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要約

逆のトランスクリプション (RT qPCR) と組み合わせてリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応分析は、RNA ウイルス感染のレベルを測定するため広く使用されています。デング熱ウイルスを含むいくつかの RNA ウイルスの定量化のために開発、RNA の精製ステップを必要としない直接 RT qPCR 法をご紹介します。

要約

現在、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 技術は感度、特異性のための検出と定量化研究所にウイルスのゲノムのためだけでなく、分子診断のための必須のツールと利便性。ただし、ほとんどの場合、定量 PCR (qPCR) 一般的に使用ウイルス感染は PCR のステップの前にウイルスの核酸の浄化に依存して検出します。この研究で、逆のトランスクリプションの蛍光ベース qPCR (RT qPCR) アッセイ開発処理バッファーとワンステップ RT-PCR 試薬の組み合わせによりウイルス感染培養上清の収穫から、全体のプロセスは、リアルタイム検出されるまで細胞は、ウイルスの RNA 精製することがなく実行できます。確立されたプロトコルは、デング熱ウイルス (DENV) 90 分以内の広い範囲の RNA 濃度の定量化できます。また、以前に報告された DENV 阻害物質ミコフェノール酸 (MPA) を使用して生体外実験で抗ウイルス剤の評価に直接 RT qPCR 測定法の適応性を発揮します。また、同じプロトコルで直接 RT qPCR によって他の RNA ウイルス、黄熱ウイルス (YFV)、チクングニア ウイルス (CHIKV)、麻疹ウイルス (MeV) など、定量化することができます。したがって、このレポートに記載されている直接 RT qPCR の試金はさらに高スループット スクリーニング研究と臨床診断のための有望なプラットフォームに展開されるシンプルかつ迅速な方法で RNA ウイルスの複製を監視するのに役立ちます。

概要

フラビ家族のフラビ ウイルス属には、70 以上の包まれて, 蚊やダニによって送信されるプラス鎖 RNA ウイルスが装備されています。重要なは、多くの場合人間のフラビ ウイルス感染は1の出血熱、脳炎などの重篤な臨床病気につながります。確かに、ジカ (ZIKV)、フラビ ウイルスの最近の流行はアメリカ大陸全体に爆発的に広がっているし、小頭症2,3を含む神経学的合併症に関連付けられていることが示されています。発現、したがって、現代社会の重要な臨床的影響があります。

重要なフラビ ウイルス、デング熱ウイルス (DENV)、世界の熱帯、亜熱帯地域に広く分布する蚊媒介ウイルスです。DENVヤブカ、ヒトスジシマカネッタイシマカ、デング熱発生4の世界的な広がりの結果を含む、送信されます。現在、世界保健機関 (WHO) は、3 つのカテゴリとしてデング病を分類: なし警告標識、警告サインと重症デング熱4デング熱デング熱。DENV (DENV-1-4) の 4 つの血清型の 1 つの主な感染症はしばしば無症候性または自己限定が疫学研究はそれぞれ異なる血清型の二次感染がデング熱のより深刻な形態のリスクを増加させることを示しています。二次感染として発生した重症のデング熱の潜在的なメカニズムとして提案されている主な感染時に抗体を subneutralizing または非 DENV 感染抗体依存強化は注目に値するです。ただし、DENV 感染5の特定の抗ウイルス薬はありません。

DENV に対する抗ウイルス剤の開発、ルーチンおよび高スループット設定に適している、堅牢な試金がウイルスの複製を定量的に検出するために不可欠です。従来、ウイルス感染と免疫学の試金 (例えば、酵素免疫測定法 [ELISA]) ウイルス抗原を検出するための定量化のための生物学的アッセイ (例えばプラクの試金) は、DENV を監視に使用されています。レプリケーションの in vitroとin vivo6,7。しかし、これらの試面倒が多いし、達成するために数日を要する大量サンプルの処理を妨害します。この点では、RT qPCR は DENV 感染を検出するための信頼性の高いアッセイ: 特定、敏感であり、比較的スピーディ7です。さらに、RT qPCR 法では、高スループットの形式でより多くの利点があります。それにもかかわらず、RNA ウイルスの RT-PCR 法の典型的な手順は、収集されたサンプルからのウイルスの核酸の回収を要求します。RT qPCR の様々 な抽出法を用いることができる、複数のステップでは、精製ウイルス RNA を取得にも必要です。また、RT qPCR アッセイは、通常高価なスピン列または面倒な準備プロセスになり、危険な有機溶剤が必要です。RT qPCR に適用する場合は特に、少ない手間と時間のかかる方法は最寄り、流用および/またはサンプル間の交差汚染を回避するウイルスのゲノムの成功の定量化のための重要な要因は、高スループットの形式です。

ここでは、ウイルスの RNA の浄化を必要としない感染した細胞、培養上清中 DENV RNA を測定する簡単な RT qPCR 手順を報告します。この最適化された RT qPCR プロトコルは 2 つの手順から成る: i) 処理バッファーとリアルタイム PCR 機器 ii) ワンステップ Rt-qpcr DENV 感染細胞培養上清中のインキュベーション。したがって、90 分 (図 1) 内の培養上清 DENV RNA を検出できます。直接 RT qPCR の他の RNA ウイルス感染症への応用についても述べる。

プロトコル

1. RNA 標準の DNA のテンプレートの準備

  1. プラスミド DNA ベクター DENV 2 ニューギニア C を含む PCR ミックス (50 μ L、表 1の総容積) 使用の準備 (NGC、受入番号: AF038403.1) 3' 非翻訳領域 (3' UTR)8およびプライマー (T7 DENV 3 'UTR Fwd と DENV 3' UTR Rv) 0.2 mL チューブとして表 2で説明します。
    注: この手順がきれいなボンネットの下 (またはクリーン ルーム) に行われる私アンプリコン関連製品の汚染を防止します。
  2. PCR 増幅 T7 の cDNA シーケンス融合 DENV 3' UTR、たちは、次の条件を使用して: 30 サイクル (10 98 ° C の s、55 ° C、5 s、および 5 のための 72 ° C s)。
  3. 0.1 から 10 のプラスミド ペア (kbp) に至るまで DNA 分子はしごで 6 x に 1% の agarose のゲルのゲルの読み込み色素と負荷の 10 μ L の PCR 反応をミックスします。
  4. DNA の可視化手法とシステムをイメージング ゲルを使用して長波長 UV 光の下で PCR の製品 (479 塩基対 [bp]) を視覚化します。きれいなメスの DNA バンドをカットします。
  5. DNA 精製キット (資材表) を用いた DNA を抽出します。
    注: この浄化手順は、クリーン フードの外に実行することが、DENV RNA 合成の標準的な手順で主要な問題である RNase の混入を避けるために処理中にクリーンな環境を保つために不可欠です。
    1. ゲルのスライスの重量を量る、1.5 mL 遠心チューブにゲルのスライスの 100 mg 当たりキャプチャ バッファーの 100 μ L を追加します。
    2. 5-15 分の 60 ° C で培養でゲルを溶解します。
    3. コレクション チューブ DNA 精製カラムを組み立てるし、600 μ L の試料を精製列に転送します。
    4. 30 s の流れを通して破棄 16,000 x gで遠心分離機します。試料の量が 600 μ L より大きい場合、最初のスピンの後サンプルの残りの部分を DNA 精製カラムに適用、この手順を繰り返します。
    5. DNA 精製カラムにバッファーを洗浄 500 μ L を適用します。
    6. 16,000 × gで遠心する 30 秒。
    7. 新しい 1.5 mL 遠心チューブに列を配置します。
    8. 50 μ L の溶出バッファーを追加し、列 1 分間室温でインキュベートします。
    9. DNA を溶出する 1 分最大回転数で遠心分離機します。
  6. 260 で DNA の光学密度を測定 3 μ L の溶出サンプルを使用して分光光度計の nm。空白として同じ量の溶出バッファーを使用します。
    注: DNA のテンプレートは、使用するまで-20 ° C で格納することができます。

2. DENV 3' UTR RNA 標準の合成

注: 保持リボヌクレアーゼ (RNase)-次の手順を実行するためにできるだけ自由な環境。ヌクレアーゼ フリー pipets、ヒント、およびチューブを使用して、クリーン フード内の試薬の設定を行わなければなりません。

  1. ミックスの in vitro転写 (IVT) との反応 (20 μ L の総ボリューム) の 100 ng の T7 RNA プロモーター シーケンス融合 DENV 3' UTR DNA テンプレートの (ステップ 1.6) から 0.2 mL PCR チューブの表 3で説明するように。
  2. 37 ° c 2 時間たちで混合物を孵化させなさい。
  3. IVT 反応に DNase の 1 μ L を追加し、37 ° C 15 分で潜伏を続けます。
  4. 浄化体外転写 RNA RNA 精製キット (資材表) を使用しています。
    1. RNase フリー H2O の 80 μ L と 350 を追加 1% β-メルカプトエタノールを含むキャプチャ バッファーの μ L。
    2. IVT 反応に 100% のエタノールの 250 μ L を追加し、ピペッティングでよく混ぜます。
    3. コレクション チューブの RNA 精製カラムを組み立てるし、RNA のサンプルを浄化列に転送します。
    4. 8,000 の遠心分離機 x g 15 s と流れを破棄します。
    5. RNA 精製カラムを洗浄液 500 μ L を適用し、2 分間 8,000 × gで遠心分離機します。
    6. 1.5 mL 遠心チューブに列を配置します。
    7. RNase フリー H2O の 50 μ L を追加し、列 1 分間室温でインキュベートします。
    8. それを遠心分離機で最大速度を 1 分の溶出が RNA の。
  5. 260 で RNA の光学密度を測定分光光度計、溶出サンプルの 3 μ L を使用しての nm。H2O の同じボリュームを空白にしてください。
  6. 合成 DENV 3' UTR RNA のコピーの数を決定します。1 RNA DENV 3' UTR の ng (462 拠点、図 2) 4.05 × 10 の9枚に匹敵します。
  7. 使用するまで-80 ° C で標準の RNA を保存します。

3. RT qPCR のウイルスのサンプルの処理

注: 手順 3.1 – 3.3 は生物学的安全キャビネット内で実行しています。特に、感染ウイルスを含む培養上清の取扱いはバイオ セーフティ レベル 2 (またはそれ以上) の環境下で実施する必要があります。

  1. ミックス 199 μ 処理バッファーとヌクレアーゼ フリー, プロテイナーゼ K の 1 μ L
  2. 直列合成 DENV 3' UTR からの RNA (ステップ 2.6) を希釈 1:10 5 x 109 5 x 103コピー/μ L の RNA 標準を使用してを取得する細胞培養の培地 (例えば10% 牛胎児血清と抗生物質 DMEM/10% 短期 DMEM)40 単位/ml RNase 阻害剤を含みます。
  3. ミックス 5 μ L を処理 (手順 3.1) からバッファー/プロティナーゼ K ソリューション 5 μ l DENV 3' UTR RNA 標準 DENV 感染細胞の培養上清の 8 チューブ PCR ストリップや 96 ウェル PCR プレートを使用します。細胞培養液中の 5 μ L の組み合わせのテンプレート以外のコントロール (NTC) として (すなわちウイルスが含まれていない) を処理バッファー/プロテイナーゼ K 溶液 5 μ l。
  4. 簡単なの遠心分離後のたちの次の条件を使用してサンプルをインキュベート: (25 ° C で 10 分間と 5 分の 75 ° C) の 1 サイクル。
    注: リアルタイム PCR 解析が同じ日に行われる場合、サンプル加工品は 4 ° C で保存できます。長期保存サンプルを-80 ° C で保存すべき

4. リアルタイム PCR 解析

注: 手順 4.1-4.4 私アンプリコン関連製品や RNase の混入を最小限に抑えるためのクリーン フード内を実行することを勧めします。

  1. (RNase フリー) 1.5 mL 遠心チューブにワンステップ RT-PCR 試薬 (材料表) と RT qPCR マスター ミックスを準備 DENV 3' UTR 固有プライマーおよび蛍光プローブ (表 1) を使用しています。標準的な RNA と NTC の反応を含むサンプルの合計数の 11% 以上によると各コンポーネント (表 4) のボリュームをスケール アップします。
  2. 96 ウェル リアルタイム PCR プレート (材料のテーブル) で使用するウェルにマスター ミックスの分注 8 μ L。
  3. 簡単に (ステップ 3.4) から DENV 3' UTR RNA 標準と NTC を含む加工のサンプルを遠心し、96 ウェル リアルタイム PCR プレートの各ウェルに 2 μ L のサンプルを追加します。
  4. 光学粘着フィルムで PCR プレートをシールします。
  5. 簡単に空気の泡を削除に 200 x gでプレートを遠心分離機します。
  6. リアルタイム PCR 装置のプレートを置き、次の条件を使用してプレートをサイクル: RT の 1 サイクル ステージ (10 分の 25 ° C)、ポリメラーゼ活性化ステージ (2 分の 95 ° C) の 1 サイクル増幅段の 40 のサイクル (95 ° C 10 s の 60 ° C、30 秒 [単一のデータ取得このステップで])。
  7. リアルタイム PCR 関連ソフトウェアを使用してサンプルの DENV RNA のコピーの数を決定します。
    1. セットアップウィンドウで未知の試料として分析されるべきである反応の井戸を割り当てます。
    2. 希釈した DENV 3' UTR RNA の標準として井戸を割り当て、各ウェルに RNA 標準の予想されるコピー数を入力 (例えば5 x 103コピー/μ L の RNA 標準ソリューションを使用している場合は、 5,000を入力)。NTC のネガティブ コントロールとして井戸を割り当てます。
    3. [解析] ウィンドウで分析をクリックし、生成される標準曲線の相関係数 (R2) が 0.98 以上に相当ことを確認します。
    4. 通常、Ct の既定の設定を使用 (しきい値: 自動、ベースラインは、サイクルを開始: オート、ベースライン終了サイクル: 自動) 分析のため。
      注:未知サンプルのコピー数が自動的にに基づいて計算されます個々 の反応の閾値サイクル (Ct) 値。各サンプルの計算されるコピー数は10 あたりする RNA のコピー μ RT qPCR 反応として考慮される (例えば、 12,345は未知のサンプルに示されている場合、つまり、DENV RNA の 12,345 コピーに存在反応)。

結果

RT qPCR による DENV RNA の定量化、同じプライマーによって検出することができます知られているコピー番号の標準セットは、前提条件であります。このプロトコルは、3 'UTR DENV 2 NGC ひずみのシーケンスは体外から T7 RNA 転写プロモーター融合 DENV 2 3' を含む 462 塩基長の RNA の UTR DNA テンプレート PCR によって増幅されていたと精製 (図 2 aと2B). とき DENV RNA (5 x 109 10 μ L RT qPCR 反応で 5 × 102コピー) から直接 RT qPCR 分析に供した標準のシリアル 10 倍希釈使用 3' UTR 固有のプライマーと、蛍光プローブ9、線形良い相関曲線 (R2 = 0.98726) (図 2) が得られました。

次に、この直接 RT qPCR アッセイは、ウイルス感染細胞の培養上清中 DENV を定量化に適用されました。DENV-2 (シンガポール分離 EDEN2 329510)、いた c6/36 蚊細胞に伝達されて、プラークアッセイ BHK 21 セル11を使用して滴定、(8 x 106 80 プラーク形成単位 [PFU]/mL) から順次希釈し。DENV サンプルいたし、ウイルス粒子を deproteinize にプロテイナーゼ K を含む処理バッファーの等量と扱われ、DENV 3' UTR RNA シーケンスをターゲットと直接 RT qPCR 測定を受けます。再び、良い相関 (R2 = 0.99981) 蛍光信号が急増する背景には、上記の上昇ポイントと見なされますサイクル数 DENV 感染力価と Ct の間 (図 3 a) が得られました。既知の感染価と DENV 在庫のシリアル希薄化から生成された Ct 値は、標準曲線をプロットした時の in vitro転写 3' UTR RNA 80 PFU/mL (8 x 103に等しい 8 × 106から得られるプロットのすべて10-2 PFU 10 μ L RT qPCR 反応 x 8) 標準的な RNA を受けるものの範囲内であった (図 3B10 μ L RT qPCR 反応のコピー 5 x 103 5 x 10 の9 )、DENV サンプル感染症の広い範囲を持つことを示す抗体は、この直接 RT qPCR を使用して、同時に分析できます。並列実験で RT qPCR によるバッファーまたはウイルス RNA の検出, プロテイナーゼ K 処理の処理の効果を調べた。ログ希釈 DENV サンプル (8 x 106 8 x 102 PFU/mL) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) RT-qPCR (PBS のウイルス サンプルの 1:1 希釈) し、25 ° C で 10 分間と 5 分の 75 ° C の孵化誘発前に単独での治療が、 回帰曲線 (図 3、黒線)、および PBS 治療によって得られる平均 Ct 値 2.6-3.2 サイクルが遅れたバッファー/プロテイナーゼ K 処理 (図 3点線) を処理することによって得られる Ct と比較した場合。さらに、この PBS 治療 (図 3) でウィルス (8 x 102 Pfu/ml 10-1 PFU 10 μ L RT qPCR 反応あたり x [8]) の最高の希釈を検出できませんでした。プロテイナーゼ K 処理バッファー処理 (図 3、グレー線) がない場合は、似たような回帰が生成されました。ただし、増幅の遅れ (0.1 – 0.8 サイクル), プロテイナーゼ K (図 3点線) を含む処理反応基準が認められました。これらのデータは、テスト条件の中で一緒にプロテイナーゼ K 処理バッファー DENV サンプルの治療は RT qPCR アッセイの感度を向上させること、示します。

直接 RT qPCR アッセイは、DENV に対する抗ウイルス剤の検証への適用性のためさらに評価されました。ミコフェノール酸 (MPA)、移植の免疫抑制剤として使用されるイノシン一リン酸脱水素酵素の非ヌクレオシド系阻害剤は、12,の in vitroDENV13を抑制する報告されています。以前の研究は、従来プラークアッセイまたは DENV 感染12,13MPA の抑制効果を発揮するウイルス抗原を検出する流れの cytometry 試金を採用が本研究で、直接 RT qPCRMPA の抗ウイルス活性の評価に適用されます。いた 5 x 10 の4細胞/ウェル 24 ウェル プレートでの密度で感染前に 1 日の播種されて、HeLa 細胞は 1 h の 1 の MOI で DENV 2 にさらされ、MPA (50 – 0.016 G/ml の存在下で DMEM/10% FBS での培養洗浄後、または 0.1% ジメチルスルホキシド [DMSO])。培養上清は感染 3 日後の収集され、DENV 3' UTR 特異的プライマーおよび蛍光プローブを使用して直接 RT qPCR 測定を受けます。図 4は、MPA での in vitro転写 3' UTR RNA 標準に定められた濃度の増加と感染細胞培養上清中 (反応) あたり DENV RNA のコピーを示します。50 μ g/mL (156 μ M) の治療と MPA、DMSO 治療文化の 99.87 ± 0.02% に減少が観察された (図 4)。重要なは、図 4に示すようにデータによって決まります MPA の IC50 (50% 抑制濃度) 値は 0.79 であった値に類似している μ M 報告12,13。この結果は、したがって、直接 RT qPCR 測定 DENV 感染に対する抗ウイルス剤の抑制効果を評価するために便利で信頼性の高い方法であることを示します。

最後に、他の RNA ウイルスに直接 RT qPCR 測定のアプリケーションがテストされました。YFV 17 D 特定のプライマーと、蛍光プローブとして14日の黄熱ウイルス (YFV) 17 D ワクチン株 (フラビ) していた Vero 細胞で増幅されて、bhk-21 細胞の滴定、株式 Rt-qpcr を使用して指示を受けたとき表 1に示す、ウイルス力価の Ct 値と良い直接的な相関関係をもつ標準曲線はウイルスの株式市場の 10 倍連続希釈で生成できる (3.2 × 105 3.2 PFU/ml、図 5 a)。同様に、直接チクングニア ウイルス (CHIKV,トガウイルス科) の RT qPCR 解析ロスひずみ株式、Vero 細胞で増幅されていたと CHIKV 特定のプライマーおよび蛍光プローブ15 (表 1) を使用して bhk-21 細胞の滴定感染価の間良い回帰を与えた (4.4 × 10 4.4 × 108 3 PFU/mL) と Ct 値 (図 5 b)。今回も反映されていたし、Vero 細胞、以前を使用して滴定する麻疹ウイルス (MeV、脱) のシリアル希釈 (8 x 102 8 x 10-2 PFU/mL、図 5) の検出のためのケース報告されたプライマーと蛍光プローブ16 (表 1)。これらのデータは、さまざまな RNA ウイルスの定量的検出のため直接 RT qPCR 法の適合性を示しています。

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図 1: 直接 RT qPCR アッセイのワークフロー 。DENV 感染細胞培養上清は、ウイルス RNA (サンプル処理ステップ) を解放する, プロテイナーゼ K を含む処理バッファーで処理されます。加工サンプルは、ワンステップ RT-PCR 試薬と混合し、DENV 3' UTR 固有プライマーと蛍光プローブを用いたリアルタイム PCR 法を受けます。それぞれのサンプルで検出されたウイルスの RNA のレベルは、希釈した標準によって決まります DENV RNA の転写の in vitroを使用して。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 2: DENV 3' UTR RNA によって生成された標準的な曲線です。(A) 標準的な RNA の 3' を含む DENV 2 NGC UTR 転写体外T7 RNA プロモーター シーケンス融合 PCR のフラグメントからだった。(B) 精製された DENV 3' UTR RNA (250 ng) は 1% の agarose のゲル (右車線) に可視化しました。左車線は、RNA の電気泳動用分子量マーカーを示しています。(C) A ログ希釈 DENV 3 'UTR RNA 標準だったプロテイナーゼ K を含む処理バッファー処理し、ワンステップ RT qPCR 試薬と DENV 3 を用いたリアルタイム PCR 解析を受ける' UTR 固有のプライマーと蛍光プローブ セット。平均 Ct 値 (n = 3) で得られたそれぞれの希釈液を 3' UTR RNA の量に対してプロットした (10 μ L RT qPCR 反応で 5 × 109 5 x 102 RNA にコピー)。R2相関係数はあります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 3: 直接 RT qPCR によるウイルス入荷 DENV RNA の定量化します。C6/36 細胞で生産高価 DENV 2 (A) 在庫は 10 倍希釈した直列 (8 x 106 8 x 101 PFU/mL) DMEM/10% FBS と RNase 阻害剤を含む、DENV 3' UTR 特異プライマーを使用して直接 RT qPCR 測定を受ける/probe。ログ希釈 DENV 株式 (円) の RT qPCR による (B) Ct 値をプロットした転写 3' UTR RNA (三角形) の標準曲線体外。8 × 106 Pfu/ml 株式直接 RT qPCR アッセイでの使用は、RT qPCR 反応 8 x 103 10 μ L でウイルスの PFU に対応します。(C) このパネルは、バッファーとウイルス RNA の検出, プロテイナーゼ K 処理の処理の効果を示しています。プロティナーゼ K (白丸) 処理バッファーだけで (灰色円)、または PBS (黒い円) と、直接に受けるを含む処理バッファーの等量だったインキュベートを希釈 DENV ストック (8 x 106 8 x 102 PFU/mL)RT qPCR の試金。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 4: 直接 RT qPCR による MPA の抑制効果の評価します。HeLa 細胞は、1 MPA、DENV (または 0.1 %dmso) 以前に報告した阻害剤濃度の増加の存在下で培養の MOI で DENV 2 に感染していた。3 日後に感染症、感染細胞培養上清に収集され DENV 3' UTR 固有プライマー ・ プローブを使用して直接 RT qPCR 測定を受けます。ウイルスの RNA のコピー数がによって決まります DENV 3' UTR RNA 転写の体外標準。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 5: 直接 Rt-qpcr 他の RNA ウイルスの検出のためのアプリケーション。YFV (A)、(B) CHIKV (C) MeV の希釈したウイルス株は PCR のプライマーを使用して直接 RT qPCR 法, 蛍光発生プローブのそれぞれのウイルス RNA シーケンスに固有。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

目的名シーケンス (5' 3')メモ
T7 プロモーター融合 DENV 2 3'UTR cDNA 増幅T7 DENV 3' UTR Fwd TAA TAC GAC TCA CTA タグ GGc gaa tTA GAA GGC 法 AAC ATG AAA 斜体、T7 プロモーター。小文字、スペーサー。太字、DENV 2 NGC ヌクレオチド 10,270 10,292
DENV 3' UTR rv 車AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGCDENV 2 NGC ヌクレオチド 10,723 10,703
RT qPCR DENV の分析DENV 2 3' UTR FAAG GAC タグ AGG はったギャグ ギャグ ACC C参照 9
DENV 2 3' UTR RGGC GTT CTG TGC CTG GAA TGA TG
プローブ 2 デン-2-46FAM AAC AGC ATA TTG ACG CTG GGA AAG ACC-タムラ
RT qPCR YFV の分析YFV NS5 FGAA CAG TGA TCA GGA ACC CTC TCT参考 14
YFV NS5 RGGA TGT TTG GTT CAC AGT AAA TGT G
YFV NS5 プローブ6FAM CTA CGT GTC TGG AGC CCG CAG CAA T-タムラ
CHIKV の RT qPCR 解析チク E1 FTCG ACG シージーシー CCT CTT TAA参考 15
チク E1 RATC GAA TGC ACC GCA CAC T
チク E1 P6FAM ACC AGC CTG CAC CCA TTC CTC AGA C-タムラ
RT qPCR による MeVMeV N FTGG 猫 CTG AAC TCG GTA TCA C参照 16
MeV N RTGT CCT CAG タグ TAT GCA TTG CAA
MeV N P6FAM CCG AGG ATG CAA GGC TTG TTT CAG A-タムラ

表 1: オリゴヌクレオチドのプライマーおよび蛍光プローブ本研究で使用されるシーケンスです。

コンポーネントストック濃度ボリューム (μ L)最終濃度
PrimeSTAR Max プレミックス2 x251 x
T7 DENV 3' UTR Fwd1 Μ M10200 nM
DENV 3' UTR rv 車1 Μ M10200 nM
pEU/DENV 3 ' UTR1 ng/μ l120 pg/μ l
ヌクレアーゼ フリー H2O4
合計50

表 2: DENV 3' UTR テンプレート DNA の準備のため PCR のコンポーネントを混在させます。

コンポーネントストック濃度ボリューム (μ L)最終濃度
T7 シーケンス融合 DENV 3' UTR の DNA のテンプレート(変数)x100 ng の反応あたり
ATP ソリューション75 mM27.5 mM
CTP ソリューション75 mM27.5 mM
GTP ソリューション75 mM27.5 mM
UTP ソリューション75 mM27.5 mM
反応バッファー10 倍21 x
T7 酵素ミックス2
組換え RNase 阻害剤40 単位/μ l12 単位/μ l
ヌクレアーゼ フリー H2O7-x
合計20

表 3: 標準 DENV 3' UTR RNA を合成するため、IVT のコンポーネントを混在させます。

コンポーネントストック濃度ボリューム (μ L)RT qPCR 反応の最終濃度
iTaq ユニバーサル プローブ反応混合物2 x5.001 x
iScript 逆転写酵素を高度な40 倍0.25100 ng の反応あたり
プライマー ・ プローブ ミックスDENV 2 3' UTR F: 3 Μ M1.00300 nM
DENV 2 3' UTR R: 3 Μ M300 nM
プローブ 2 デン-2-4:2 μ M200 nM
ヌクレアーゼ フリー H2O1.75
小計を表示します。8.00

表 4: DENV RNA のリアルタイム Rt-qpcr 分析用マスター ミックスのコンポーネント。注意してください 2 μ L 加工 DENV サンプル (または標準的な RNA) の 8 μ L マスター ミックス (10 μ L 反応あたりの合計) に追加してください。

ディスカッション

今日、蛍光ベースのリアルタイム PCR によるウイルス核酸の検出はその感度と速さ7のため、病原性ウイルスの分子診断のための金本位制になっています。これはデング熱17など急性感染症の初期の段階でウイルス感染を確認するため特に重要です。また、基本的な DNEV の研究の分野、RT qPCR アッセイは DENV の複製生物学、抗ウイルス阻害剤の探索の理解につながる体外培養ウイルスの複製を監視するための不可欠なツールです。本研究では蛍光ベースのリアルタイム PCR の試金さらに処理バッファーとワンステップ RT-PCR 試薬の組み合わせによってできるように開発されました DENV RNA 感染細胞培養上清中 RT qPCR によって浄化することがなく定量することができましたウイルスの RNA ゲノム。プラクの試金、ELISA、従来 RT qPCR による RNA 精製6、7などのウイルスの複製を検出するルーチンの試金に比べたら Rt-qpcr アッセイの簡易プロトコル結果時間を大幅に削減し、DENV RNA を定量化するために必要な手順。これはまた、汚染および遺伝物質の損失を最小限に抑える利点があります重要な機能です。それにもかかわらず、クリーン フードの使用が IVT (ステップ 2.1) のセットアップと Rt-qpcr (手順 4.1 〜 4.4) 反応、私アンプリコン関連製品や RNase のクロス汚染を避けるために不可欠であるに注意してください。また、培養上清、バイオ セーフティ キャビネット (ステップ 3.3) 研究室感染の危険性を減らすために内部の感染ウィルスなどを処理することが重要です。

直接 RT qPCR アッセイのもう一つの意義は、ウイルスの RNA のコピーの広い範囲は、サンプルの濃度希釈などせず同時に分析できます。希釈した DENV 3' UTR RNA 標準を使用した直接 RT qPCR プロトコル 7 桁上線形標準曲線を生成され、定量下限は 500 する RNA のコピー (図 2)。感染細胞の培養上清中 DENV、8 × 103 10 μ L で 8 x 10-2 PFU ウイルスの検出のため RT qPCR 3' UTR RNA 標準、DENV 範囲内にあったし、11 を含む検出下限 (8 x 10-2 PFU) を求めた、400 ± 7,077 する RNA のコピー (図 3 b)。注、いくつかフラビ ウイルス研究18,19,20で報告されたのウイルス感染価 (すなわちPFU) DENV サンプルにウイルスの RNA のコピーの拡大率も本研究で観察された.この過大評価がある (すなわち、非感染性) 欠陥の存在のために主と見なされますウイルスや感染し、死んだ細胞から放出された無料のウイルス RNA。本研究で得られた RNA のコピー: PFU の比率が (1.1 × 105 105 RNA コピー/PFU × 1.3) (比範囲 1 から 3 のログ)21,20を示したデータに一貫性がありませんでした、この可能性がありますウイルス、細胞、または採用培養条件の違いに起因します。不一致のための別の可能性の高い説明は記載直接 RT qPCR アッセイに RNA 精製プロセスは関与していないのでウイルス性の損失なしのリアルタイム PCR 解析として培養上清より DENV RNA を検出が可能遺伝物質。

直接 RT qPCR のシンプルさは、96 ウェル プレートなどのウェル フォーマットのサンプルの大規模な数を処理する能力を向上させます。したがって、このプロパティは、アンチ DENV 薬剤の発見のための高スループット スクリーニング研究に直接 RT qPCR アッセイの将来のアプリケーションに役立ちます。確かに、このレポートで直接 RT qPCR MPA、アンチ DENV 阻害剤の検証用のアプリケーションを検討したと結果を示した MPA 直接 RT qPCR 法 (図 4) を用いての IC50値に匹敵するプラクの試金12,13を使った過去の研究で報告されました。これ直接 RT qPCR は抗ウイルス剤の抑制効果を適切に評価するための有用な試金および薬剤のスクリーニング研究の将来的に採用することができますを示します。

本研究では、他の RNA ウイルスの検出に直接 Rt-qpcr を適用が試みられました。他の 3 種の RNA ウイルス (YFV、CHIKV、および MeV) の 10 倍希釈液は異なる属に分類すると、図 5に示すよう (フラビ、トガウイルス科、およびある、それぞれ) を用いて検討しました。以前報告されたプライマーと蛍光プローブそれぞれのウイルスの RNA シーケンスに固有の。直接 RT qPCR 法で感染価の Ct 値と良い相関が得られたし、の相関関係が 4-6 線形桁違い。これは、ウイルス特異プライマーを変更するだけで直接 RT qPCR プロトコル、RNA ウイルスの様々 なタイプに適応し、蛍光プローブを示唆しています。

それにもかかわらず、検出の感度は本研究 (図 5) でテスト ウイルスの間で変わった。ターゲット ウイルス RNA の検出を向上させることができるプロトコルの変更の 1 つは、プライマー ・ プローブ シーケンスの新しいセットを使用してする必要があります。さらに、成功した直接 RT qPCR の試金のための重要なステップは、サンプル手順 (手順 3.1-3.4) を処理中にウイルスのゲノムの効率的なリリースになると考えられます。これは安定したウイルスなどエンベロープを持たないウイルスの定量的検出にとって特に重要なのでしょう。コクサッキー ウイルス B3 の予備実験として、(CVB3)、エンベロープを持たない RNA ウイルスピコルナに属するは前述の CVB3 特定のプライマーおよび蛍光プローブ22を使用して直接 RT qPCR アッセイを受けた、高価 (1 x 105 Pfu/ml) ウイルスの株式市場にも肯定的な増幅信号を検出できませんでした。これは、エンベロープを持たないウイルスの高い物理的な整合性に起因する主としてと見なされます。これまでのところ、RNA のリリースで異なるプロトコルを採用いくつかの RNA ウイルスを検出する核酸の浄化を開発されているを必要としないいくつかの RT-PCR の試金のステップ23,24,25, 26. したがって、高温でウイルスのサンプルのインキュベーションなど、代替 (または追加) の治療の使用可能性のある検出の感度が向上します。

要約すると、本研究で開発された直接 RT qPCR プロトコル感染細胞の培養上清中のウイルス RNA を定量化するため単純な急速な信頼できる方法であった。このシンプルさのため直接 RT qPCR 法はウイルスの複製の高スループット分析のための約束を保持短い時間でサンプル数を処理でした。さらに、他の RNA ウイルスに直接 RT qPCR プロトコルのアプリケーションを示したも.このアプローチでは、RNA ウイルス感染症研究所の設定と、おそらく、臨床診断を効率的に監視するための便利なツールをする必要があります、したがって。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者はありがとう DENV 2 特定 EDEN2 3295, 井村俊郎 (神戸検疫局、日本)、YFV スバス g. Vasudevan (デューク大学院医学研究科、シンガポール) 17 D ワクチン株。著者は、彼らの支援のための微生物学講座・感染制御のメンバーに感謝しています。この作品は、文部科学省科研費助成番号 JP16737900 でサポートされます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PrimeSTAR Max DNA PolymeraseTakara Bio. IncR045AComparable PCR reagent kit can be used.
SimpliAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA24811Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
6x Gel Loading DyeNew England BioLabsB7024SComparable gel loading dye can be used.
2-Log DNA LadderNew England BioLabsN32000.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.
Gel Scene TabletAstecGST-33Comparable gel imaging system can be used.
illustra GFX PCR Purification KitGE Healthcare Life Sciences28-9034-70Comparable gel extraction kit can be used.
BioSpectrometerEppendorf6135000905Comparable spectrophotometer can be used.
MEGAscrip T7 Transcription KitThermo Fisher ScientificAM1334
TURBO DNaseThermo Fisher ScientificAM2238Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.
Recombinant RNase InhibitorTakara Bio. Inc2313A40 units/μL
RNeasy Mini KitQiagen74104Comparable RNA purification kit can be used.
CellAmp Direct RNA Prep KitTakara Bio. Inc3733Q
Proteinase KNacalai Tesque15679-06> 600 units/mL. Comparable reagent can be used.
iTaq Universal Probes One-Step KitBio-Rad1725141
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mLThermo Fisher Scientific4346907Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.
StepOnePlus Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificStepOnePlus-01Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.

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