JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、単純な開始材料から L-ジヒドロキシフェニルアラニン生合成の遺伝的定款及びタンパク質接合への応用のためのプロトコルを提案する.

要約

L-ジヒドロキシフェニルアラニン (DOPA) は、動物や植物中のカテコールアミンの合成に存在するアミノ酸です。アミノ酸の特定の生化学的な特性のため生化学的アプリケーションで複数用途があります。このレポートでは、生合成されるドーパの定款の遺伝的プロトコルとその共役タンパク質への応用をについて説明します。ドーパは、チロシン フェノール-リアーゼ (TPL) カテコール、ピルビン酸とアンモニア、によって生合成とアミノ酸は直接進化したアミノアシル tRNA とアミノアシル tRNA 合成酵素のペアを使用して遺伝的結合法による蛋白質に組み込まれています。この直接混入システムは少し定款その他天然アミノ酸と DOPA の前の遺伝的結合システムよりもより良い蛋白質収量、DOPA 効率的に組み込まれています。ドーパ含有タンパク質とタンパク質共役なサイトと様々 な用途にその有用性を示しています。このプロトコルは、蛋白質科学者目的サイト、医薬・工業用の活用でドーパを含む突然変異体蛋白質の効率的な生合成のための詳細な手順を提供します。

概要

ドーパは、動物と植物のカテコールアミンの生合成に関与するアミノ酸です。このアミノ酸はチロシン水酸化酵素と分子酸素 (O2)1により Tyr から合成されます。ドーパはドーパミンの前駆体である、血液脳関門を透過することができますので、2パーキンソン病の治療に使用されています。DOPA はウェットコンディション3,4,5,6,7でムール貝との接着は、ムール貝の接着性蛋白 (地図) にもあります。Tyr は、当初ドーパがマップ内にある tyrosinases8,9によってドーパに変換されます位置でエンコードされます。その興味深い生化学的な特性のためドーパは、さまざまなアプリケーションで使用されています。ドーパの dihydroxyl グループは、化学的に酸化しやすく、アミノ酸、L-dopaquinone、粕の前駆体に簡単に変換します。おかげでその高の有する L dopaquinone およびその誘導体は、架橋とチオール化合物とアミン10、11,12,13と活用のため使用されています。1, 2-ベンゾキノンは環化付加反応のジエンとしても機能することができますおよびひずみ促進酸化制御 cyclooctyne-1, 2-キノン (SPOCQ) 環化付加反応による14化反応に使用されています。さらに、dihydroxyl グループは、Fe3 +と Cu2 +などの金属イオンをキレートすることができます、DOPA を含んでいる蛋白質は薬剤配達および15,16を検出金属イオンのため利用されています。

DOPA を遺伝的直交アミノアシル tRNA (aa tRNA) とアミノアシル tRNA 合成酵素 (aaRS) のペア17を使用して蛋白質に組み込まれて、タンパク質共役および架橋10、11,用12,13。本報告では, 実験結果と安価な開始材料と化反応への応用から DOPA 生合成の遺伝の混入のためのプロトコルを説明します。ドーパは、TPL を使用して大腸菌におけるアンモニア、ピルビン酸、カテコールから生合成されます。生合成されるドーパはドーパの進化した aa tRNA と aaRS のペアを表現することによってタンパク質に直接組み込まれます。また、ドーパを含む生合成タンパク質の蛍光プローブとオリゴマー蛋白質を生成する架橋共役は site-specifically。このプロトコルはドーパを含む動植物の突然変異体蛋白質に蛋白質科学者にとって役に立つ、生化学的プローブまたは医薬・工業用薬剤でタンパク質を共役します。

プロトコル

1. プラスミド構築

  1. 表現シトロバクター属 freundiiから TPL 遺伝子構成のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子発現プラスミド (pBAD-デュアル-TPL-GFP-WT) を構築6-タグの制御の下で、araBAD プロモーター。PBAD-デュアル-TPL-GFP-E90TAG サイト指示された突然変異誘発のプロトコルを使用してオレンジ色のコドン (タグ)、DOPA のサイト (E90) のコドンを交換してください。このプラスミッドの構造の詳細は、当社の以前のレポート18で説明しました。
  2. ドーパの定款の遺伝して、tRNA/aaRS 表現のプラスミド (pEVOL-DHPRS2)18,の19を構築します。pEVOL は独立したプロモーターの aaRS 遺伝子の 2 つのコピーを表現する特別なプラスミッドのベクトルとプラスミドの詳細な情報は以前報告19に記載されています。
  3. 市販のプラスミド調製キットを使用すると、高純度の保有するプラスミド Dna を取得できます。必要に応じて、agarose のゲルの電気泳動を使用して準備された Dna の純度を確認します。

2. 文化準備

  1. エレクトロポレーション
    1. この実験に使用電気有能なエシェリヒア属大腸菌DH10β ひずみ。有能なセルの 20 μ L に 1 μ L のそれぞれのプラスミッド DNA (pEVOL DHPRS2 と pBAD デュアル TPL GFP E90TAG) を追加します。ピペットを使用して、均質の混合物をように優しく混ぜます。
    2. エレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。キュヴェットをエレクトロポレーション室。キュベットを押し込むようにしっかりキュベット商工会議所商工会議所にお問い合わせください。
    3. キュベット、25 μ F を使用して衝撃を与えると 2.5 kV 0.1 cm キュヴェットのため。
    4. 2% (w/v) トリプトンを含む prewarmed 超最適スープ (SOC) の 1 mL を追加し、0.5% (w/v) 酵母エキス、10 mM の NaCl、2.5 mM KCl、MgCl2、10 mM と 20 mM グルコース、キュヴェットへ文化管にセルを転送します。セルを救出するには、揺れで 37 ° C で 1 時間インキュベートします。
    5. 35 μ g/mL クロラムフェニ コールと 100 μ g/mL アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレート上救出のセルの 10-100 μ L を広めます。16 h の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  2. スターター文化準備
    1. 抗生物質を含む LB 培地 5 ml 変形単一コロニーを接種します。揺れで 37 ° C で 12 h のコロニーを孵化させなさい。

3. 発現・精製合成システムによって GFP E90DOPA

  1. 生合成システムによる GFP E90DOPA の発現
    1. ペンシルバニア 5052 中20 (50 mM ナ2HPO4、50 ミリメートル KH2PO4、25 mM [NH4]24、2 mM MgSO40.1% [w/v] 微量金属、0.5% [w/v] グリセロール、100 mL にスターター文化 (2 mL) を転送します。0.05% [w/v] グルコースとアミノ酸 5% [w/v] [pH 7.25]) 続いて 35 μ g/mL クロラムフェニ コール、100 μ g/mL アンピシリン、100 mM ピルビン酸、カテコール 10 mM、25 mM アンモニア、および 300 μ M ジチオトレイトール (DTT) を含む振動 30 ° C で培養。
    2. 0.2% (w/v) L-アラビノースの 2 mL を追加し、550 nm に達すると 0.8 の光学濃度 (OD)。揺れで 30 ° C で 12 h サンプルをインキュベートします。
    3. スピン ・ ダウン 5 分 11,000 x g で細胞、上澄みを廃棄し、-80 ° C で細胞ペレットを凍結
  2. セル換散
    1. 氷の上細胞ペレットを解凍し、50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) を含む換散バッファーの 10 mL の細胞を再懸濁します 10 mM のイミダゾールと 300 mM の NaCl。
    2. 25 の 10 分使用 80% 超音波振幅パルスで氷の上再懸濁細胞を超音波 s オフと 35 s。
    3. 細胞ライセート 15 分浄化新鮮なチューブに上清転送のための 4 ° C で 18,000 × g でスピンダウンし、ペレットを破棄します。
  3. Ni NTA アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー
    1. 上清に Ni 国税庁 (ニトリロ三酢酸) 樹脂 (樹脂懸濁液 100 mL 文化のための 300 μ L) を追加し、1 h の懸濁液を優しく揺することによって蛋白質を 4 ° C で Ni NTA ガレージにバインドします。
    2. ポリプロピレン列に懸濁液を転送させ、樹脂 3 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) を含む洗浄バッファーの 5 ml x 20 mM のイミダゾールと 300 mM の NaCl。
    3. 3 タンパク質を溶出 300 μ L の溶出バッファーを含む 50 mM NaH2PO4 (pH 8.0) x 250 mM のイミダゾールと 300 mM の NaCl。
    4. 280 で吸光度を測定することによりタンパク質の濃度を決定する nm。280 GFP E90DOPA の消散係数 (24,630 M-1cm-1) nm を求めた蛋白質消光係数電卓 (例えばhttps://web.expasy.org/protparam/) と独立して消光ドーパの coefficiennt (2630 M-1cm-1)。別の方法として、蛋白質の集中の決定のためブラッドフォード蛋白質の試金21を使用します。

4. 精製 GFP E90DOPA の重合

  1. H2O (6 mM) の過ヨウ素酸ナトリウムの 1 μ L を追加 (1.0 GFP E90DOPA に当量) GFP E90DOPA の 20 μ L の溶液に (300 μ M) 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) を含むリン酸バッファーで、300 mM の NaCl。
  2. 48 h の 25 ° C で進行する重合反応を許可します。
  3. 反応混合物を分析すると、ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって) (SDS-PAGE) 手順 6 で説明しました。

5. SPOCQ でアルキン探針を用いた GFP E90DOPA の活用

  1. Cy5.5 リンク azadibenzocyclooctyne (Cy5.5 ADIBO)22 H2O (4.0 mM) 1 μ L を追加 (10 GFP E90DOPA に当量) GFP E90DOPA の 20 μ L の溶液に (20 μ M) 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) を含むリン酸バッファーで、300 mM の NaCl。
  2. H2O の過ヨウ素酸ナトリウムの 1 μ L を追加 (400 μ M) (1.0 GFP E90DOPA に当量) 反応混合物に。
  3. SPOCQ 反応を 25 ° C、1 h で実行を許可します。光に敏感なプローブを使用する場合は、アルミ箔で反作用の容器をカバーしてください。

6. ラベルの GFP の浄化

  1. 50 mM Na2HPO4 (pH 8.0) を含むリン酸バッファーを追加して SPOCQ 反応混合物を希薄化と 300 mM NaCl、最大 500 μ L。
  2. 希釈した溶液を遠心フィルター スピン列に転送します。スピン列 4 ° C 15 分で 14,000 × gで遠心分離し、流れを破棄します。任意の余分な Cy5.5 ADIBO を除去するために 3 x この手順を繰り返します。
  3. 1.5 mL 遠心チューブにスピン列から精製サンプルを転送します。
  4. また、同じバッファーに対して透析による浄化を行います。
  5. 4 ° C で精製された GFP を格納します。

7. SDS-PAGE 解析およびスキャン蛍光ゲル

  1. SDS-PAGE 分析用蛋白質のサンプルバッファーの 5 μ L を追加することによって蛋白質のサンプルを準備する (材料の表を参照してください)、精製、または原油の 13 μ L に地デジ (1.00 M) 2 μ L ラベル GFP (13.6 μ M または 0.38 mg/mL)。オリゴマーの GFP の解析、GFP (67.8 μ M または 1.9 mg/mL) の高濃度を使用します。95 ° C 10 分にそれらをインキュベートし、蛋白質を変化します。
  2. 電気泳動セルに 4%-12% ビス トリス SDS-PAGE ゲル カセット (カセット購入、あらかじめ作られたゲル) を配置し、実行バッファーを追加 (材料の表を参照してください)。蛋白質のサンプルと分子量マーカーを読み込みます。200 V で 35-40 分間電気泳動を実行します。
    注: は、蛍光プローブの光退色を最小限に抑えるため、暗闇の中のすべてのプロセスの遂行によって光に蛋白質のサンプルの任意の露出を避けてください。
  3. 蛍光イメージングのための蛍光スキャナーを使用します。タンパク質ゲル電気泳動からをラップし、蛍光スキャナーの上に置きます。ゲルをスキャンするには、適切な波長の設定を使用します。Cy5.5、スキャナー ソフトウェアで提供されている Cy5 モードを選択します。
  4. 試薬を汚す商業蛋白質のゲルを染色します。

8. MALDI-TOF MS を用いたトリプシンの消化力

  1. 精製の GFP-E90DOPA (2.2 mg/mL または 80 μ M) 50 mM トリス-HCl (pH 8.0) 0.1% を含むバッファー (w/v) SDS のと 60 ° C 1 時間で 25 mM DTT の 100 μ L を孵化させなさい。
  2. ヨードアセトアミド H2O (IAA、4.0 M) 1 μ L を追加 (500 GFP E90DOPA に当量) 同じバッファーにおける精製 GFP E90DOPA 液 (80 μ M) へ。光からの保護と 30 分のための 25 の ° C で混合物を孵化させなさい。
  3. トリプシン (1: 100 プロテアーゼの基質タンパク質比/w) を追加することによって GFP E90DOPA サンプルを消化し、4 h の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
  4. C18回転カラムを用いた標準脱塩法による消化ペプチドのサンプルを浄化します。
  5. マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析 (MALDI-TOF MS) をマトリックス23として α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) を使用して、報告されたプロトコルによって消化ペプチドを分析します。

結果

直接混入防止から DOPA 生合成の発現システムを図 1に示します。進化した aa tRNA と aaRS のペアのための遺伝子はプラスミドに配置され、GFP 蛍光で 90 の位置に黄色のコドンを含む GFP 遺伝子 (GFP E90TAG) DOPA の取り込みを評価するもう一つのプラスミドであります。TPL 遺伝子は GFP 遺伝子を含んでいる同じ発現プラスミドと DOPA の生合成の収率を最大...

ディスカッション

このプロトコルでは生合成と DOPA の直接の混入を説明します。このメソッドで使用される細菌の細胞は、他のアミノ酸を合成でき、タンパク質合成の不自然なビルディング ブロックとして使用します。遺伝的非天然型アミノ酸定款は、展開された遺伝コードと不自然な有機体の開発のためのキー技術をされています。ただし、このメソッドは技術的に完成されているし、定款の効率を改善し...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究は、地球フロンティア研究プログラム (NRF 2015M3A6A8065833)、によって支えられた、基本的な科学研究プログラム (2018R1A6A1A03024940) 韓国国立研究権財団 (NRF) を通じて韓国政府によって資金を供給します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAGoptionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS21. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10βInvitrogenC6400-03Expression Host
Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500 g
Ethidium bromideAlfa AesarL074821 g
LB BrothBD Difco244620500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser BIO-RAD165-2100
Micro pulser cuvetteBIO-RAD165-20890.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin SodiumWako018-1037225 g
ChloramphenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC mediumSigmaS1797100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99%Acros104981000100 g
Pyrocatechol, 99%SAMCHUNP138725 g
Ammonium sulfate, 99%SAMCHUNA0943500 g
pyruvic acid, 98%Alfa AesarA13875100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99%SAMCHUNS08911 kg
Potassium phophate, monobasic, 99%SAMCHUNP11271 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99%SAMCHUNM01461 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99%SAMCHUND0092500 g
Glycerol, 99%SAMCHUNG02691 kg
Trace metal mix a5 with coSigma9294925 mL
L-Proline, 99%SAMCHUNP125725 g
L-Phenylalanine, 98.5%SAMCHUNP198225 g
L-TryptophaneJUNSEI49550-031025 g
L-Arginine, 98%SAMCHUNA114925 g
L-Glutamine, 98%JUNSEI27340-031025 g
L-Asparagine monohydrate, 99%SAMCHUNA119825 g
L-MethionineJUNSEI73190-041025 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99%SAMCHUNH060425 g
L-Threonine, 99%SAMCHUNT293825 g
L-LeucineJUNSEI87070-031025 g
Glycine, 99%SAMCHUNG028625 g
L-Glutamic acid, 99%SAMCHUNG023325 g
L-Alanine, 99%SAMCHUNA154325 g
L-Isoleucine, 99%SAMCHUNI104925 g
L-Valine, 99%SAMCHUNV008825 g
L-SerineSAMCHUNS244725 g
L-Aspartic acidSAMCHUNA120525 g
L-Lysine monohydrochloride, 99%SAMCHUNL059225 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99%SAMCHUNI05781kg
Sodium phosphate monobasic, 98%SAMCHUNS09191 kg
Sodium Chloride, 99%SAMCHUNS29071 kg
Ultrasonic Processor - 150 microliters to 150 millilitersSONIC & MATERIALSVCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resinQIAGEN3021025 mL
Polypropylene columnQIAGEN3492450/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8&Acros4196100505 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersMILLIPOREUFC50039696/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 %Sigma1070898400110 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4XThermofisherNP000710 mL
MES running bufferThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gelsThermofisherNO032112 well
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging SystemSyngeneG BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%SAMCHUNT1351500 g
Hydrochloric acid, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85%SAMCHUND1070250 g
IodoacetamideSigmaI61255 g
Trypsin Protease, MS GradeThermofisher900575 x 20 µg/pack
C-18 spin columnsThermofisher8987025/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5%SAMCHUNA0125500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigmaC202010 g
Trifluoroacetic acid, 99%SAMCHUNT1666100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targetsBruker8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometerBruker

参考文献

  1. Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).
  2. Pinder, R. M. Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism. Nature. 228 (5269), 358 (1970).
  3. Waite, J. H., Tanzer, M. L. Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline. Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).
  4. Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. Single-molecule mechanics of mussel adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).
  5. Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis. Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).
  6. Waite, J. H., Qin, X. Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis. Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).
  7. Nicklisch, S. C., Waite, J. H. Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion. Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).
  8. Silverman, H. G., Roberto, F. Understanding marine mussel adhesion. Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).
  9. Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. Mussel-inspired adhesives and coatings. Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).
  10. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).
  11. Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker. Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).
  12. Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex. Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).
  13. Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes. Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).
  14. Borrmann, E., et al. Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).
  15. Ayyadurai, N., et al. Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein. Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).
  16. Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery. Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).
  17. Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).
  18. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  21. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  23. Gobom, J., et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).
  24. Mukai, T., et al. Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon. Scientific Reports. 5, 9699 (2015).
  25. Lajoie, M. J., et al. Genomically recoded organisms expand biological functions. Science. 342 (6156), 357-360 (2013).
  26. Bryson, D. I., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases. Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).
  27. Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).
  28. Lee, S., et al. A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones. Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).
  29. Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).
  30. Lang, K., Chin, J. W. Bioorthogonal reactions for labeling proteins. ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).
  31. Lang, K., Chin, J. W. Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  32. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  33. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

138 cyclooctyne 12 SPOCQ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved