JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים עבור שיתוף L-dihydroxyphenylalanine biosynthesized מחומרים פשוטים המוצא הגנטי ויישומו חלבון ההטיה פרוטוקול.

Abstract

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) היא חומצת אמינו נמצאו ביוסינטזה של catecholamines, בעלי חיים וצמחים. בשל תכונותיו הביוכימי מסוים, חומצת אמינו ביותר יש שימושים מרובות יישומים ביוכימיים. הדו ח מתאר פרוטוקול עבור שיתוף גנטי biosynthesized DOPA ויישומו חלבון ההטיה. DOPA היא biosynthesized על-ידי טירוזין פנול-lyase (TPL) catechol, פירובט, אמוניה, חומצת אמינו ביותר מעוגנת ישירות לחלבונים בשיטת התאגדות גנטי באמצעות aminoacyl מפותחת-tRNA וזוג המעביר aminoacyl-tRNA. מערכת ישירה התאגדות זו משלבת ביעילות DOPA התאגדות הקטן של חומצות אמינו טבעיות אחרות, עם התשואה חלבון טוב יותר מאשר מערכת גנטית התאגדות הקודם עבור DOPA. ההטיה חלבון עם DOPA המכילים חלבונים הם יעילים גם בייעודי לאתר ויראה תועלתו ליישומים שונים. פרוטוקול זה מספק חלבון למדענים הליכים מפורטים ביוסינתזה יעיל של מוטציה חלבונים המכילים DOPA האתרים המבוקשים, ההטיה שלהם עבור יישומים תעשייתיים ובתחום הרוקחות.

Introduction

DOPA היא חומצת אמינו מעורב ביוסינטזה של catecholamines, בעלי חיים וצמחים. זו חומצת אמינו הוא מסונתז מן Tyr טירוזין hydroxylase, חמצן מולקולרי (O2)1. כי DOPA הוא סימן מקדים של דופמין, יכולים לחדור את מחסום דם - מוח, זה נעשה שימוש בטיפול של מחלת פרקינסון2. DOPA נמצא גם חלבונים אדהזיה מאסל (מפות), אשר אחראים על המאפיינים דבק של מולים ב התנאים הרטובים3,4,5,6,7. Tyr מקודד בתחילה על העמדות איפה DOPA הוא נמצא במפות, ואז מומר DOPA ב8,tyrosinases9. בשל תכונותיו הביוכימי מעניין, DOPA השתמשו במגוון רחב של יישומים. קבוצת dihydroxyl DOPA כימית נוטה ל, חומצת אמינו ביותר מומר בקלות L-dopaquinone, סימן מקדים של melanins. בגלל electrophilicity גבוהה שלה, L-dopaquinone ונגזרותיו שימשו crosslinking, ההטיה עם תיולים ו אמינים10,11,12,13. 1, 2-קווינונס יכול לפעול גם diene לתגובות cycloaddition, שימשו bioconjugation על ידי קידום-זן שבשליטת חמצון cyclooctyne-1, 2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. בנוסף, הקבוצה dihydroxyl יכול chelate יונים מתכתיים כגון Fe3 + ו- Cu2 +, כבר מנוצל חלבונים המכילים DOPA עבור משלוח סמים ויון מתכת חישה15,16.

יש כבר שולב חלבונים על-ידי שימוש aminoacyl-tRNA אורתוגונלית (aa-tRNA), ו aminoacyl-סינתזת המעביר (aaRS) זוג17 ונועד לשמש חלבון ההטיה, crosslinking10,11, גנטית DOPA 12,13. בדו ח זה, מתוארות תוצאות ניסויית ופרוטוקולים כהכנה לסיפוח DOPA biosynthesized של חומרי המוצא זול ושימושיה bioconjugation גנטית. DOPA הוא biosynthesized באמצעות TPL ו החל מ- catechol פירובט, אמוניה ב- Escherichia coli. Biosynthesized DOPA הוא ישירות שולב חלבונים על ידי הבעת זוג aa-tRNA, aaRS מפותחת עבור DOPA. בנוסף, החלבון biosynthesized המכיל DOPA הוא site-specifically מצומדת עם בדיקה פלורסנט, תפור לייצר חלבון oligomers. פרוטוקול זה להיות שימושי עבור מדענים חלבונים, חלבונים מוטציה biosynthesize המכיל DOPA, נזווג את החלבונים עם הגששים ביוכימי או סמים עבור יישומים תעשייתיים ובתחום הרוקחות.

Protocol

1. פלסמיד בנייה

  1. לבנות פלסמיד ביטוי (pBAD-כפול-TPL-GFP-WT) המבטאת את הגן TPL מן Citrobacter freundii תחת השליטה של מקדם מכוננת, הגן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) עם שלו6-תג תחת השליטה של יזם araBAD. עבור pBAD-כפול-TPL-GFP-E90TAG, החלף את codon עבור האתר (E90) של DOPA עם codon ענבר (תג), באמצעות פרוטוקול מוטגנזה. הפרטים לבנייה של פלסמיד זו תוארה בשנת הדוח הקודם שלנו18.
  2. לבנות tRNA/aaRS-ביטוי פלסמיד (pEVOL-DHPRS2)18,19 כהכנה לסיפוח DOPA גנטי. pEVOL הוא וקטור פלסמיד מיוחד להביע שני עותקים של גנים aaRS עם היזמים עצמאית, מידע מפורט של פלסמיד המתואר בדוח הקודם19.
  3. להשתמש ערכות הכנה פלסמיד זמינים מסחרית כדי להשיג טוהר גבוהה פלסמיד DNAs. לבדוק את טוהר DNAs שומר. על פרופיל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל agarose, במידת הצורך.

2. תרבות הכנה

  1. אלקטרופורציה
    1. שימוש המוסמכת-אלקטרו DH10β e. coli אסנן את הניסוי הזה. להוסיף 1 µL של כל פלסמיד דנ א (pEVOL-DHPRS2 ו- pBAD-כפול-TPL-GFP-E90TAG) 20 µL של תאים המוסמכת. מערבבים אותם בעדינות כדי להפוך את תערובת הומוגנית, באמצעות פיפטה.
    2. להעביר את התערובת וואקום אלקטרופורציה. מניחים את cuvette בבית הבליעה אלקטרופורציה. לדחוף את cuvette לתוך החדר כדי להפוך cuvette המשרד-לשכת קשר.
    3. לזעזע את cuvette, באמצעות 25 µF ו- 2.5 kV עבור כימיקלים 0.1-ס"מ.
    4. להוסיף 1 מ"ל prewarmed מרק סופר אופטימלית (SOC), המכיל 2% (w/v) טריפטון, 0.5% (w/v) שמרים תמצית 10 מ מ NaCl, 2.5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2, גלוקוז 20 מ מ, כדי cuvette, ולהעביר את התאים צינור תרבות. להציל את התאים על ידי המקננת בהם עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות.
    5. מורחים 10-100 µL של התאים שניצלו על צלחת אגר מרק (ליברות) lysogeny המכילה 35 µg/mL כלורמפניקול, אמפיצילין µg/mL 100. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
  2. הכנה תרבות starter
    1. לחסן מושבה טרנספורמציה יחיד ב 5 מ ל LB בינוני המכיל אנטיביוטיקה. דגירה המושבה במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות.

3. ביטוי ולטיהור GFP-E90DOPA על-ידי מערכת biosynthetic הוחלף נגזר

  1. ביטוי של GFP-E90DOPA על-ידי מערכת biosynthetic הוחלף נגזר
    1. להעביר את התרבות המתנע (2 מ"ל) 100 מ של הרשות הפלסטינית-5052 בינוני20 (50 מ מ נה2HPO4, 50 מ מ ח'2PO4, 25 מ מ [NH4]24, 2 מ מ MgSO4, 0.1% [w/v] לאתר מתכות, 0.5% [w/v] גליצרול. 0.05% [w/v] גלוקוז, חומצות אמינו 5% [w/v] [pH 7.25]) המכילה 35 µg/mL כלורמפניקול אמפיצילין µg/mL 100, 100 מ מ פירובט, catechol 10 מ מ, 25 מ מ אמוניה, dithiothreitol 300 מיקרומטר (DTT) ואחריו דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות.
    2. להוסיף 2 מ של 0.2% (w/v) L-אראבינוז כאשר הצפיפות האופטית (OD) ב 550 ננומטר מגיע ל 0.8. דגירה המדגם עבור 12 h ב- 30 מעלות צלזיוס ברעידות.
    3. ספין למטה התאים ב 11,000 x g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, להקפיא בגדר תא ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. פירוק התא
    1. הפשרת בגדר תא בקרח, resuspend התאים 10 מ"ל של פירוק מאגר המכיל 50 מ"מ NaH2PO4 (pH 8.0), imidazole 10 מ מ, ו-300 מ מ NaCl.
    2. Sonicate התאים resuspended בקרח במשך 10 דקות שימוש 80% sonication משרעת עם דופק של 25 s s ו-35 על ביטול.
    3. ספין למטה התא lysate ב g x 18,000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להעביר תגובת שיקוע לרכבת התחתית טריים לטיהור וזורקים בגדר.
  3. כרומטוגרפיית זיקה Ni-נ
    1. Ni-נ (חומצה nitrilotriacetic) שרף (300 µL של שרף השעיה על תרבות 100-mL) להוסיף תגובת שיקוע, לאגד את החלבונים שרף Ni-נ ב 4 ° C ע י ניעור בעדינות את המתלים לשעה.
    2. להעביר את המתלים עמודה פוליפרופילן ולשטוף את השרף 3 x 5 מ של שטיפת מאגר המכיל 50 מ"מ NaH2PO4 (pH 8.0), imidazole 20 מ מ, ו-300 מ מ NaCl.
    3. Elute את החלבונים 3 x עם 300 µL • תנאי מאגר המכיל 50 מ"מ NaH2PO4 (pH 8.0), imidazole 250 מ מ, ו-300 מ מ NaCl.
    4. לקבוע ריכוז החלבון על ידי מדידת את ספיגת ב 280 ננומטר. הכחדה המקדם (24,630 ז-1ס מ-1) עבור ה-GFP-E90DOPA-280 ננומטר מחושב על ידי חלבון הכחדה מקדם מחשבון (למשל, https://web.expasy.org/protparam/) והכחדה נמדד באופן עצמאי coefficiennt (2630 M-1ס מ-1) עבור DOPA. כאמצעי חלופי, השתמש assay חלבון21 ברדפורד קביעת ריכוז חלבון.

4. oligomerization של GFP מטוהרים-E90DOPA

  1. להוסיף 1 µL של נתרן periodate H2O (6 מ מ) (1.0 equiv. ל GFP-E90DOPA) את הפתרון של 20 µL של GFP-E90DOPA (300 מיקרומטר) ב בופר פוספט המכיל 50 מ מ נה2HPO4 (pH 8.0) ו-300 מ מ NaCl.
  2. לאפשר את התגובה oligomerization להמשיך ב 25 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  3. לנתח את תערובת התגובה ידי נתרן גופרתי-לזיהוי dodecyl בג'ל) (מרחביות-עמוד) כפי שמתואר בשלב 6.

5. ההטיה של GFP-E90DOPA עם בדיקה אלקין על ידי SPOCQ

  1. להוסיף 1 µL של מקושרים-Cy5.5 azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO)22 H2O (4.0 מ"מ) (10 equiv. ל GFP-E90DOPA) את הפתרון של 20 µL של GFP-E90DOPA (20 מיקרומטר) ב בופר פוספט המכיל 50 מ מ נה2HPO4 (pH 8.0) ו-300 מ מ NaCl.
  2. להוסיף 1 µL של נתרן periodate H2O (400 מיקרומטר) (1.0 equiv. ל GFP-E90DOPA) לתערובת התגובה.
  3. לאפשר את התגובה SPOCQ להמשיך 25 ° c עבור 1 h. אם בדיקה רגישים לאור, מכסים את כלי הקיבול של התגובה ברדיד אלומיניום.

6. טיהור של ה-GFP שכותרתו

  1. לדלל את התערובת תגובה SPOCQ על-ידי הוספת בופר פוספט, המכיל 50 מ מ נה2HPO4 (pH 8.0) ו-300 מ מ NaCl, µL עד 500.
  2. להעביר את הפתרון מדולל עמודה ספין צנטריפוגלי מסנן. Centrifuge העמודה ספין-x 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות וזורקים את הזרימה דרך. חזור על שלב 3 x כדי להסיר את כל העודפים של Cy5.5-ADIBO.
  3. להעביר את הדגימה מטוהרים מן העמודה ספין צינור 1.5-mL microcentrifuge.
  4. לחלופין, לבצע טיהור על-ידי דיאליזה נגד המאגר אותו.
  5. החנות GFP מטוהרים ב 4 º C.

7. מרחביות-דף ניתוח, קרינה פלואורסצנטית ג'ל סריקה

  1. להכין דגימות חלבון לניתוח מרחביות-דף על-ידי הוספת µL 5 חלבונים דוגמת המאגר (ראה טבלה של חומרים) 2 µL של DTT (1.00 מ') כדי µL 13 מטוהרים או גסה, ומתויגים GFP (13.6 מיקרומטר או 0.38 מ"ג/מ"ל). לשימוש ניתוח של oligomeric ה-GFP, ריכוז גבוה יותר של ה-GFP (67.8 מיקרומטר או 1.9 מ"ג/מ"ל). Denature את החלבונים על ידי המקננת בהם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. מקום קלטת ג'ל Bis-טריס מרחביות-דף 4-12% (ג'ל שנרכשו, premade מגרות) לתא אלקטרופורזה ולהוסיף מאגר הפעלה (ראה טבלה של חומרים). לטעון את דגימות חלבון, סמן משקל מולקולרי. הפעל את אלקטרופורזה במשך 35-40 דקות ב- 200 וולט.
    הערה: יש להימנע בכל חשיפה של הדגימות חלבון לאור על-ידי ביצוע כל התהליכים בחושך, כדי למזער את הלבנת לצילום של המכשיר פלורסנט.
  3. להשתמש בסורק זריחה זריחה הדמיה. לעטוף את ג'ל חלבון מ אלקטרופורזה ומניחים אותו על סורק זריחה. סרוק את הג'ל באמצעות הגדרה של אורך גל המתאים. עבור Cy5.5, לבחור את מצב Cy5 הניתנים שתוכנת הסורק.
  4. מכתים את הג'ל עם חלבון מסחרי מכתים מגיב.

8. MALDI-TOF MS ניתוח על ידי טריפסין עיכול

  1. דגירה µL 100 של מטוהרים GFP-E90DOPA (2.2 מ"ג/מ"ל או 80 מיקרומטר) במאגר המכיל 50 מ מ (pH 8.0), טריס-HCl 0.1% (w/v) מרחביות, ו- 25 מ מ DTT ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 h.
  2. להוסיף 1 µL של Iodoacetamide H2O (רשות העתיקות, 4.0 מ') (500 equiv. ל GFP-E90DOPA) אל הפתרון GFP-E90DOPA מטוהרים (80 מיקרומטר) במאגר אותו. דגירה התערובת ב 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם הגנה מפני אור.
  3. לעכל את הדגימה GFP-E90DOPA על-ידי הוספת טריפסין (יחס פרוטאז-כדי-המצע-חלבון מטריים [w/w]), דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
  4. לטהר את הדגימה פפטיד מתעכל באמצעות שיטה desalting סטנדרטית עם C18 ספין עמודות.
  5. לנתח את פפטידים מתעכל על ידי פרוטוקול דיווח עבור לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS) באמצעות חומצה אלפא-cyano-4-hydroxycinnamic (CHCA) כמו מטריקס23.

תוצאות

מערכת הביטוי עבור שיתוף ישיר DOPA biosynthesized מ TPL מוצג באיור1. הגנים עבור הזוג aa-tRNA, aaRS מפותחת ממוקמות על פלסמיד, גן ה-GFP (GFP-E90TAG) המכילה של codon ענבר במיקום 90 ממוקם פלסמיד אחר כדי להעריך את תיאגוד DOPA על-ידי קרינה פלואורסצנטית GFP. הגן TPL להציב את פלסמיד באותו ביטוי המכי...

Discussion

ב פרוטוקול זה, מתוארים ביוסינטזה של ישיר תיאגוד DOPA. לתא חיידקי שנמצא בשימוש בשיטה זו יכול לסנתז חומצה אמינית נוספים ולהשתמש בו בתור הבניין לא טבעי סינתזה של חלבון. שילוב גנטי של חומצות אמינו לא טבעי כבר טכנולוגיה המפתח לפיתוח אורגניזם לא טבעי עם קוד גנטי המורחב. עם זאת, שיטה זו כבר שלם מבחינ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הכללית הגבול (ה-NRF-2015M3A6A8065833), יסוד מדע מחקר התוכנית (2018R1A6A1A03024940) דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGoptionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10βInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser BIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Pyrocatechol, 99%SAMCHUNP138725 g
Ammonium sulfate, 99%SAMCHUNA0943500 g
pyruvic acid, 98%Alfa AesarA13875100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%SAMCHUNS08911 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%SAMCHUNP11271 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%SAMCHUND0092500 g
Glycerol, 99%SAMCHUNG02691 kg
Trace metal mix a5 with coSigma9294925 mL
L-Proline, 99%SAMCHUNP125725 g
L-Phenylalanine, 98.5%SAMCHUNP198225 g
L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
L-Arginine, 98%SAMCHUNA114925 g
L-Glutamine, 98%JUNSEI27340-031025 g
L-Asparagine monohydrate, 99%SAMCHUNA119825 g
L-MethionineJUNSEI73190-041025 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%SAMCHUNH060425 g
L-Threonine, 99%SAMCHUNT293825 g
L-LeucineJUNSEI87070-031025 g
Glycine, 99%SAMCHUNG028625 g
L-Glutamic acid, 99%SAMCHUNG023325 g
L-Alanine, 99%SAMCHUNA154325 g
L-Isoleucine, 99%SAMCHUNI104925 g
L-Valine, 99%SAMCHUNV008825 g
L-SerineSAMCHUNS244725 g
L-Aspartic acidSAMCHUNA120525 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%SAMCHUNL059225 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 millilitersSONIC & MATERIALSVCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112 well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging SystemSyngeneG BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%SAMCHUND1070250 g
IodoacetamideSigmaI61255 g
Trypsin Protease, MS GradeThermofisher900575 x 20 µg/pack
C-18 spin columnsThermofisher8987025/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%SAMCHUNA0125500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigmaC202010 g
Trifluoroacetic acid, 99%SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targetsBruker8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometerBruker

References

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138DOPAlyasecyclooctyne 12 quinone SPOCQ cycloaddition

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved