Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para murino en vivo etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular con biotina. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés.

Resumen

Proteinuria resulta de la alteración del filtro glomerular que está conformada por el endotelio fenestrado, la membrana basal glomerular y podocytes con sus diafragmas de abertura. La delicada estructura del filtro glomerular, especialmente el diafragma de la raja, se basa en la interacción de proteínas de superficie de diversas células. Estudio de estas proteínas de superficie celular hasta el momento se ha limitado a estudios en vitro o análisis histologic. Aquí, presentamos un murino en vivo Biotinilación etiquetado método, que permite el estudio de las proteínas de superficie celular glomerular bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés. Semi-cuantificación de la abundancia de superficie celular glomerular está disponible con este nuevo método y todas las proteínas accesibles a perfusión de biotina e inmunoprecipitación puede estudiarse. Además, aislamiento de glomérulos con o sin Biotinilación permite más análisis de RNA glomerular y proteínas así como glomerular primaria de la célula cultura (es decir, Podocito primario de la célula).

Introducción

Proteinuria es un sello de lesión glomerular y generalmente acompaña alteración del filtro glomerular¹. El filtro glomerular está compuesto por el endotelio fenestrado, la membrana basal glomerular y podocytes. La delicada estructura molecular del filtro glomerular es altamente dinámico y sujeto a la proteína de la superficie de la célula trata de ambos riñones sano y enfermo^2,3,4,5,6 . Endocitosis de proteínas de la superficie de la célula se ha demostrado para ser esencial para la supervivencia de los podocytes⁷. Nefrina y podocalyxin son proteínas transmembranales expresadas en podocytes. Nephrin está la espina dorsal de la membrana glomerular raja, podocalyxin es una Sialoglicoproteína capa los procesos secundario pies de podocitos^8,9,10. Trata endocíticas se ha demostrado previamente para nefrina y podocalyxin^{3,11,12,13,14}.

Al mejor de nuestro conocimiento, endocitosis de proteínas de la superficie de la célula todavía no se ha descrito en las células endoteliales glomerulares en la literatura. Sin embargo, las células endoteliales expresan en general todas las proteínas necesarias para los diferentes tipos de endocitosis (es decir, endocytosis clathrin-dependiente, dependiente de la balsa)^15,16. Por lo tanto, trata de superficie de célula endotelial puede ser estudiada con este método, por ejemplo, vascular endotelial (VE)-cadherin y molécula de adhesión intracelular (ICAM-2) como una célula superficie marcador proteico de las células endoteliales glomerulares¹⁷ .

Desafortunadamente, existe un modelo exacto en vitro para el filtro glomerular tres capas delicado en que la célula trata de la proteína de la superficie puede ser estudiada. El objetivo de este método es por lo tanto para el estudio de proteína glomerular tráfico en vivo. Además, este protocolo contiene información acerca de cómo aislar los glomérulos, lo que permite más análisis de RNA, proteínas o células glomerulares. Aislamiento glomerular similar técnicas han sido descritas por diferentes grupos de^18,19.

Previamente, nosotros y otros hemos usado ex vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular Biotinilación^2,3,4,20,21. Sin embargo, en este método ex vivo , glomérulos aislados fueron expuestos a esfuerzos mecánicos que pueden influir en tráfico endocítico. Por otra parte, inmunofluorescencia etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular ha ampliamente utilizado en la literatura^2,20,22. Con este método, sin embargo, sólo un pequeño número de proteínas puede ser analizado dentro de una diapositiva, y cuantificación de imágenes de inmunofluorescencia es a menudo difícil.

Este método de novela en vivo ofrece una herramienta confiable para el estudio celular glomerular proteína superficial abundancia y trata exactamente en sanos y enfermos riñones, y puede ser utilizado como una adición a las pruebas de inmunofluorescencia.

Protocolo

Se obtuvieron ratones como una raza propia de las instalaciones de cuidado de los animales locales o de los laboratorios de Janvier en Francia. Las investigaciones se llevaron a cabo según las directrices descritas en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (US nacional institutos de salud publicación no. 85-23, revisada en 1996). Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las pertinentes aprobaciones institucionales (Gobierno del estado LANUV referencia número AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. preparación de equipos, instrumentos y soluciones

1. Preparar 1 L de solución salina amortiguada de fosfatos con 1 mM cloruro de magnesio (MgCl₂) y 0,1 mM cloruro de calcio (CaCl₂) (PBSCM) y filtrar con un filtro estéril.
2. Preparar 5 mL de PBSCM estéril por ratón para perfusión y coloque en hielo.
3. Para cada ratón, preparar 5 mL de PBSCM estéril suplementada con biotina 0,5 mg/mL.
4. Para cada ratón, preparar 5 mL de PBSCM estéril y añadir 0,8 x 10⁸ granos magnéticos (ej., 200 μL de una solución de 4 x 10⁸ granos/mL, sin tratamiento previo) para la embolización de los glomérulos. Preparar esta solución debajo del Banco de la cultura de célula para mantener las bolas magnéticas en el tubo original estéril. Colocar esta solución en el hielo.
5. Preparar una solución de enfriamiento mediante la adición de glicina 100 mM para PBSCM (5 mL por ratón) y mantenerlo en hielo.
6. Hacer una solución de colagenasa (0.378 U/mL colagenasa A en PBSCM estéril). Por ratón, Pipetear 1 mL de la solución de colagenasa en un tubo de 2 mL y coloque en hielo.
7. Para lavarse, preparar PBSCM estéril (ver paso 1.1) en 50 mL del tubo y coloque en hielo.
8. De perfusión, utilice una bomba con un caudal de 2,0 mL/min.
9. Prepare jeringa de 10 mL con una aguja de 21G. Coloque la punta de la aguja de un catéter largo de 20-30 cm (diámetro interior, ID = 0,58 mm). Conectar el catéter (ID 0,58 mm) con un catéter corto de 10 cm (ID 0,28 mm) y cortar la punta del catéter más pequeño oblicuo para una fácil inserción en la aorta de ratón.
10. Para los procedimientos de ligadura durante la cirugía, cortar tres hilos de seda 5-7 cm (4-0 6-0) a por el ratón.
11. Para la cirugía, prepare 3 pinzas quirúrgicas, 2 tijeras quirúrgicas, 2 pinzas, 2 Pinzas finas, 1 tijera fina y esponjas. Preparar la anestesia (por ejemplo, intraperitoneal anestesia ketamina 100 mg/kg peso corporal y peso corporal de 5 mg/kg de xilacina).
12. Para el aislamiento de los glomérulos de los dos riñones, use un colador de celda de 100 μm, dos tubos de 50 ml y una atracción de imán.
13. Preparación de grietas del tampón de lisis: 20 m m 3 [(3-cholamidopropyl) dimetilamonio] -1-propanesulfonate (caps); 20 mM Tris (hidroximetil)-aminomethan (Tris) pH 7,5; sodiumchorlide 50 m m (NaCl); sodiumfluoride 50 mM (NaF); 15 mM Na₄P₂O₇; pH de 0,1 mM etilendiaminotetracético (EDTA) el ácido 8.0; sodiumorthovanadate de 2 mM; y 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
14. Centrífugas de frío a 4 ° C.

2. cirugía bajo el microscopio

1. Anestesiar el ratón (por ejemplo, con ketamina/xilacina por vía intraperitoneal, vea paso 1.11). Realice la prueba del pellizco del dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada.
2. Desinfectar el lado ventral del ratón con isopropanol al 70%.
3. Realizar una incisión mediana a través de la piel de la pelvis al esternón y quitar la piel de la fascia abdominal con unas pinzas. Cortar la piel a ambos lados en el medio del abdomen con tijeras quirúrgicas.
4. Cambiar las herramientas quirúrgicas. Aplicar un corte mediano de xifoides a la vejiga a través de la capa del músculo abdominal y dividir en cuatro cuadrantes utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas. Coloque las dos superior a un lado con las pinzas hacia el cuello del ratón con dos pinzas quirúrgicas.
   Nota: Ahora se abre el abdomen.
5. Poner los órganos viscerales a un lado con un hisopo estéril y cortar el ligamento hepático-frénico con tijeras finas.
6. Preparar una ligadura (con un hilo de seda 4-0 6-0) alrededor de la aorta proximal de las arterias renales en la altura de la glándula suprarrenal con dos pinzas finas. Apriete la ligadura aórtica proximal para abolir el flujo sanguíneo con pinzas.
7. Libres de la aorta distal de la fascia, grasa y otros tejidos y preparar una ligadura alrededor de la arteria hepática/mesentéricos craneal de las arterias renales con finas pinzas quirúrgicas.
8. Preparar una ligadura (con un hilo de seda 4-0 6-0) alrededor de la aorta distal de las arterias renales y la abrazadera de la vena cava y aorta a la altura de la bifurcación.
9. Corte un pequeño agujero en la aorta distal a las arterias renales por lo que el agujero es mitad del diámetro de la aorta. Colocó el catéter en la aorta y fijar con la ligadura preparada.
   PRECAUCIÓN: Evitar burbujas en el sistema de perfusión para evitar embolias gaseosas.
10. Iniciar la perfusión con la PBSCM helada con un caudal de 2 mL/min.
11. Cortar un agujero en la vena renal a nivel de las arterias renales con finas tijeras quirúrgicas y apriete la ligadura alrededor de las arterias hepáticas y mesentéricas.
    Nota: Los riñones deben resultar claros después de comenzar la perfusión.

3. en Vivo Biotinilación

1. Cambio la jeringa libre de burbuja para helados PBSCM complementado con biotina 0,5 mg/mL para la superficie de etiquetado y perfusión de los riñones con 5 mL a un flujo de 2 mL/min.
   Nota: Las soluciones PBSCM (p. ej., girando los tubos de 50 mL) se mezclan suavemente para evitar formación de burbujas dentro de la solución. Después de la aspiración de la solución en la jeringa, evacuar el aire ni burbujas de la jeringa. Use una cánula adicional (21G) en la jeringa para llenar el espacio en la cánula que está conectada al sistema de catéter. Por último, pegar la jeringa en la cánula con la sonda sin burbujas.
2. Cambiar la jeringa sin burbujas PBSCM helada suplementado con glicina 100 mM para saciar los glomérulos y perfusión con 5 mL a un flujo de 2 mL/min.
3. Cambio la jeringa libre de burbuja para helados PBSCM complementado con 200 μL magnético granos/mL y perfusión de los riñones de 2 mL/min.
   Nota: En la superficie del riñón, embolización de glomérulos con granos magnéticos marrón será visible.

4. aislamiento de glomérulos de los dos riñones

1. Retirar los riñones en el hilum y retirar la cápsula. Poner los riñones en hielo en 15 mL de PBSCM en una placa de cultivo celular de 10 cm. Eutanasia el ratón con la dislocación cervical bajo anestesia después de la cosecha de los riñones. Los procedimientos de cirugía y de la perfusión duran aproximadamente 20-22 minutos.
2. Corte los riñones en trozos más pequeños posibles con una nueva hoja de doble filo. Mover el tejido en un tubo de 2 mL con 1 mL de colagenasa A (ver paso 1.6) y digest a 37 ° C durante 30 minutos. Antes y después de la digestión, mezclar suavemente con un μL 1000 corte pipeta.
3. Enjuague el tejido digerido por un colador de celda de 100 μm usando PBSCM helada. Utilice suavemente el raspador de célula para picar el la coladera de la célula a través de tejido restante y enjuague con helada PBSCM luego a un volumen total de 50 mL.
4. Centrifugar la suspensión a 4 ° C 500 x g por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender el precipitado con un poco menos de 1,5 mL de PBSCM helada mientras Vortex la pelotilla. Luego, poner la suspensión glomerular en un nuevo tubo de 2 mL.

5. lavado

1. Utilice el colector de imán para tirar los glomérulos a un lado. Espere 1 minuto antes de los glomérulos se han trasladado hacia el imán.
2. Quite el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL mientras el tubo de 2 mL en el colector de imán. Durante el primer y segundo lavado los pasos (ver paso 5.3), 250 μL de sobrenadante permanece en el tubo para evitar la pérdida de glomérulos. Realizar este procedimiento rápidamente para evitar que las estructuras tubulares del fregadero a la parte inferior del tubo.
   Nota: El procedimiento de lavado durará más tiempo de lo contrario.
3. Quite el tubo de 2 mL de colector de imán y añadir 1 mL de PBSCM, pipeta arriba y abajo (muy importante), entonces vortex.
4. Vuelva a colocar el tubo en el colector de imán y comenzar de nuevo con el paso 5.2.
5. Repita los pasos de lavado hasta que la pureza de glomérulos ha alcanzado el 90%. Para ello, examinar una alícuota representativa del sobrenadante con un microscopio (40-100 X).
   Nota: Glomérulos aparecerá como estructuras redondas que contienen granos magnéticos marrón. Estructuras alargadas son fragmentos tubulares y granos magnéticos libres aparecen como puntos redondos marrones. Restos celulares pueden aparecer como estructuras voluminosas.
6. Si se alcanza la pureza, estimar el número de glomérulos disolviendo los glomérulos en 1 mL de PBSCM. Después de mezclar, tomar una alícuota de 10 μL y contar los glomérulos en el microscopio. Calcular el número de glomérulos con la siguiente ecuación: número final de glomérulos = número de glomérulos en x 100 alícuota de 10 μL.
7. Aislamiento exitoso de glomérulos conduce a un rango de 10.000-40.000 glomérulos.

6. proteína extracción e inmunoprecipitación (IP)

1. Glomérulos recogemos por centrifugación a 4 ° C a 6800 x g por 5 min Quite el sobrenadante durante el uso de una atracción de imán y resuspender el precipitado en tampón de lisis helada (e.g., 30.000 glomérulos de 300 μL; GRIETAS, ver paso 1.11). Homogeneizar las muestras con un homogeneizador de tejidos a la máxima velocidad de 30 s y lyse en hielo durante 30 minutos.
2. Eliminar el material insoluble por centrifugación a 15.000 x g por 30 min para 4 ° C. Pipeta el sobrenadante que incluye la celda lisada en un nuevo tubo de 1,5 mL. Deseche los pellets.
3. Medir la concentración de proteínas del sobrenadante usando una bicinchoninic (BCA)-basado en método siguiendo las instrucciones del fabricante. Una lisis exitosa de 30.000 glomérulos cede a una cantidad de proteína glomerular de 700-1.000 μg/mL. Ajustar cantidades de proteína igual con tampón de lisis.
4. Tomar una alícuota del 10% del volumen total de glomerular lisado y añadir 2 x Laemmli + dithiothreithol (DTT) antes de la incubación durante 5 min a 95 ° C.
5. Para IP, incubar el resto del lisado con estreptavidina agarose granos durante la noche a 4 ° C en un agitador de arriba.
6. Centrifugar perlas de agarosa a 1000 x g durante 3 min a 4 ° C, eliminar el sobrenadante y añadir 800 μL de tampón de lisis para lavar los granos para la Unión a proteínas inespecíficas.
7. Repita el lavado 3 veces y retire completamente el sobrenadante.
8. Añadir 30 μL de 2 x Laemmli + TDT e incubar a 95 ° C durante 5 minutos.
9. Carga el lisado y sondas IP en un SDS 10% gel y correr el gel de la SDS a 70 V por 30 min, luego a 20 mA por gel de 1,5 h. posteriormente, secar el gel por 2 h a 200 mA en una membrana de nitrocelulosa.
10. Bloquear la membrana de nitrocelulosa durante la noche a 4 ° C con 5% de albúmina sérica bovina (BSA) en tampón de lavado.
11. Incubar la membrana con el anticuerpo de interés durante la noche a 4 ° C. Lavar con buffer 3 veces durante 5 min en un agitador se lava e incubar la membrana con el anticuerpo secundario etiquetado HRP por 1 h a temperatura ambiente. Repetir el lavado.
12. Visualizar el lisado y sondas de inmunoprecipitación en la membrana mediante el uso de un agente quimioluminiscente de súper-resolución con una cámara CCD.

Resultados

Para aislar glomérulos con precisión, es necesario inundar murinos riñones con PBSCM primero. Perfusión con PBSCM activa riñones pálidos (figura 1A). Embolización de glomérulos con bolas magnéticas serán visible como puntos marrones en la superficie del riñón (figura 1B). Aislamiento de glomérulos con el colector de imán puede mostrar contaminación con tubuli renal (

Discusión

El método presentado permite aislamiento exitoso de glomérulos investigar glomerular ARN o proteína. Además, pueden realizarse cultivos de células glomerulares primarios de los glomérulos aislados. Si la biotina se aplica antes de aislamiento glomerular, etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular se puede realizar. Con este método, se puede estudiar en vivo células glomerulares trata de proteína de la superficie, y semi-cuantificación de la abundancia de la proteína es posible. Los p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	microscope for mouse surgery
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer	PZN:01320422	anesthesia
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	for abdominal cut
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	for surgery
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	silk thread
Ketamine 10%	Medistar		anesthesia
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	Catheter
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	to embolize glomeruli
Collagenase A	Roche	10103578001	to digest kidney tissue
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Magnet catcher
100µm cell stainer	Greiner-bio	542000	for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non available	to confirm glomerular purity
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Tissue homogenizer
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	for lysis buffer
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	for lysis buffer
NaCl	VWR chemicals	27810295	for lysis buffer
NaF	Sigma-Aldrich	201154	for lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	for lysis buffer
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody	R&D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody	SCBT	sc-8298	for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot loading control
rabbit anti-p44/42	cell signalling	4695	for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21130	for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody	R&D Systems	AF774	for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin	R&D Systems	AF1002	for westernblot