肾小球的分离及肾小球细胞表面蛋白的活体标记

摘要

在这里, 我们提出了一个协议的小鼠体内标记肾小球细胞表面蛋白与生物素.该协议包含有关如何灌注小鼠肾脏, 分离肾小球, 并执行内源性免疫沉淀的感兴趣的蛋白质的信息。

摘要

蛋白尿是由被过滤的内皮细胞、肾小球基底膜和带缝隙膜片组成的肾小球滤池的破坏引起的。肾小球滤池的微妙结构, 特别是裂隙膜片, 依赖于不同细胞表面蛋白质的相互作用。到目前为止, 对这些细胞表面蛋白的研究仅限于体外研究或组织学分析。在这里, 我们提出了一个小鼠体内生物素化标记方法, 使我们能够研究肾小球细胞表面蛋白在生理和病理生理条件下。该协议包含有关如何灌注小鼠肾脏, 分离肾小球, 并执行内源性免疫沉淀的感兴趣的蛋白质的信息。这种新方法可以对肾小球细胞表面丰度进行半定量, 并可研究生物素灌注和免疫沉淀所能获得的所有蛋白质。此外, 通过在生物素化或不生物素化的情况下分离肾小球, 可以进一步分析肾小球 rna 和蛋白质以及原代肾小球细胞培养 (即原代肾小球细胞培养)。

引言

蛋白尿是肾小球损伤的标志, 通常伴随肾小球滤^{池 1}的破坏。肾小球滤池由被过滤的内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成。肾小球滤池的微妙分子结构是高度动态的, 在健康和患病的肾脏^{2,3,4, 5, 6 都}容易发生细胞表面蛋白贩运.细胞表面蛋白的内分泌已被证明是至关重要的生存的足细胞⁷。肾素和足苷酸是在足细胞上表达的跨膜蛋白。肾素是肾小球裂隙膜片的主干, 而 podocalyxin 是一种四聚糖蛋白, 包覆于足部 8^{、9、10 的}次生足部过程。此前, 已经显示肾素和 podocalyxin^{3、11、12、13、14的内分泌}贩运。

据我们所知, 细胞表面蛋白的内吞尚未在肾小球内皮细胞中被描述在文献中。然而, 内皮细胞一般表达所有必要的蛋白质为不同类型的内吞 (即, clathrin 依赖, 流依赖性内吞)^15,16。因此, 可以用这种方法研究内皮细胞表面的移植, 例如, 使用血管内皮 (ve)-钙粘蛋白和细胞内粘附分子 (icam-2) 作为肾小球内皮细胞¹⁷的细胞表面标记蛋白.

遗憾的是, 对于可以研究细胞表面蛋白质贩运的精细三层肾小球滤池, 目前还没有准确的体外模型。因此, 这种方法的目的是研究体内肾小球蛋白贩运。此外, 该协议还包含有关如何分离肾小球的信息, 从而能够进一步分析肾小球 rna、蛋白质或细胞。不同的组 18^,19描述了类似的肾小球分离技术。

此前, 我们和其他人使用了生物素化^{2、3、4、20、21}对肾小球细胞表面蛋白进行体外标记。然而, 在这种体外方法中, 孤立的肾小球暴露在机械应力下, 这可能会影响细胞内贩运。另外, 肾小球细胞表面蛋白的免疫荧光标记已被广泛应用于文献^2、20、22.然而, 使用这种方法, 只有少量的蛋白质可以在一张幻灯片内进行分析, 并且免疫荧光图像的定量往往是困难的。

这种新的体内方法为研究健康和患病肾脏中肾小球细胞表面蛋白质丰度和贩运提供了可靠的工具, 可作为免疫荧光检测的补充。

研究方案

老鼠是从当地动物护理设施或法国 janvier 实验室获得的, 作为一种内部品种。调查是根据《实验动物护理和使用指南》 (美国国立卫生研究院85-23 出版物, 1996年修订) 中概述的准则进行的。所有动物实验都是按照相关机构批准进行的 (州政府 lanuv 参考编号 az:84-02.0 04)。2016. a435)。

1. 仪器、解决方案和设备的准备

1. 制备1升磷酸盐缓冲盐水, 辅以 1 mm 氯化镁 (mgcl 2)和 0.1 mm 氯化钙 (cacl 2) (pbscm), 并通过无菌过滤器进行过滤。
2. 准备5毫升的无菌 pbscm 每只小鼠灌注, 并将其放置在冰上。
3. 为每只小鼠准备5毫升无菌 pbscm, 辅以 0.5 mg/ml 生物素。
4. 对于每只小鼠, 准备5毫升无菌 pbscm, 并添加 0.8 x^{10 8}磁珠 (例如, 在不经过预处理的情况下, 为 4 x 108beads\ ml 溶液添加200微米升的磁珠), 用于肾小球的栓塞。在细胞培养工作台下准备此溶液, 以保持原来管中的磁珠无菌。将此解决方案放在冰上。
5. 在 pbscm (每只小鼠5毫升) 中加入 100 mm 甘氨酸, 并将其保持在冰上, 从而制备淬火溶液。
6. 在无菌 pbscm 中制造胶原酶溶液 (0.378 u/ml 胶原酶 a)。每鼠标, 液器1毫升的胶原酶溶液成一个2毫升管, 并将其放置在冰上。
7. 对于洗涤, 请在50毫升管中制备无菌 pbscm (见步骤 1.1), 并将其放置在冰上。
8. 对于灌注, 请使用流量为 2.0 ml/min 的注射器泵。
9. 准备一个10毫升注射器与21g 针。将针尖放入20-30 厘米长的导管 (内径, id = 0.58 mm)。用10厘米短的导管 (id0.28 mm) 连接导管 (id0.58 mm), 并将较小的导管斜的尖端切割成很容易插入小鼠主动脉。
10. 对于手术过程中的结扎手术, 每只小鼠可切割 3条5-7 厘米的丝线 (4-0 至 6-0)。
11. 手术时, 准备3个手术夹具, 2个手术剪刀, 2个推子, 2个精细的推子, 1个精细的剪刀, 和棉签。准备麻醉 (例如,腹腔麻醉氯胺酮 100 mg/kg 体重和 xylazine 5 mg kg 体重)。
12. 对于两个肾脏的肾小球的隔离, 使用100μm 的细胞过滤器、两个50毫升管和一个磁铁捕手。
13. 制备 chaps 裂解缓冲液:20 mm3-[(3-胆碱丙基) 二甲基氨酸]-1-丙基磺酸 (chaps);20 mm tris (羟基甲基)-氨基 (tris) ph 值 7.5;50 mm sodiumchorlide (ncl);50 mm 钠氟化物 (naf);15 mm_{na 4}p2o7;0.1 mm 乙二胺四乙酸 (edta) ph 值 8.0;2 m 硫醇;和 2 mm 腺苷酸荧光粉 (atp)。
14. 冷却离心机至4°c。

2. 显微镜下的手术

1. 对鼠标进行麻醉 (例如,用酮胺/腹腔, 见步骤 1.11)。执行脚趾夹紧测试, 以确认适当的麻醉。
2. 用70% 异丙醇消毒小鼠腹侧。
3. 通过骨盆到胸骨的皮肤进行中位切割, 用推子将皮肤从腹部筋膜中取出。用手术剪刀将腹部中间两侧的皮肤剪断。
4. 更换手术工具。通过腹部肌肉层将从西普的中位切割到膀胱, 并使用推子和手术剪刀将其分为四个象限。用两个手术夹具将上两个用夹子固定在老鼠的脖子上。
   注: 腹部现在被打开。
5. 用无菌棉签将内脏放在一边, 用精细的剪刀切割肝韧带。
6. 准备结扎 (与丝线4-0 至 6-0) 周围的主动脉近端肾上腺的高度与两个精细的推子。收紧主动脉近端结扎术, 用推子消除血液流动。
7. 将主动脉远端从筋膜、脂肪和其他组织中解救出来, 并使用精细的手术推拿器准备肾动脉肝-肠系膜动脉颅骨周围的结扎术。
8. 准备结扎 (与丝线4-0 至 6-0) 周围的主动脉远端的肾动脉, 并夹紧静脉和主动脉在分叉的高度。
9. 在主动脉远端的主动脉上切一个小孔, 使这个洞的直径是主动脉的一半。将导管插入主动脉, 并与准备好的结扎固定。
   注意: 避免灌注系统中的气泡, 以防止空气栓塞。
10. 以 2 ml/min 的流速开始用冰凉 pbscm 进行灌注。
11. 用精细的手术剪刀将一个洞切入肾动脉水平的肾静脉, 并收紧肝和肠系膜动脉周围的结扎。
    注: 肾脏应在开始灌注后变得苍白。

3.活体生物素化

1. 将无滑注射器的气泡改为冰凉 pbscm, 辅以 0.5 mg/l 生物素用于表面标签, 并在 2 mlmin 的流量下对5毫升的肾脏进行灌注。
   注: 将 pbscm 解决方案 (例如,通过转动50毫升管) 轻轻混合, 以避免在溶液中形成气泡。在注射器内吸入溶液后, 从注射器中排出任何气泡或空气。在注射器上使用额外的插管 (21g) 来填充连接到导管系统的插管中的空间。最后, 将注射器与没有气泡的导管粘在插管中。
2. 将无滑注射器的气泡改为冰凉的 pbscm, 再加上 100 mm 甘氨酸, 在 2 mlp 最小的流量下, 以 5 ml 的速度淬火肾小球和灌注。
3. 将无滑注射器的气泡改为冰凉 pbscm, 再加上200μl 磁性 beadsml, 并在2mlmmin 进行灌注肾脏。
   注: 在肾脏表面, 用棕色磁珠栓塞肾小球将是可见的。

4. 从两个肾脏中分离出肾小球

1. 取下肝门的肾脏, 取出胶囊。将肾脏放在10厘米细胞培养盘中的 pbscm 15 毫升的冰上。在摘除肾脏后, 在麻醉下对小鼠进行颈椎脱位的安乐死。手术和灌注手术持续约20-22分钟。
2. 使用新的双刃刀片将肾脏切成最小的碎片。将组织移动到含有1毫升胶原酶 a 的2毫升管中 (见步骤 1.6), 并在37°c 下消化30分钟。消化前后, 用1000μl 切割的移液器轻轻搅拌。
3. 使用冰凉 pbscm, 通过100μm 的细胞过滤器冲洗消化后的组织。轻轻地使用细胞刮刀切碎剩余的组织槽细胞过滤器, 然后用冰凉 pbscm 冲洗它到总容量50毫升。
4. 在 4°c 500 x g 下离心悬浮液 5分钟, 在循环处理颗粒时, 取出上清液, 以略小于 1.5 ml 的冰凉 pbscm 重新悬浮颗粒。随后, 将肾小球悬浮液放入新的2毫升管中。

5. 清洗

1. 使用磁铁捕手将肾小球拉到一侧。等待 1分钟, 才会向磁铁移动。
2. 当2毫升管留在磁体捕手中时, 用1000μl 移液器取出上清液。在第一和第二清洗步骤 (见步骤 5.3) 中, 250 微米的上清液仍留在试管中, 以避免肾小球的损失。快速执行此过程, 以避免使管状结构沉入管底。
   注: 否则, 清洗过程将持续更长的时间。
3. 从磁体捕手中取出2毫升管, 加入1毫升 pbscm, 上下移液器 (非常重要), 然后涡旋。
4. 将管子放回磁铁捕手中, 然后从步骤5.2 重新开始。
5. 重复洗涤步骤, 直到肾小球的纯度达到90%。为此, 请在显微镜下 (40-100x) 检查上清液的代表性位基因。
   注: 肾小球将显示为含有棕色磁珠的圆形结构。伸长的结构是管状的碎片, 自由磁珠表现为棕色圆点。细胞碎片可能会出现笨重的结构。
6. 如果达到纯度, 通过溶解 pbscm 1 毫升中的肾小球来估计肾小球的数量。混合后, 取10μl 的, 并在显微镜下计数肾小球。用以下公式计算肾小球的数量: 在 10μl aliquot x 100 中的最终肾小球数 = 肾小球数。
7. 成功隔离肾小球可获得 10, 000-40000 的肾小球范围。

6. 蛋白质提取和免疫沉淀 (ip)

1. 在 4°c 6800 x 克的离心下收集肾小球, 在 6800 x 克的温度下离心 5分钟, 在使用磁铁捕手时取出上清液, 并在冰冷的裂解缓冲液中重新悬浮颗粒 (例如, 300μl 中的 30, 000 肾小球;chaps, 见步骤 1.11)。用组织均质机在30秒的最高速度对样品进行均质化, 并将其在冰上裂解30分钟。
2. 在4°c 的温度下, 以 15, 000 x 克离心 30分钟, 去除不溶性材料。将包括细胞裂解液的上清液移液输送到一个新的 1.5 ml 管中。丢弃颗粒。
3. 按照制造商的指示, 使用基于双氯化物 (bca) 的方法测量上清液的蛋白质浓度。成功裂解 30, 000 肾小球产量为 700-1000μg/ml 的肾小球蛋白。调整到等于蛋白质量与裂解缓冲液。
4. 取肾小球裂解液总体积的 10%, 在95°c 孵育5分钟前加入 2x laemmli + 二硫醇 (dtt)。
5. 对于 ip, 在4°c 的头顶振动台上, 用链霉素琼脂糖珠在夜间孵育其余的裂解物。
6. 离心琼脂糖珠在1000xg 下 3分钟, 在4°c 下 3分钟, 去除上清液, 并加入800μl 的裂解缓冲液清洗珠子, 以获得非特异性蛋白质结合。
7. 重复洗三次, 并完全取出上清液。
8. 加入30μl 的 2x laemmli + dtt, 在95°c 孵育5分钟。
9. 将裂解液和 ip 探针装上 10% sds 凝胶, 以 70 v 的速度运行 30分钟, 然后以每种凝胶 20 ma 的速度运行1.5 小时, 然后将凝胶在 200 ma 的温度下在硝化纤维素膜上涂布2小时。
10. 用5% 的牛血清白蛋白 (bsa) 在洗涤缓冲液中隔夜阻断硝化纤维素膜。
11. 在4°c 条件下, 用感兴趣的抗体连夜培育膜。用洗涤缓冲液清洗 3次, 在振动台上清洗 5分钟, 并在室温下用 hrp 标记的二级抗体孵育膜1小时。重复清洗步骤。
12. 使用带有 ccd 摄像机的超分辨率化学发光剂, 可在膜上显示溶酸盐和免疫沉淀探针。

结果

为了准确地分离肾小球, 必须先用 pbscm 灌注小鼠肾脏。pbscm 灌注使肾脏变白 (图 1a)。用磁珠栓塞肾小球将可见于肾脏表面的棕色圆点 (图 1b)。用捕磁器分离肾小球可能显示肾小管污染 (图 1c)。在进一步分析肾小球之前, 需要通过更彻底地清洗肾小球来达到 > 95% 的肾小?...

讨论

该方法可以成功地分离肾小球, 以研究肾小球 rna 或蛋白质。此外, 原代肾小球细胞培养可以从分离的肾小球进行。如果生物素是在肾小球分离之前应用的, 则可以对肾小球细胞表面蛋白进行标记。利用该方法可以研究体内肾小球细胞表面蛋白的贩运, 并可对蛋白质丰度进行半定量。成功检测肾小球细胞表面蛋白丰度的最关键步骤是: 1) 发展小鼠手术方面的手工专业知识, 特别是主动脉插管, 2) ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	microscope for mouse surgery
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer	PZN:01320422	anesthesia
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	for abdominal cut
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	for surgery
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	silk thread
Ketamine 10%	Medistar		anesthesia
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	Catheter
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	to embolize glomeruli
Collagenase A	Roche	10103578001	to digest kidney tissue
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Magnet catcher
100µm cell stainer	Greiner-bio	542000	for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non available	to confirm glomerular purity
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Tissue homogenizer
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	for lysis buffer
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	for lysis buffer
NaCl	VWR chemicals	27810295	for lysis buffer
NaF	Sigma-Aldrich	201154	for lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	for lysis buffer
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody	R&D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody	SCBT	sc-8298	for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot loading control
rabbit anti-p44/42	cell signalling	4695	for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21130	for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody	R&D Systems	AF774	for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin	R&D Systems	AF1002	for westernblot