实时定量聚合酶链反应检测感染细胞培养中的登革热病毒 rna

摘要

实时定量聚合酶链反应分析与逆转录酶链反应 (rt-qpcr) 相结合, 已被广泛用于测量 rna 病毒感染水平。在这里, 我们提出了一个直接的 rt-qpcr 检测, 不需要 rna 纯化步骤, 开发的几个 rna 病毒, 包括登革热病毒的定量。

摘要

目前, 实时聚合酶链反应 (pcr) 技术是研究实验室检测和定量病毒基因组以及分子诊断不可或缺的工具, 因为它具有灵敏度、特异性和特异性。方便。然而, 在大多数情况下, 通常用于检测病毒感染的定量 pcr (qpcr) 检测方法依赖于 pcr 步骤之前的病毒核酸纯化。本研究采用荧光逆转录酶 pcr (rt-qpcr) 相结合的方法, 结合加工缓冲液和一步 rt-pcr 试剂, 使病毒感染的培养上清液的收获过程达到了全过程。细胞, 直到实时检测, 可以执行没有病毒 rna 纯化。所建立的协议可在90分钟内对登革热病毒 (denv) 的多种 rna 浓度进行定量。此外, 直接 rt-qpcr 检测方法对抗病毒药物评价的适应性通过体外实验得到了证明, 该实验使用了先前报告的 denv 抑制剂霉酚酸 (mpa)。此外, 其他 rna 病毒, 包括黄热病病毒 (yfv)、基孔肯雅病毒 (chikv) 和麻疹病毒 (mev), 也可通过直接 rt-qpcr 用同一协议进行量化。因此, 本报告中描述的直接 rt-qpcr 检测方法有助于以简单、快速的方式监测 rna 病毒的复制, 这将进一步发展成为高通量筛选研究和临床诊断的一个有希望的平台。

引言

flaviviridae 家族的 flaviv000多个病毒由70多种包裹的正链 rna 病毒组成, 这些病毒是由蚊子和滴答声传播的。重要的是, 人的黄病毒感染往往导致严重的临床疾病, 如出血热和脑炎¹。事实上, 最近爆发的寨卡病毒 (zikv), 一种黄病毒, 已在整个美洲爆炸蔓延, 并已被证明与神经并发症, 包括^{小脑 2,3}。因此, 黄病毒对现代社会具有重大的临床和经济影响。

一种重要的黄病毒是登革热病毒 (denv), 这是一种蚊子传播的病毒, 广泛分布于世界热带和亚热带地区。denv 由白纹伊蚊(包括白纹伊蚊和埃及伊蚊)传播, 导致登革热疫情^在全球蔓延4。目前, 世界卫生组织 (世卫组织) 将登革热分为三类: 没有警示牌的登革热、有警示牌的登革热和严重登革热 4.尽管 denv (denv-1 至-4) 的四种血清型之一的初级感染往往是无症状或自我限制的, 但流行病学研究表明, 不同血清型的继发性感染会增加更严重形式登革热的风险。值得注意的是, 由初级感染期间产生的非或亚中和抗体引起的对臭氧病毒感染的抗体依赖增强已被认为是作为继发感染发生的严重登革热的潜在机制。然而, 没有特定的抗病毒药物可用于 denv 感染⁵。

对于针对 denv 的抗病毒药物的开发, 常规和强效检测对于定量检测病毒复制至关重要, 因为常规和强效检测适合高吞吐量设置。传统上, 用于定量传染性病毒的生物检测 (如斑块检测) 和用于检测病毒抗原的免疫检测 (例如, 酶联免疫吸附法 (elisa)) 已用于监测 denv在体外和体内^复制6^,7。然而, 这些检测往往是费力的, 需要几天的时间来完成, 这阻碍了大量样品的处理。在这方面, rt-qpcr 是检测 denv 感染的可靠方法: 它是特异性的、敏感的和相对快速^{的 7}。此外, rt-qpcr 技术在高通量格式中具有更多优势。然而, rna 病毒的 rt-pcr 典型程序要求从采集到的样本中回收病毒核酸。虽然 rt-qpcr 可以采用各种提取方法, 但仍需采取多个步骤来获得纯化的病毒 rna。此外, rt-qpcr 检测通常需要昂贵的自旋柱或危险的有机溶剂, 从而使制备过程更加繁琐。由于避免样品之间处理不当和交叉污染是病毒基因组成功定量的关键因素, 因此最好采用一种不费力、耗时的方法, 特别是在应用 rt-qpcr 的情况下。高吞吐量格式。

在这里, 我们报告一个简单的 rt-qpcr 程序, 用于测量 denv rna 在感染细胞的培养上清液中, 不涉及病毒 rna 纯化。该优化的 rt-qpcr 协议由两个步骤组成: (一) 用处理缓冲液培养感染 denv 的细胞培养的上清液, 以及 (二) 在实时 pcr 仪器上的一步 rt-qpcr。因此, 培养中的 denv rna 可在90分钟内检测到 (图 1)。我们还描述了直接 rt-qpcr 在其他 rna 病毒感染中的应用。

研究方案

1. rna 标准 dna 模板的制备

1. 制备 pcr 混合物 (总体积为 50μl,表 1) 使用含有 denv-2 巴布亚新几内亚 c 的质粒 dna 载体 (ngc, 加入号: af038403.1) 3 ' 未翻译区域 (3 ' utr)⁸和引物 (t7-denv 3 ' utr fwd 和 denv 3 ' utr rvs) 在0.2 毫升管中, 作为表 2中所述。
   注: 此步骤应在清洁罩下 (或在洁净室) 下进行, 以避免任何与放大相关的产品受到污染。
2. pcr 在热循环器中扩增 t7 序列熔融 denv 3 ' utr 的 cdna, 使用以下条件: 30次循环 (98°c 为 10秒, 55°c 为 5秒, 72°c 为 5秒)。
3. 将 pcr 反应与6x 凝胶负载染料10μl 混合, 并将其加载到1% 琼脂糖凝胶上, dna 分子阶梯的范围为0.1 至10千卡卡 (kbp)。
4. 使用 dna 可视化方法和凝胶成像系统, 在长波长紫外光下可视化 pcr 产物 (479个碱基对 [bp])。用干净的手术刀切掉 dna 带。
5. 使用 dna 纯化试剂盒 (材料表) 提取 dna。
   注: 此纯化步骤可以在清洁罩外执行, 但在使用过程中必须保持清洁环境, 以避免 rnase 污染, 这是以下 denv rna 标准合成步骤中的一个主要问题。
   1. 称量凝胶片, 每100毫克凝胶片在 1.5 ml 微离心管中添加100μl 的捕获缓冲液。
   2. 在60°c 孵育 5-15分钟, 将凝胶溶解。
   3. 将 dna 纯化柱与收集管组合在一起, 并将溶解样品的600μl 转移到纯化柱。
   4. 以 16, 000 x g的速度离心 30秒, 并丢弃流经。如果样品体积大于 600μl, 则在第一次转旋后将样品的其余部分应用到 dna 纯化柱上, 并重复此步骤。
   5. 在 dna 纯化柱上应用500μl 洗涤缓冲液。
   6. 离心机以 16, 000 x g为30秒。
   7. 将柱放入新的 1.5 ml 微离心管中。
   8. 加入50μl 洗脱缓冲液, 在室温下孵育柱1分钟。
   9. 以最大速度离心1分钟以清除 dna。
6. 在分光光度计上使用3微米的洗脱样品测量260纳米的 dna 光学密度。使用与空白相同的洗脱缓冲区量。
   注: dna 模板可在-20°c 下存储, 直至使用。

2. denv 3 ' utr rna 标准的合成

注: 尽可能保持无核糖核酸酶 (rnase) 环境, 以执行以下步骤。试剂的设置应在清洁的引擎盖内进行, 使用无核酸的吸管、尖头和管。

1. 如表 3所示,将体外转录 (总体积为 20μl) 与 t7 rna 启动子序列融合 denv 3 ' utr dna 模板 (从步骤1.6 开始) 100 ng 混合在 0.2 ml pcr 管中。
2. 在37°c 时将混合物在热环器中培养2小时。
3. 在 ivt 反应中加入1μl 的 dnt 酶, 在37°c 下继续孵育15分钟。
4. 使用 rna 纯化试剂盒 (材料表) 纯化体外转录 rna。
   1. 加入80μl 的无 rnase h2o 和350μl 的捕获缓冲液, 包括1% 的β-硫醇.
   2. 在 ivt 反应中加入250μl 的100% 乙醇, 并通过移液将其充分混合。
   3. 将 rna 纯化柱与收集管组合在一起, 并将 rna 样品转移到纯化柱。
   4. 将其离心为 8, 000 x g,持续 15秒, 并丢弃流经。
   5. 在 rna 纯化柱上涂500μl 洗涤缓冲液, 并以 8, 000 x克离心2分钟。
   6. 将柱放入 1.5 ml 的微离心管中。
   7. 加入50μl 的无 rnase_h2o,在室温下孵育柱1分钟。
   8. 以最大速度离心 1分钟, 以清除 rna。
5. 在分光光度计上, 使用洗脱样品的3μl 测量260纳米的 rna 光学密度。使用相同的_h2o卷作为空白。
6. 确定合成的 denv 3 ' utr rna 的拷贝数。1纳克的 denv 3 ' utr rna (462个碱基,图 2) 可与 4.05 x 10 9份^副本相媲美。
7. 将 rna 标准存放在-80°c, 直至使用。

3. rt-qpcr 病毒样品的处理

注: 步骤3.1–3.3 应在生物安全柜内执行。特别是, 含有传染性病毒的培养上清液的处理必须在生物安全 2级 (或更高) 环境下进行。

1. 混合199μl 的加工缓冲液和1μl 的无核酸酶 k。
2. 使用细胞培养基 (例如, dmem 补充10% 的牛血清和抗生素 [demc/10% fbs]),将合成的 denv 3 ' utr rna (从步骤 2.6) 1:10, 以获得 5 x 10 9 至 5 x¹⁰ 3 cisiesμμμl rna 标准 (例如, dmem 补充 10% fbs])含有40种 units/rnase 抑制剂。
3. 使用8管 pcr 条或96孔 pcr 板, 将感染 denv 的细胞培养上清液与 denv 3 ' utr rna 标准与5μl 的加工蛋白酶 k 溶液 (从步骤 3.1) 混合。作为一种非模板控制 (ntc), 将5μl 的细胞培养基 (即不含病毒) 与5μl 的加工缓冲蛋白酶 k 溶液混合。
4. 经过短暂的离心后, 使用以下条件将样品孵育在热环器中: 1个循环 (25°c 10分钟, 75°c, 5分钟)。
   注: 如果在同一天进行实时 pcr 分析, 处理后的样品可以保存在4°c。为了长期储存, 样品应储存在-80°c。

4. 实时 pcr 分析

注: 强烈建议在清洁罩内执行步骤 4.1-4.4, 以最大限度地减少任何与振幅相关的产品或 rnase 的污染。

1. 使用 denv 3 ' utr 特特特定引物和荧光探针 (表 1), 在 1.5 ml 微离心管 (无 RNase-free) 中使用一步 rt-pcr 试剂 (材料表)制备 rt-qpcr 主混合物。根据样本总数的 11%, 包括标准 rna 和 ntc 反应, 扩大每个成分的体积 (表 4)。
2. 将在96孔实时 pcr 板 (材料表) 中使用的主混料液中的 alquot 8μl。
3. 对处理过的样品进行简单的离心, 包括 denv 3 ' utr rna 标准和 ntc (从步骤 3.4), 并将样品的2μl 添加到96井实时 pcr 板的每一口井中。
4. 用光学透明的胶粘膜密封 pcr 板。
5. 以 200 x克的速度对板材进行简单的离心, 以去除气泡。
6. 将板材放置在实时 pcr 仪器中, 并使用以下条件循环板材: 1个 rt 阶段周期 (25°c 10分钟)、1个聚合酶活化阶段周期 (95°c 为 2分钟)、40个放大阶段周期 (95°c 为 10秒, 60°c 为 30秒) [此步骤的单个数据采集])。
7. 使用与 pcr 相关的实时软件确定样本中 denv rna 的复制编号。
   1. 在 "设置"窗口中, 指定要分析为"未知" 示例的反应井。
   2. 指定连续稀释的 denv 3 ' utr rna 井为标准, 并在每口井中键入 rna 标准的预期副本数 (例如, 如果使用 5 x¹⁰ 3 copiesμμl rna 标准溶液,类型为 5, 000)。为 ntc 分配负控制。
   3. 在 "分析" 窗口中, 单击"分析" , 并确保生成的标准曲线的相关系数 (r2) 等效于或大于 0.98.
   4. 通常, 使用默认 ct 设置 (阈值: 自动, 基线开始周期: 自动, 基线结束周期: 自动) 进行分析。
      注:未知样本的复制编号将根据各个反应的阈值周期 (ct) 值自动计算。每个样本的计算副本编号被视为每10μl rt-qpcr 反应的 rna 拷贝(例如, 如果在未知样本中显示12, 345份, 这意味着在未知样本中存在 12, 345份 denv rna 拷贝。反应)。

结果

对于 rt-qpcr 分析对 denv rna 进行定量, 已知拷贝数的标准是一个先决条件, 该标准可以通过相同的引物集检测到。在该协议中, 含有 denv-2 ngc 菌株 3 ' utr 序列的462个核苷酸长 rna 从 t7 rna 启动子熔融 denv-2 ' utr dna 模板体外转录, 该模板已通过 pcr 扩增并纯化 (图 2 a 和当标准 denv rna 连续10倍稀释 (从 5 x 10 9 到 5 x 10 2 拷贝在 10μl rt-qpcr 反应中) 时, 使用 3 ' utr特特异性引物和氟探针⁹(线性) 进行直接的 rt-qpcr 分析得到了相关系数好的曲线 (r₂ = 0.987 26) (图 2c)。

其次, 应用该直接 rt-qpcr 检测方法对感染病毒细胞培养上清液中的 denv 进行了定量。denv-2 (新加坡分离体 eden2 3295¹⁰) 在 C6/36 蚊子细胞^中繁殖, 并利用 bhk-21 细胞11进行斑块分析, 连续稀释 (从 8 x^{10 6 到}80个斑块形成单元 [pfu]/ml)。然后用含有蛋白酶 k 的等量的处理缓冲液对 denv 样品进行处理, 以清除病毒, 并进行针对 denv 3 ' utr rna 序列的直接 rt-qpcr 检测。再次, 得到了一个很好的相关性 (r² = 0.99981) 之间的 denv 传染滴度和 ct, 一个周期数字, 被认为是点, 荧光信号上升与指数增长以上的背景, 获得了 (图 3 a)。当使用体外转录 3 ' utr rna 制作的标准曲线上绘制由连续稀释 denv 库存产生的 ct 值时 , 从 8 x 10 6 到 80 puum/l 获得的所有图 (等于 8 x^{10 3 到}在 10μl rt-qpcr 反应中的 8 x 10-2 pfu) 在标准 rna 的范围内 (5 x 10 9 到 5 x 10 x 10在 10μl rt-qpcr 反应中,图 3b), 表明 denv 样品具有广泛的传染性可以同时分析滴度, 使用这种直接的 rt-qpcr。在平行实验中, 研究了用 rt-qpcr 分析处理缓冲液或蛋白酶 k 治疗对病毒 rna 检测的影响。尽管先使用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 对 denv 样品 (8 x¹⁰ 6 至 8^{x 10} 2 ppu/l) 进行日志稀释处理对 rt-qpcr (1:1 稀释病毒样本与 pbs 和孵育 25°c 10分钟和 75°c 5分钟) 得到了 回归曲线 (图 3c, 黑线) 和 pbs 处理获得的平均 ct 值与处理缓冲蛋白酶 k 处理获得的 ct 相比, 延迟了2.6-3.2 周期 (图 3c, 虚线)。此外, 这种 pbs 处理无法检测到病毒的最高稀释度 (8 x 10 2 ppu/l [8 x 10-1 pfu 每 10μl rt-qpcr 反应]) (图 3c).在处理缓冲处理过程中没有蛋白酶 k (图 3c, 灰线), 也会产生类似的回归;然而, 相对于含有蛋白酶 k 的加工反应 (图 3c, 虚线), 仍然观察到扩增延迟 (0.1-0.8循环)。这些数据表明, 在所测试的条件中, 用处理缓冲液和蛋白酶 k 处理 denv 样品可以提高 rt-qpcr 检测的灵敏度。

直接 rt-qpcr 检测进一步评估了其在检测 denv 抗病毒药物方面的适用性。霉酚酸 (mpa) 是一种单磷酸肌脱氢酶的非核苷抑制剂, 在移植^中用作免疫抑制剂, 在体外12^,13被报道抑制 denv。尽管以前的研究采用了常规的斑块检测或流式细胞仪检测病毒抗原来证明 mpa 对 denv^{感染 12,13}的抑制作用, 但在本研究中, 直接 rt-qpcr 是用于评估 mpa 的抗病毒活性。在感染前1天在24井板中播种密度为 5x10 4的 hela 细胞, 在1h 的 moi 下暴露在 denv-2 中, 经清洗后, 在 50–0.016 gm/l/(或0.1% 的二甲基亚硫酸 [dmso])。本培养上清液在感染3天后采集, 并采用 denv3 ' utr 特异性引物和荧光探针进行直接 rt-qpcr 检测。图 4显示了在受感染细胞的培养中的 denv rna 拷贝 (每个反应), 这些细胞的 mpa 浓度不断增加, 由体外转录的 3 ' utr rna 标准测定。通过 50μgml (156μm) mpa 处理, 可以将 dmso 处理后的控制培养物减少到 99.87±0.02% (图 4)。重要的是,由图 4所示数据确定的 mpa ic₅₀ (50% 抑制浓度) 值为0.79 微米, 与先前报告的^12,13的值相似。因此, 这一结果表明, 这种直接的 rt-qpcr 检测方法是评估抗病毒药物对 denv 感染的抑制作用的一种有用和可靠的方法。

最后, 测试了直接 rt-qpcr 检测在其他 rna 病毒中的应用。当在 vero 细胞中扩增并在 bhm-21 细胞上滴定的黄热病病毒 (yfv) 17d 疫苗株 (Flaviviridae) 中, 使用 yfv-17d 特异性引物和氟探针¹⁴直接接受 rt-qpcr, 如如表 1所述, 通过10倍连续稀释病毒库存 (3.2 x 10 至 3.2 puum/l, 图5a⁾ , 可以生成病毒滴度与 ct 值之间具有良好直接相关性的标准曲线。同样, 直接 rt-qpcr 分析基孔肯雅病毒 (chikv, togaviridae) ross 菌株库, 该菌株在 vero 细胞中被扩增, 并在 bhk-21 细胞上滴定, 使用 chikv 特异性引物和荧光探针 15 (表 1),在传染性滴度 (4.4 x 10 8 到 4.4 x¹⁰ x 10 3 puml) 和 ct 值 (图 5b) 之间有很好的回归.这也是检测麻疹病毒 (mev^、 paramyoviridae) 的系列稀释 (8 x 10 2 至⁸ x 10-2 puum/ml,图 5c) 的情况, 以前使用的是 vero 细胞的传播和滴定。报告的引物和氟原探针¹⁶ (表 1)。这些数据证明了直接 rt-qpcr 检测方法对各种 rna 病毒定量检测的适应性。

图 1: 直接 rt-qpcr 检测的工作流程.用含有蛋白酶 k 的处理缓冲液对感染 denv 的细胞进行培养上清液处理, 释放病毒 rna (样品处理步骤)。然后将处理后的样品与一步 rt-pcr 试剂混合, 并使用 denv 3 ' utr 特异性引物和荧光探针进行实时 pcr 检测。在各自样本中检测到的病毒 rna 水平可以通过体外转录 denv rna 的连续稀释标准来确定。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: denv 3 ' utr rna 生成的标准曲线.(a) 从 t7 rna 启动子序列融合 pcr 片段中外传含有 3 ' utr 的 denv-2 ngc 的标准 rna。(b) 在1% 琼脂糖凝胶 (右车道) 上显示纯化的 denv 3 ' utr rna (250 纳克)。左车道显示了 rna 电泳的分子量标记。(c) 使用含有蛋白酶 k 的加工缓冲液对 denv 3 ' utr rna 标准进行日志稀释, 并使用一步 rt-qpcr 试剂和 denv 3 ' utr 特异性引物和荧光探针组进行实时 pcr 分析。在各自稀释中获得的平均 ct 值 (n = 3) 是根据 3 ' utr rna 的估计数量绘制的 (在10μl rt-qpcr 反应中, 5 x 10 9 到 5 x^{10 x 10} 2 rna 副本)。^r2是相关系数。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 直接 rt-qpcr 对病毒库存中的 denv rna 进行定量.(a) 在 c626 细胞中生产的高滴度 denv-2 库存被连续稀释 10倍 (8 x^{10 6}至 8 x^{10 x 10} 1 pfu ml), dmem% fbs 含有 rnase 抑制剂, 并使用 denv 3 ' utt 特异性引物进行直接 rt-qpcr 检测比普里(b) 用日志稀释 denv 股票 (圆圈) 的 rt-qpcr 获得的 ct 值绘制在 3 ' utr rna (三角形) 在体外转录的标准曲线上。在直接 rt-qpcr 检测中使用 8 x¹⁰ 6 pfu 或库存相当于 10μl rt-qpcr 反应中的 8 x 10 3 pfu 病毒.(c) 该面板显示了处理缓冲液和蛋白酶 k 处理对病毒 rna 检测的影响。denv 稀释库存 (8 x 10⁶至 8 x^{8 x 10 2} ppul) 用同等数量的处理缓冲液孵育, 其中含有蛋白酶 k (白圈)、单独处理缓冲液 (灰圈) 或 pbs (黑圈), 然后直接进行直接rt-qpcr 检测。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 直接 rt-qpcr 评价 mpa 的抑制作用.hela 细胞在1的 moi 下被感染 denv-2, 并在 mpa 浓度不断增加的情况下培养, mpa 是先前报告的 denv 抑制剂 (或 0.1% dmso)。感染三天后, 收集受感染细胞的培养上清液, 并采用 denv 3 ' utr 特异性引物探针进行直接 rt-qpcr 检测。病毒 rna 的拷贝数是用 denv 3 ' utr rna 标准体外转录确定的。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 直接 rt-qpcr 检测其他 rna 病毒的应用.对 (a) yfv、(b) chikv 和 (c) mev 的系列稀释病毒库存进行了直接的 rt-qpcr 检测, 使用 pcr 引物和各自病毒 rna 序列特有的荧光探针。请点击这里查看此图的较大版本.

目的	名字	序列 (5 '-3 ')	注意
t7 启动子熔融 denv-2 3 ' utr cdna 扩增	t7-denv 3 ' utr fwd	taac gaa tca tcatag gaa c gaa t ta gaagggc aaa act aac atg aac ag aac aaa	意大利 t7 促进剂;小写, 间隔;粗体, denv-2 ngc 核苷酸10270-10292
	denv 3 ' utr rvs	aga acc tgt tga ttc aac agc	denv-2 ngc 核苷酸10723-10703
denv 的 rt-qpcr 分析	denv-2 3 ' utr f	aag gac tag agg tta gag gag acc c	参考9
	denv-2 3 ' utr	ggc gtg tgg tgc ctg gaa tgg
	探头 2 den-2-4	6am-aac agc ata ttg acg gga aag acc-tamra
yfv 的 rt-qpcr 分析	yfv ns5 f	gaa cag tga tca gga acc ctct	参考14
	yfv ns5 r	gga tgt ttt cac agt aaa tgt g
	yfv ns5 探头	6fam-cta cgt tgg agc ccg cag cag caa t-tamra
chikv 的 rt-qpcr 分析	chik e1 f	cgg cgc ctt ctt taa	参考15
	chik e1r	atc gaa tgc acc gca cac t
	chik e1 p	6am-acc agc ctg ccca ttc ctct ct aga c-tamra
mev 的 rt-qpcr 分析	mev n f	tgg cat ctg aac tcg gta tca c	参考16
	mev n r	tgt cct cag tag tat gca ttg caa
	mev n p	6fam-ccg agg atg caa ggc ttg ttt cag a-tamra

表 1: 本研究中使用的寡核苷酸引物和荧光探针序列。

组件	库存集中度	体积 (μl)	最终浓度
primestar 最大预混料	2倍	25	1个
t7-denv 3 ' utr fwd	1μm	10	200 nm
denv 3 ' utr rvs	1μm	10	200 nm
pEU/DENV 3 ' utr	1 ngμl	1	20 pg/μl
无核酸酶 h2o		4个
总		50

表 2: 用于制备 denv 3 ' utr 模板 dna 的 pcr 混合物的成分。

组件	库存集中度	体积 (μl)	最终浓度
t7 序列融合 denv 3 ' utr dna 模板	(变量)	X	每次反应100纳克
atp 解决方案	75 mm	2	7.5 米
ctp 解决方案	75 mm	2	7.5 米
gtp 解决方案	75 mm	2	7.5 米
utp 解决方案	75 mm	2	7.5 米
反应缓冲器	10倍	2	1个
t7 酶混合物		2
重组 rnase 抑制剂	40 units/μl	1	2个 units/μl
无核酸酶 h2o		7-x
总		20

表 3: 用于合成 denv 3 ' utr rna 标准的 ivt 混合物的成分。

组件	库存集中度	体积 (μl)	rt-qpcr 反应中的最终浓度
itaq 万能探针反应混合物	2倍	5.00	1个
高级逆转录酶	40x	0.25	每次反应100纳克
primer/探针混合	denv-2 3 ' utr f:3μm	1.00	300 nm
	denv-2 3 ' utr:3μm		300 nm
	探头 2 den-2-4: 2μm		200 nm
无核酸酶 h2o		1.75
次 全 切除		8.00

表 4: 用于实时 denv rna rna rt-qpcr 分析的主混合物的成分.请注意, 加工后的 denv 样品 (或标准 rna) 应添加到8μl 主混合中 (每次反应共 10μl)。

讨论

目前, 基于荧光的实时 pcr 检测病毒核酸由于其敏感性和快速性, 正在成为人类病原病毒分子诊断的黄金标准.这对于确认登革热等急性传染病的早期感染特别重要.此外, 在 dnev 基础研究领域, rt-qpcr 检测是监测病毒体外培养中复制的一个不可或缺的工具, 这将导致对 denv 复制生物学的理解和抗病毒抑制剂的发现。在这项研究中, 基于荧光的实时 pcr 检测进一步发展了结合一个处理缓冲液和一步 rt-pcr 试剂, 使 denv rna 在被感染细胞的培养上清液能够量化, 而无需纯化病毒 rna 基因组。与常规检测检测病毒复制 (如斑块检测、elisa 或常规 rt-qpcr) 相比, 采用 rna 纯化 6^,7, rt-qpcr 检测的简化协议极大地缩短了时间和^时间。量化 denv rna 所需的步骤。这也是一个重要的特点, 在最大限度地减少遗传物质的污染和损失方面具有优势。然而, 应当指出, 在设置 ivt (第2.1 步) 和 rt-qpcr (第4.1–4.4 步) 反应时, 使用清洁罩是必不可少的, 以避免任何与放大相关的产品或 rnase 交叉污染。在生物安全柜内处理包括传染性病毒在内的培养上清液 (步骤 3.3), 以减少实验室感染的风险也至关重要。

直接 rt-qpcr 检测的另一个意义是, 可以同时分析范围广泛的病毒 rna 拷贝, 而不会稀释或浓缩样品。当使用连续稀释的 denv 3 ' utr rna 标准时, 直接 rt-qpcr 协议产生了一个超过7个数量级的线性标准曲线, 较低的量化极限为500na 拷贝 (图 2)。为了检测受感染细胞培养中的 denv, 10μl rt-qpcr 中的 8 x 10 3 至⁸ x 10-2 pfu 病毒在 denv 3 ' utr rna 标准的范围内, 并计算出较低的检测限 (8 x 10-2 pfu) 包含 11, 400±7, 077 rna 拷贝 (图 3b)。值得注意的是, 正如^18、19、20项黄病毒研究报告所报告的那样, 在本研究中还观察到 denv 样本中病毒 rna 拷贝与病毒感染滴度 (即pfu) 的比例较大。这种高估被认为主要是由于存在有缺陷 (即非传染性) 病毒或从被感染和死亡细胞释放的游离病毒 rna。尽管本研究中获得的 rna 拷贝比例 (1.1 x¹⁰至 1.3 x^{10 x 10 x 10 x 10 x 10 x 10 x 10 x 10} rna copiesbu) 与前面显示的数据不一致 (比率从1到 3^{log) 21,20, 这}可能是归因于病毒株、细胞或所使用的培养条件的差异。造成这种差异的另一个可能的解释是, 由于本文所述的直接 rt-qpcr 检测过程中没有 rna 纯化过程, 因此通过实时 pcr 分析可以检测到培养中更多的 denv rna, 而不会丢失病毒遗传物质。

直接 rt-qpcr 的简单性增强了以多孔格式处理大量样品 (如96孔板) 的能力。因此, 该特性将有助于未来将直接 rt-qpcr 检测方法应用于发现抗 denv 药物的高通量筛选研究。事实上, 在本报告中, 研究了直接 rt-qpcr 检测方法在验证抗 denv 抑制剂 mpa 方面的应用, 结果表明, 直接 rt-qpcr 检测法 (图 4) 获得的 mpa ic₅₀值与在以前的研究中报告^{使用斑块检测 12,13}。这表明直接 rt-qpcr 是一种有效的检测方法, 可以适当地评价抗病毒药物的抑制作用, 并可用于药物筛选研究在未来。

在这项研究中, 尝试将直接 rt-qpcr 应用于其他 rna 病毒的检测。如图 5所示, 当将另外三种 rna 病毒 (yfv、chikv 和 mev) 的10倍稀释分为不同的属 (分别为flaviviridae、 togaviridae和paramyoviridae)时, 使用以前报告的引物和荧光探针特定于各自的病毒 rna 序列。通过直接 rt-qpcr 检测得到了传染性滴度与 ct 值之间的良好相关性, 相关性为4-6 个数量级。这表明, 直接 rt-qpcr 协议是适应各种类型的 rna 病毒, 只需改变病毒特异性引物和荧光探针。

然而, 在本研究中测试的病毒中, 检测的敏感性各不相同 (图 5)。该协议的一个修改, 可以提高检测目标病毒 rna 应该是使用一组新的原始探针序列。此外, 成功的直接 rt-qpcr 检测的一个关键步骤被认为是在样品处理步骤 (步骤 3.1-3.4) 期间有效释放病毒基因组。这对于定量检测稳定病毒 (如非包络病毒) 尤其重要。虽然作为初步实验, Coxsackievirus b3 (cvb3), 一种属于picornaviridae的非包膜 rna 病毒, 但使用前面描述的 cvb3 特异性引物和荧光探针²²进行了直接 rt-qpcr 检测。即使使用高滴度 (1 x^{10 5} puxl) 病毒库存, 也无法检测到正放大器信号。这在很大程度上被认为是由于非包络病毒的高度物理完整性造成的。到目前为止, 一些不需要纯化核酸的 rt-pcr 检测方法已经开发出来, 以检测几种 rna 病毒, 它们在 rna 释放步骤^{23、24、25中使用不同的协议, 26}. 因此, 使用替代 (或额外) 治疗方法, 如在高温下培养病毒样本, 有可能提高检测的敏感性。

总之, 本研究开发的直接 rt-qpcr 协议是一种简单、快速、可靠的病毒 rna 定量方法, 用于量化受感染细胞培养上清液中的病毒 rna。由于这种简单性, 直接 rt-qpcr 检测可以在短时间内处理多个样本, 这对病毒复制的高通量分析是有希望的。此外, 还证明了直接 rt-qpcr 协议在其他 rna 病毒中的应用。因此, 这种方法应该是一个有用的工具, 有效地监测 rna 病毒感染在研究实验室的环境中, 并可能在临床诊断。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PrimeSTAR Max DNA Polymerase	Takara Bio. Inc	R045A	Comparable PCR reagent kit can be used.
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
6x Gel Loading Dye	New England BioLabs	B7024S	Comparable gel loading dye can be used.
2-Log DNA Ladder	New England BioLabs	N3200	0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.
Gel Scene Tablet	Astec	GST-33	Comparable gel imaging system can be used.
illustra GFX PCR Purification Kit	GE Healthcare Life Sciences	28-9034-70	Comparable gel extraction kit can be used.
BioSpectrometer	Eppendorf	6135000905	Comparable spectrophotometer can be used.
MEGAscrip T7 Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1334
TURBO DNase	Thermo Fisher Scientific	AM2238	Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Comparable RNA purification kit can be used.
CellAmp Direct RNA Prep Kit	Takara Bio. Inc	3733Q
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	> 600 units/mL. Comparable reagent can be used.
iTaq Universal Probes One-Step Kit	Bio-Rad	1725141
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.
StepOnePlus Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	StepOnePlus-01	Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.