene della proteina fluorescente verde (GFP) con un suo₆-tag sotto il controllo della promotore araBAD. Per pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, sostituire il codone per il sito (E90) di DOPA con un codone ambrato (TAG), utilizzando un protocollo di mutagenesi sito-diretta. I dettagli per la costruzione di questo plasmide è stato descritto nella nostra precedente relazione¹⁸.
2. Costruire un tRNA/aaRS-esprimendo plasmide (pEVOL-DHPRS2)^18,19 per la costituzione genetica di DOPA. pEVOL è un vettore plasmidico speciale esprimendo due copie dei geni aaRS con promotori indipendenti, e le informazioni dettagliate del plasmide sono descritto in una precedente relazione¹⁹.
3. Utilizzare kit di preparazione del plasmide commercialmente disponibile per ottenere elevata purezza del plasmide DNAs. Verificare la purezza del DNAs preparata utilizzando l'elettroforesi del gel dell'agarosi, se necessario.

2. cultura preparazione

1. Elettroporazione
   1. Uso electro-competenti DH10β ceppo di e. coli per questo esperimento. Aggiungere 1 µ l di ogni plasmide DNA (pEVOL-DHPRS2 e pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) a 20 µ l di cellule competenti. Mescolare delicatamente per ottenere un impasto omogeneo, utilizzando una pipetta.
   2. Trasferire il composto nella cuvette di elettroporazione. Disponga la provetta nella camera di elettroporazione. Spinge la cuvetta nella camera di fare impresa cuvette-camera contattare.
   3. La cuvetta, utilizzando 25 µF di scossa e 2,5 kV per le provette 0,1 cm.
   4. Aggiungere 1 mL di brodo super ottima preriscaldata (SOC), contenente il 2% (p/v) tryptone, 0,5% (p/v) di lievito estratto, 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl₂e 20 millimetri di glucosio, per la provetta e trasferire le cellule in una provetta di cultura. Salvare le cellule di incubarle per 1h a 37 ° C con agitazione.
   5. Diffusione di 10-100 µ l delle cellule hanno salvate su una piastra di agar di brodo (LB) di Lisogenesi contenenti cloramfenicolo di 35 µ g/mL e 100 µ g/mL ampicillina. Incubare le cellule a 37 ° C per 16 h.
2. Preparazione di cultura Starter
   1. Inoculare una singola Colonia trasformata in 5 mL di terreno LB contenenti antibiotici. Incubare la Colonia per 12 h a 37 ° C con agitazione.

3. espressione e purificazione di GFP-E90DOPA da un sistema biosintetico

1. Espressione della GFP-E90DOPA da un sistema biosintetico
   1. Trasferire la coltura starter (2 mL) per 100 mL di PA-5052 medio²⁰ (Na₂HPO₄, 50mm KH₂PO₄, 25mm [NH₄]₂così₄, 2mm MgSO₄, 0,1% [p/v] risalire metalli, glicerolo 0,5% [p/v], 0.05% [p/v] glucosio e aminoacidi 5% [p/v] [pH 7,25]) contenente 35 cloramfenicolo µ g/mL, 100 µ g/mL ampicillina, piruvato di 100mm, catecolo 10mm, ammoniaca 25 mM e 300 µM ditiotreitolo (DTT) seguita da un'incubazione a 30 ° C con agitazione.
   2. Aggiungere 2 mL di 0,2% (w/v) L-arabinosio quando la densità ottica (OD) a 550 nm raggiunge 0,8. Incubare il campione per 12 ore a 30 ° C con agitazione.
   3. Rotazione verso il basso le cellule a 11.000 x g per 5 min, scartare il surnatante e congelare il pellet cellulare a-80 ° C.
2. Lisi delle cellule
   1. Scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere le cellule in 10 mL di tampone di lisi contenente 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), imidazolo di 10 mM e 300 mM NaCl.
   2. Sottoporre ad ultrasuoni le cellule sedimento in ghiaccio per 10 min ampiezza di sonicazione 80% uso con un impulso di 25 s s on e 35 fuori.
   3. Rotazione verso il basso il lysate a 18.000 x g a 4 ° C per 15 min. trasferimento del surnatante in una nuova provetta per la purificazione delle cellule e scartare il pellet.
3. Cromatografia di affinità NI-NTA
   1. Aggiungere la Ni-NTA (acido nitrilotriacetico) resina (300 µ l della sospensione di resina per una cultura di 100 mL) al supernatante e legano le proteine alla resina Ni-NTA a 4 ° C agitando delicatamente la sospensione per 1 h.
   2. Trasferire la sospensione in una colonna in polipropilene e lavare la resina 3 x con 5 mL di tampone di lavaggio contenente 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), imidazolo di 20 mM e 300 mM NaCl.
   3. Eluire le proteine 3 x con 300 µ l di tampone di eluizione contenente 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8.0), imidazolo di 250 mM e 300 mM NaCl.
   4. Determinare la concentrazione di proteina misurando l'assorbanza a 280 nm. Il coefficiente di estinzione (24.630 M^-1cm^-1) per GFP-E90DOPA a 280 nm è stata calcolata una calcolatrice di coefficiente di estinzione della proteina (ad esempio, https://web.expasy.org/protparam/) e l'estinzione misurata in modo indipendente coefficiennt (2630 M^-1cm^-1) per DOPA. Come metodo alternativo, utilizzare il dosaggio proteina di Bradford²¹ per una determinazione della concentrazione proteica.

4. oligomerizzazione di purificato GFP-E90DOPA

1. Aggiungere 1 µ l di Sodio Metaperiodato in H₂O (6 mM) (1.0 equiv. a GFP-E90DOPA) ad una soluzione di 20 µ l di GFP-E90DOPA (300 µM) in un tampone fosfato 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8.0) e 300 mM NaCl.
2. Consentire la reazione di oligomerizzazione di procedere a 25 ° C per 48 h.
3. Analizzare la miscela di reazione di elettroforesi dodecilica del gel del solfato-poliacrilammide di sodio) (SDS-PAGE), come descritto nel passaggio 6.

5. coniugazione del GFP-E90DOPA con una sonda di alchini di SPOCQ

1. Aggiungere 1 µ l di azadibenzocyclooctyne CY 5.5-collegato (CY 5.5-ADIBO)²² in H₂O (4,0 mM) (10 equiv. a GFP-E90DOPA) ad una soluzione di 20 µ l di GFP-E90DOPA (20 µM) in un tampone fosfato 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8.0) e 300 mM NaCl.
2. Aggiungere 1 µ l di Sodio Metaperiodato in H₂O (400 µM) (1.0 equiv. a GFP-E90DOPA) alla miscela di reazione.
3. Consentire la reazione di SPOCQ di procedere a 25 ° C per 1 h. Se viene utilizzata una sonda sensibile alla luce, coprire il recipiente di reazione con carta stagnola.

6. purificazione della GFP con etichetta

1. Diluire la miscela di reazione SPOCQ aggiungendo un tampone fosfato, contenente 50 mM Na₂HPO₄ (pH 8.0) e 300 mM NaCl, fino a 500 µ l.
2. Trasferire la soluzione diluita a una colonna di spin di filtro centrifugo. Centrifugare la colonna di spin a 14.000 x g a 4 ° C per 15 min e gettare il flusso continuo. Ripetere questo passaggio 3 x al fine di rimuovere qualsiasi eccesso CY 5.5-ADIBO.
3. Trasferire il campione purificato dalla colonna spin ad un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
4. In alternativa, eseguire una purificazione mediante dialisi contro lo stesso buffer.
5. Memorizzare la GFP purificata a 4 ° C.

7. fluorescenza e analisi SDS-PAGE Gel scansione

1. Preparare i campioni della proteina per analisi SDS-PAGE aggiungendo 5 µ l di tampone di proteina (Vedi Tabella materiali) e 2 µ l di DTT (1,00 M) a 13 µ l di purificato, o grezza, etichettato GFP (13,6 µM o 0,38 mg/mL). Per un'analisi di GFP oligomerici, utilizzare una maggiore concentrazione di GFP (67,8 µM o 1,9 mg/mL). Denaturare le proteine di incubarle a 95 ° C per 10 min.
2. Mettere un vassoio del 4% - 12% Bis-Tris SDS-PAGE gel (gel acquistati, premade cassette) alla cella di elettroforesi e aggiungere un buffer in esecuzione (Vedi Tabella materiali). Caricare i campioni della proteina e un marcatore di peso molecolare. Eseguire l'elettroforesi per 35-40 min a 200 V.
   Nota: Evitare l'esposizione dei campioni proteici alla luce da svolgere tutti i processi al buio, per ridurre al minimo lo sbiancamento foto della sonda fluorescente.
3. Utilizzare uno scanner di fluorescenza per l'imaging di fluorescenza. Avvolgere un gel di proteina da elettroforesi e metterlo su uno scanner di fluorescenza. Scansione il gel utilizzando un'impostazione di lunghezza d'onda appropriata. Per CY 5.5, selezionare la modalità di Cy5 fornita nel software dello scanner.
4. Macchia il gel con una proteina commerciale colorazione reagente.

8. MALDI-TOF MS analisi di digestione della tripsina

1. Incubare 100 µ l di purificato GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL o 80 µM) in un tampone contenente 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1% (p/v) SDS e 25 mM DTT a 60 ° C per 1 h.
2. Aggiungere 1 µ l di Iodoacetamide in H₂O (IAA, 4.0 M) (500 equiv. a GFP-E90DOPA) alla soluzione di GFP-E90DOPA purificata (80 µM) nello stesso buffer. Incubare la miscela a 25 ° C per 30 min con protezione dalla luce.
3. Digerire il campione di GFP-E90DOPA con l'aggiunta di tripsina (rapporto di 1: 100 della proteasi della proteina substrato [w/w]) e incubare a 37 ° C per 4 h, la miscela di reazione.
4. Purificare il campione digerito peptide utilizzando un metodo standard di dissalazione con C₁₈ colonne di spin.
5. Analizzare i peptidi digeriti dal protocollo segnalato per matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione time-of-flight spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) utilizzando acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) come una matrice²³.

Risultati

Il sistema di espressione per l'incorporazione diretta di DOPA biosynthesized da un TPL è illustrato nella Figura 1. I geni per la coppia di aa-tRNA e aaRS evoluto sono collocati in un plasmide, e il gene GFP (GFP-E90TAG) contenenti un codone ambrato alla posizione 90 si trova in un altro plasmide per valutare l'incorporazione di DOPA di fluorescenza di GFP. Il gene TPL è collocato nel plasmide stessa espressione che contiene il gene GFP e costitutivamente ...

Discussione

In questo protocollo, la biosintesi e l'incorporazione diretta della DOPA sono descritti. La cellula batterica utilizzata in questo metodo può sintetizzare un aminoacido ulteriore e usarlo come un innaturale building block per la sintesi proteica. La costituzione genetica di amminoacidi non naturali è stata una tecnologia chiave per lo sviluppo dell'organismo innaturale con un codice genetico espanso. Tuttavia, questo metodo è stato tecnicamente incompleto e viene modificato per migliorare l'efficienza di incorporazio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG			optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2			1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β	Invitrogen	C6400-03	Expression Host
Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pack
Agarose	Intron biotechnology	32034	500 g
Ethidium bromide	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser	BIO-RAD	165-2100
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2089	0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium	Wako	018-10372	25 g
Chloramphenicol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Agar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC medium	Sigma	S1797	100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%	Acros	104981000	100 g
Pyrocatechol, 99%	SAMCHUN	P1387	25 g
Ammonium sulfate, 99%	SAMCHUN	A0943	500 g
pyruvic acid, 98%	Alfa Aesar	A13875	100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%	SAMCHUN	S0891	1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%	SAMCHUN	P1127	1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%	SAMCHUN	M0146	1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%	SAMCHUN	D0092	500 g
Glycerol, 99%	SAMCHUN	G0269	1 kg
Trace metal mix a5 with co	Sigma	92949	25 mL
L-Proline, 99%	SAMCHUN	P1257	25 g
L-Phenylalanine, 98.5%	SAMCHUN	P1982	25 g
L-Tryptophane	JUNSEI	49550-0310	25 g
L-Arginine, 98%	SAMCHUN	A1149	25 g
L-Glutamine, 98%	JUNSEI	27340-0310	25 g
L-Asparagine monohydrate, 99%	SAMCHUN	A1198	25 g
L-Methionine	JUNSEI	73190-0410	25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%	SAMCHUN	H0604	25 g
L-Threonine, 99%	SAMCHUN	T2938	25 g
L-Leucine	JUNSEI	87070-0310	25 g
Glycine, 99%	SAMCHUN	G0286	25 g
L-Glutamic acid, 99%	SAMCHUN	G0233	25 g
L-Alanine, 99%	SAMCHUN	A1543	25 g
L-Isoleucine, 99%	SAMCHUN	I1049	25 g
L-Valine, 99%	SAMCHUN	V0088	25 g
L-Serine	SAMCHUN	S2447	25 g
L-Aspartic acid	SAMCHUN	A1205	25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%	SAMCHUN	L0592	25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%	SAMCHUN	I0578	1kg
Sodium phosphate monobasic, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Sodium Chloride, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 milliliters	SONIC & MATERIALS	VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	25 mL
Polypropylene column	QIAGEN	34924	50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA
Sodium periodate, 99.8&	Acros	419610050	5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ)
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	MILLIPORE	UFC500396	96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES running buffer	Thermofisher	NP0002	500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels	Thermofisher	NO0321	12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System	Syngene		G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
Hydrochloric acid, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%	SAMCHUN	D1070	250 g
Iodoacetamide	Sigma	I6125	5 g
Trypsin Protease, MS Grade	Thermofisher	90057	5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns	Thermofisher	89870	25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%	SAMCHUN	A0125	500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma	C2020	10 g
Trifluoroacetic acid, 99%	SAMCHUN	T1666	100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets	Bruker	8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker