Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine mit Biotin murinen in Vivo . Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation des Proteins des Interesses durchführen.

Zusammenfassung

Proteinurie ergibt sich aus der Störung des glomerulären Filters, der die gefensterten Endothels, glomeruläre Basalmembran und Podocytes mit ihren Schlitz Membranen zusammensetzt. Die zarte Struktur des glomerulären Filters, vor allem die Schlitz-Membran, stützt sich auf das Zusammenspiel der verschiedenen Zelle Oberflächenproteine. Studieren diese Zelle Oberflächenproteine wurde bisher zur in-vitro- Studien oder histologische Analyse beschränkt. Hier präsentieren wir Ihnen einen murinen in Vivo Biotinylierungen Kennzeichnung Methode, die die Untersuchung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine physiologische und pathophysiologische Bedingungen ermöglicht. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation eines Proteins des Interesses durchführen. Semi-Quantifizierung der glomerulären Zelle Oberfläche Fülle ist leicht zugänglich mit dieser neuartigen Methode und alle Proteine für Biotin Perfusion zugänglich und Immunopräzipitation kann untersucht werden. Isolierung der Glomeruli mit oder ohne Biotinylierungen ermöglicht darüber hinaus weitere Analyse der glomerulären RNA und Protein sowie primäre glomeruläre Zellkultur (z. B. primäre hemolytic Zellkultur).

Einleitung

Proteinurie ist ein Markenzeichen der glomerulären Verletzungen und Störungen der glomerulären Filter¹in der Regel begleitet. Der glomeruläre Filter besteht aus den gefensterten Endothels glomerulären Basalmembran und Podocytes. Die zarte molekulare Struktur des glomerulären Filters ist sehr dynamisch und je nach Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel sowohl gesunden und kranken Nieren^2,3,4,5,6 . Endozytose Zelle Oberflächenproteine nachweislich essentiell für das Überleben der Podocytes⁷. Nephrin und Podocalyxin sind transmembrane Proteine auf Podocytes. Nephrin ist das Rückgrat der glomerulären Schlitz Membran, während Podocalyxin eine Beschichtung die sekundäre Fuß Prozesse der Podocytes^8,9,10Sialoglycoprotein. Endocytic Handel wurde zuvor für Nephrin und Podocalyxin^{3,11,12,13,14}gezeigt.

Nach bestem Wissen und gewissen wurde Endozytose Zelle Oberflächenproteine nicht noch in glomerulären Endothelzellen in der Literatur beschrieben. Allerdings äußern Endothelzellen im Allgemeinen alle notwendigen Proteine für die verschiedenen Arten von Endozytose (d. h. Clathrin-abhängige, Floß-abhängige Endozytose)^15,16. Daher kann Endothelzellen Oberfläche Handel mit dieser Methode verwenden, z. B. vaskulären endothelialen (VE) untersucht werden-Cadherin und intrazellulären Adhäsionsmolekül (ICAM-2) als Zelle Oberfläche Marker Protein für glomeruläre Endothelzellen¹⁷ .

Leider gibt es keine genaue in Vitro -Modell für zarte dreischichtigen glomerulären Filters in welche Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel studiert werden kann. Das Ziel dieser Methode ist somit glomerulären Protein des Drogenhandels in Vivozu studieren. Dieses Protokoll enthält darüber hinaus Informationen zum Glomeruli, wodurch weitere Analyse der glomerulären RNA, Proteinen und Zellen zu isolieren. Ähnliche glomerulären Isolation beschrieb Techniken von verschiedenen Gruppen^18,19.

Wir und andere haben früher, ex Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine von Biotinylierungen^2,3,4,20,21. Jedoch wurden in diese ex-Vivo -Methode isoliert Glomeruli mechanischen Belastung ausgesetzt, die endocytic Handel beeinflussen können. Alternativ ist die Immunfluoreszenz Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine beträchtlich in der Literatur^2,20,22benutzt worden. Mit dieser Methode jedoch nur eine kleine Anzahl von Proteinen innerhalb einer Folie analysiert werden kann, und Quantifizierung von Immunfluoreszenz Bildern ist oft schwierig.

Diese neuartige in-Vivo -Methode bietet ein zuverlässiges Werkzeug um glomerulären Zelle Oberfläche Protein Fülle und Menschenhandel genau in gesunden und kranken Nieren zu untersuchen, und es kann als Ergänzung zum Immunofluoreszenz Tests verwendet werden.

Protokoll

Mäuse wurden als eigene Rasse von der lokalen Tierpflege-Anlage oder von Janvier Labs in Frankreich erhalten. Die Untersuchungen wurden nach den Richtlinien beschrieben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren (US nationale Institute der Gesundheit-Veröffentlichung Nr. 85-23, revidiert 1996) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den relevanten institutionellen Zulassungen (Landesregierung LANUV Referenz Nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).

1. Vorbereitung der Ausrüstung, Instrumente und Lösungen

1. Bereiten Sie 1 L Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl₂) und 0,1 mM-Kalzium-Chlorid (CaCl₂) ergänzt (PBSCM) und durch einen Sterilfilter zu filtern.
2. Perfusion 5 mL sterile PBSCM per Mausklick vorzubereiten und auf Eis legen.
3. Bereiten Sie für jede Maus 5 mL sterile PBSCM mit 0,5 mg/mL Biotin ergänzt.
4. Für jede Maus zubereiten 5 mL steriles PBSCM und 0,8 x 10⁸ magnetische Beads (zB., 200 µL einer 4 x 10⁸ Perlen/mL Lösung ohne Vorbehandlung) für Embolisation der Glomeruli. Bereiten Sie diese Lösung unter der Zelle Kultur Bank magnetische Beads in den original Schlauch steril zu halten. Legen Sie diese Lösung auf Eis.
5. Bereiten Sie eine abschrecken Lösung durch Zugabe von 100 mM Glycin, PBSCM (5 mL pro Maus) und halten sie auf dem Eis.
6. Machen Sie eine Kollagenase-Lösung (0.378 U/mL Kollagenase A in sterilen PBSCM). Per Mausklick pipette 1 mL der Kollagenase-Lösung in eine 2 mL-Tube und legen Sie es auf dem Eis.
7. Zum Waschen, bereiten Sie sterile PBSCM (siehe Punkt 1.1) in 50 mL tube und legen Sie es auf dem Eis.
8. Durchblutung verwenden Sie eine Spritzenpumpe mit einem Fluss von 2,0 mL/min.
9. Bereiten Sie eine 10 mL Spritze mit einer Nadel 21G. Setzen Sie die Spitze der Nadel in einen 20-30 cm lange Katheter (Innendurchmesser ID = 0,58 mm). Verbinden Sie den Katheter (ID 0,58 mm) mit einem 10 cm kurzen Katheter (0,28 mm ID) und schneiden Sie die Spitze des kleineren Katheters schräg für ein leichtes Einführen in die Maus Aorta.
10. Ligatur Verfahren während der Operation schneiden Sie drei 5-7 cm Seidenfäden (4: 0, 6-0) per Mausklick.
11. Bereiten Sie für die Operation 3 chirurgische Klemmen, 2 Chirurgische Scheren, 2 Pinzette, 2 feine Pinzette, 1 feine Schere und Tupfer vor. Bereiten Sie die Narkose (z. B. intraperitoneale Betäubung Ketamin 100 mg/kg Körpergewicht und Xylazin 5 mg/kg Körpergewicht).
12. Verwenden Sie zur Isolation von der Glomeruli der beiden Nieren ein 100 µm Zelle Sieb, zwei 50 ml Röhrchen und ein Magnet-Catcher.
13. Bereiten Sie CHAPS Lyse Puffer: 20 mM-3-[(3-cholamidopropyl)-Dimethylammonio] -1-Propanesulfonate (CHAPS); 20 mM Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris) pH 7,5; 50 mM Sodiumchorlide (NaCl); 50 mM Sodiumfluoride (NaF); 15 mM Na₄P₂O₇; 0,1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) pH 8.0; 2 mM Sodiumorthovanadate; und 2 mM Adenosinetriphosphat (ATP).
14. Cool Zentrifugen auf 4 ° C.

2. Operation unter dem Mikroskop

1. Die Maus zu betäuben (z. B. mit Ketamin/Xylazin intraperitoneal, siehe Schritt 1.11). Führen Sie den Zeh-Prise Test um ordnungsgemäße Betäubung zu bestätigen.
2. Desinfizieren Sie die Unterseite der Maus mit 70 % Isopropanol.
3. Führen Sie einen Median Schnitt durch die Haut aus dem Becken, das Brustbein und entfernen Sie die Haut von der Bauch-Faszie mit einer Pinzette. Schneiden Sie die Haut auf beiden Seiten in der Mitte des Bauches mit Chirurgische Scheren.
4. Chirurgische Werkzeuge zu ändern. Zuweisen der Blase durch die Bauchmuskel-Schicht einen Median Schnitt von Xiphoid und teilen sie in vier Quadranten mit Pinzette und chirurgische Scheren. Befestigen Sie die oberen zwei beiseite mit Schellen auf den Hals der Maus mit zwei chirurgische Klemmen.
   Hinweis: Der Bauch ist nun geöffnet.
5. Viszeralen Organe mit einem sterilen Tupfer beiseite legen und das Leber-Phrenicus Ligament mit feinen Schere geschnitten.
6. Bereiten Sie eine Verbindung (mit einem Seidenfaden 4: 0, 6-0) um die Aorta proximal der Nierenarterien auf der Höhe der Nebenniere mit zwei feinen Pinzette. Anziehen der proximalen Aorta Ligatur zur Abschaffung der Durchblutung mit einer Pinzette.
7. Frei von der distalen Aorta aus Faszie, Fett und anderen Geweben und bereiten eine Ligatur um die Leber/mesenterialen Arterie cranial der der Nierenarterien feine chirurgische Pinzette.
8. Bereiten Sie eine Verbindung (mit einem Seidenfaden 4: 0, 6-0) um die Aorta distal von der Nierenarterien und Klemmen Sie die Vena Cava und Aorta in der Höhe von der Bifurkation.
9. Schneiden Sie ein kleines Loch in die Aorta distal an den Nierenarterien damit das Loch der halbe Durchmesser der Aorta ist. Setzen Sie den Katheter in die Aorta und fixieren Sie es mit der vorbereiteten Ligatur.
   Achtung: Vermeiden Sie Luftblasen in der Perfusion System, Luft-Embolie zu verhindern.
10. Beginnen Sie Perfusion mit eiskalten PBSCM bei einer Durchflussmenge von 2 mL/min.
11. Schneiden Sie ein Loch in die renale Vene auf der Ebene der Nierenarterien mit feinen Chirurgische Scheren und festziehen Sie der Ligatur um die Leber- und mesenterialen Arterien.
    Hinweis: Nieren sollte blass biegen Sie nach dem Start der Perfusion.

3. in Vivo Biotinylierungen

1. Änderung der Spritze blasenfreie, eiskalte PBSCM durchspülen der Nieren mit 5 mL bei einer Durchflussmenge von 2 mL/min und mit 0,5 mg/mL Biotin für Oberfläche Kennzeichnung ergänzt.
   Hinweis: Mischen Sie die PBSCM-Lösungen (z. B. durch drehen die 50 mL-Röhrchen) sanft zu vermeiden Luftblasen innerhalb der Lösung. Nach dem Absaugen der Lösung in die Spritze keine Luftblasen oder Luft aus der Spritze zu evakuieren. Verwenden Sie eine zusätzliche Kanüle (21G) auf der Spritze, um den Raum in die Kanüle zu füllen, die mit dem Kathetersystem verbunden ist. Schließlich halten Sie die Spritze in die Kanüle mit dem Katheter blasenfrei.
2. Ändern Sie die Spritze blasenfrei in eiskalten PBSCM ergänzt mit 100 mM Glycin zu stillen die Glomeruli und durchspülen mit 5 mL bei einem Flow von 2 mL/min.
3. Änderung der Spritze blasenfreie, eiskalte PBSCM mit 200 μL magnetischen Perlen/mL ergänzt und durchspülen der Nieren mit 2 mL/min.
   Hinweis: Auf der Oberfläche der Niere, Embolisation der Glomeruli mit braunen magnetische Beads werden angezeigt.

4. Isolierung der Glomeruli aus zwei Nieren

1. Nieren auf das Hilum und Entfernen der Kapsel. Legen Sie die Nieren auf Eis in 15 mL PBSCM in der Kulturschale 10 cm Zelle. Einschläfern Sie die Maus mit zervikale Dislokation in Narkose nach der Ernte der Nieren. Die Operation und Perfusion Verfahren dauern ca. 20-22 min.
2. Schneiden Sie Nieren in die kleinsten Stücke möglich mit einer neuen zweischneidiges Klinge. Bewegen Sie das Gewebe in ein 2 mL Röhrchen mit 1 mL der Kollagenbildung A (siehe Schritt 1.6) und Digest bei 37 ° C für 30 Minuten. Mischen Sie vor und nach der Verdauung mit einem 1000 μl Pipette geschnitten.
3. Spülen Sie das verdaute Gewebe durch ein 100 μm Zelle Sieb mit eiskalten PBSCM. Verwenden Sie sanft die Zelle-Schaber, um hacken des übrigen Gewebe Troges der Zelle Sieb und spülen Sie ihn mit eiskalten PBSCM danach auf ein Gesamtvolumen von 50 mL.
4. Zentrifugieren Sie die Federung bei 4 ° C 500 X g, für 5 min. Überstand zu entfernen und erneut das Pellet mit etwas weniger als 1,5 mL eiskaltes PBSCM beim Aufschütteln der Pellet. Danach setzen Sie die glomeruläre Suspension in eine neue 2-mL-Tube.

5. Waschen

1. Verwenden der Magnet-Catcher, um die Glomeruli auf der einen Seite zu ziehen. 1 min. warten Sie, bevor die Glomeruli in Richtung der Magnet bewegt haben.
2. Den Überstand mit einer 1000 μl Pipette zu entfernen, während der 2 mL Tube in der Magnet-Fänger bleibt. Während des ersten und zweiten Waschens Schritte (siehe Punkt 5.3), 250 μl überstand bleibt in der Röhre, um den Verlust der Glomeruli zu vermeiden. Führen Sie dieses Verfahren schnell, um zu vermeiden, röhrenförmige Strukturen auf den Boden des Röhrchens sinken zu lassen.
   Hinweis: Der Waschvorgang wird sonst länger dauern.
3. Entfernen der 2 mL Tube von Magnet-Catcher und 1 mL PBSCM, Pipette rauf und runter (sehr wichtig), dann Wirbel.
4. Setzen Sie den Schlauch wieder in der Magnet-Fänger und starte mit Schritt 5.2.
5. Wiederholen Sie die Waschschritte, bis die Reinheit der Glomeruli 90 % erreicht hat. Dazu untersuchen Sie eine repräsentative Teilprobe des Überstands unter dem Mikroskop (40-100 X).
   Hinweis: Glomeruli erscheinen als Runde Strukturen, die braune magnetische Kügelchen enthalten. Längliche Strukturen sind röhrenförmige Fragmente und kostenlose magnetische Beads als braune Runde Punkte angezeigt. Zellenrückstand kann als sperrige Strukturen angezeigt werden.
6. Wenn Reinheit erreicht ist, schätzen Sie die Anzahl der Glomeruli durch Auflösen der Glomeruli in 1 mL PBSCM. Nach dem Mischen eine aliquote 10 μL und dabei die Glomeruli unter die Lupe genommen. Die Anzahl der Glomeruli mit folgender Gleichung berechnen: endgültige Zahl der Glomeruli = Anzahl der Glomeruli in 10 μL aliquoten X 100.
7. Erfolgreiche Isolierung der Glomeruli führt zu einer Reihe von 10.000-40.000 Glomeruli.

6. Proteingewinnung und Immunopräzipitation (IP)

1. Sammeln Glomeruli durch Zentrifugation bei 4 ° C bei 6800 X g für 5 min. Überstand zu entfernen, wobei eine Magnet-Catcher und Aufschwemmen das Pellet in eiskalten Lyse Puffer (zB., 30.000 Glomeruli in 300 μl; CHAPS, siehe Schritt 1.11). Homogenisieren von Proben mit einem Gewebe-Homogenisator bei höchster Geschwindigkeit für 30 s und lösen Sie diese für 30 min auf Eis.
2. Entfernen von unlöslichen Material durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand enthält die Zelle lysate zu einem neuen Schlauch 1,5 mL Pipette. Entsorgen Sie das Pellet.
3. Messen die Konzentration des Proteins des Überstands mithilfe eines Bicinchoninic (BCA)-basierte Methode nach den Anweisungen des Herstellers. Eine erfolgreiche lyse von 30.000 Glomeruli führt zu einer glomerulären Protein-Menge von 700-1.000 µg/mL. Anpassung an gleiche Protein-Mengen mit Lyse Puffer.
4. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 % des Gesamtvolumens für glomeruläre lysate und fügen Sie 2 x Laemmli + Dithiothreithol (DTT) vor der Inkubation für 5 min bei 95 ° C.
5. Inkubieren Sie für IP-Adresse den Rest der lysate mit Streptavidin Agarose Perlen über Nacht bei 4 ° C auf eine obenliegende Shaker.
6. Agarose Korne 1000 X g für 3 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand entfernen und hinzufügen 800 μl der Lyse Puffer, die Perlen für unspezifischen Proteinbindung zu waschen.
7. Die Wäsche 3 Mal wiederholen, und den Überstand vollständig entfernen.
8. Fügen Sie 30 μl 2 x Laemmli + DVB-t und bei 95 ° C für 5 min inkubieren.
9. Laden der lysate und IP-Sonden auf ein 10 % SDS gel und laufen das SDS-Gel auf 70 V für 30 min, dann auf 20 mA pro Gel für 1,5 h blot anschließend das Gel für 2 h bei 200 mA auf eine Nitrocellulose-Membran.
10. Blockieren Sie die Nitrozellulose-Membran über Nacht bei 4 ° C mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in Waschpuffer.
11. Inkubieren Sie die Membran mit dem Antikörper von Interesse über Nacht bei 4 ° c Waschen mit Waschpuffer 3 Mal für 5 min auf einem Boston-Shaker und die Membran mit dem HRP-markierten Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie die Waschschritt.
12. Die lysate zu visualisieren und Immunopräzipitation Sonden auf der Membran mit einer Höchstauflösung Chemilumineszenz-Agent mit einer CCD-Kamera.

Ergebnisse

Um die Glomeruli präzise zu isolieren, ist es notwendig, murine Nieren mit PBSCM ersten durchspülen. Perfusion mit PBSCM dreht Nieren blass (Abb. 1A). Embolisation der Glomeruli mit magnetischen Beads wird als braune Punkte auf der Oberfläche der Niere (Abbildung 1B) angezeigt. Isolierung der Glomeruli mit Magnet-Catcher kann Verunreinigungen mit renalen Tubuli (Abbildung ...

Diskussion

Die vorgestellte Methode ermöglicht erfolgreiche Isolierung der Glomeruli glomerulären RNS oder Protein zu untersuchen. Darüber hinaus können primäre glomeruläre Zellkulturen aus isolierten Glomeruli durchgeführt werden. Biotin vor glomerulären Isolierung angewendet wird, kann der glomerulären Zelle Oberflächenproteine Kennzeichnung durchgeführt werden. Mit dieser Methode in Vivo glomerulären Zelle Oberfläche Protein des Menschenhandels kann untersucht werden, und semi-Quantifizierung der Protein F?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	microscope for mouse surgery
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	light for mouse surgery
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer	PZN:01320422	anesthesia
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	fine scissors, for cut into the aorta
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	for abdominal cut
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	for surgery until the abdomen is opened
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	for surgery
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	silk thread
Ketamine 10%	Medistar		anesthesia
Rompun (Xylazin) 2%	Bayer		anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm	Portex	800/100/100	Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm	Portex	800/100/200	Catheter
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	syringe pump
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	biotin
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	to embolize glomeruli
Collagenase A	Roche	10103578001	to digest kidney tissue
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Magnet catcher
100µm cell stainer	Greiner-bio	542000	for glomerular isolation
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non available	to confirm glomerular purity
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Tissue homogenizer
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	for lysis buffer
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	for lysis buffer
NaCl	VWR chemicals	27810295	for lysis buffer
NaF	Sigma-Aldrich	201154	for lysis buffer
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	for lysis buffer
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	for lysis buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Follow the manufacturer's instructions
nephrin antibody	Progen	GP-N2	for westernblot
Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody	R&D Systems	AF15556-SP	for westernblot
Streptavidin Agarose Resin	Thermo Scientific	20347	for immunoprecipitation
Protein A sepharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	for immunoprecipitation
polyclonal rabbit anti-p57 antibody	SCBT	sc-8298	for Immunohistochemistry
mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot loading control
rabbit anti-p44/42	cell signalling	4695	for westernblot
Pierce High sensitivity streptavidin-HRP	Thermo Scientific	21130	for westernblot
polyclonal mouse ICAM-2 antibody	R&D Systems	AF774	for westernblot
polyclonal mouse anti-VE-cadherin	R&D Systems	AF1002	for westernblot