人类外周血神经细胞分离通过评估Rab10磷酸化来询问帕金森氏症相关的LRRK2激酶途径

摘要

白氨酸丰富的重复激酶2基因（LRRK2）的突变导致遗传性帕金森病。我们开发了一种简单可靠的方法，用于评估人类外周血中Rab10的LRRK2控制磷酸化。这可能有助于识别具有增加LRRK2激酶通路活性的个人。

摘要

白细胞丰富的重复激酶2（LRRK2）是遗传性帕金森病（PD）中最常见的突变基因，所有致病性LRRK2突变导致其激酶功能过度活化。在这里，我们描述了一种简单而可靠的测定方法，通过测量其生理基质之一Rab10的生理基质之一Rab10，以量化人类外周血神经中粒体中的LRRK2激酶通路活性。所述的免疫印迹分析需要完全选择性和磷特异性抗体，能够识别LRRK2对Rab10 Thr73表皮磷酸酯，如MJFF-pRab10兔单克隆抗体。它使用人类外周血嗜中性粒细胞，因为外周血很容易获得，嗜中性粒细胞是丰富和同质的成分。重要的是，嗜中性粒细胞表示LRRK2和Rab10的较高水平。嗜中性粒细胞的潜在缺点是其高内在丝氨酸蛋白酶活性，这需要使用非常有效的蛋白酶抑制剂，如有机磷神经毒素二氟磷酸二磷酸二磷酸（DIFP）作为淋索缓冲液的一部分。然而，嗜中性粒细胞是研究LRRK2激酶在体内活性的宝贵资源，应考虑纳入PD生物库收集。

引言

减缓或阻止帕金森病（PD）的尝试迄今都失败了。在白细胞富重复激酶2（LRRK2）中发现超活化突变，导致和/或增加PD的风险，导致LRRK2激酶抑制剂^{11，2，32,3}的发展。这些已经进入临床试验^4。LRRK2的确切功能尚不清楚，但一个重大的进步是确定一个子集的Rab GTPase蛋白，包括Rab10，作为LRRK2激酶^{55，6，76,7}的第一个真正的生理基质。在疾病改变治疗时代的主要挑战是LRRK2激酶激活状态的生化标记物和LRRK2激酶抑制剂的目标参与。

到目前为止，LRRK2抑制剂体内的主要药代动力学标记物是LRRK2的一组磷酸化血清残留物，特别是丝氨酸935，这些残留物因对不同的LRRK2抑制剂^88、99而变得脱磷化。然而，丝氨酸935磷酸化与内在细胞LRRK2激酶活性无关，因为它不是LRRK2直接磷酸化，并且仍然磷酸化在激酶不活性LRRK2^10。LRRK2激酶活性与丝氨酸1292的自磷酸化密切相关，但实际来说，由于目前该站点^10、11,11缺乏可靠和磷特异性抗体，因此，通过免疫blot分析整细胞提取物，它不是内源性LRRK2激酶活性的合适读出。

我们开发了一种强健且易于测定的测定方法，用于量化人类外周血细胞中的LRRK2激酶通路活性，测量其生理目标蛋白Rab10在threonine 73¹¹的LRRK2控制磷酸化。外周血很容易通过单月切除，这是一个低风险和快速的程序，导致最小的不适。我们专注于人类外周血嗜中性粒细胞，因为它们构成丰富的（占所有白细胞的37-80%）和同质细胞群，表示相对较高的LRRK2和Rab10¹¹水平。此外，外周血嗜中性粒细胞可以通过采用免疫磁阴性方法快速有效地分离。为了确保随后观察到的Rab10磷酸化由LRRK2介导，每批嗜中性粒细胞都孵育有或没有强效和选择性的LRRK2激酶抑制剂（我们使用并推荐MLi-2）2，12。^2,12然后，在含有蛋白酶抑制剂二丙酸酯磷酸（DIFP）的缓冲液中细胞水解，这是抑制内生氨酸蛋白酶活性所必需的，已知在中性粒细胞中含量高^13。对于定量免疫印迹的最终分析，我们建议使用MJFF-pRab10兔子单克隆抗体，专门检测Rab10 Thr73-磷脂蛋白，并且不与其他磷酸化的Rab蛋白¹⁴发生交叉反应。这种抗体的选择性和特异性已验证在不同的Rab蛋白和A549 Rab10敲出细胞系¹⁴的过度表达模型。因此，我们测量了使用和未经过强效和选择性LRRK2激酶抑制剂²治疗的中性粒细胞中Rab10磷酸化的差异。或者，也可以通过其他方法（如定量质谱法）分析样品。

最后，LRRK2控制的Rab10磷酸化是LRRK2激酶活性对935号丝氨酸LRRK2磷酸化的优越标志，人类外周血嗜中性粒细胞是PD研究LRRK2的宝贵资源。我们的协议提供了一个强大和容易的测定，以查询LRRK2途径活性在外周血神经中，并允许生物化学分层的人与增加LRRK2激酶活性^15。重要的是，这些个体可能受益于未来的LRRK2激酶抑制剂治疗。

研究方案

根据英国当地法规，人类血液的所有操纵和移液都发生在第 2 类生物安全柜中。所有程序均符合当地道德审查委员会的规定，所有参与者均提供知情同意。

1. 准备

1. 制备 0.1 mL EDTA 库存溶液 1，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中含有 100 mM EDTA。
2. 准备 60 mL EDTA 库存解决方案 2，在 PBS 中包含 1 mM EDTA。
3. 准备含 50 mM Tris-HCl 的集石液缓冲液 （pH = 7.5）， 1% （v/v） Triton X-100， 1 mM EGTA，1 mM Na₃VO_4，50mM NaF，10 mM β-甘油磷酸盐，5 mM焦磷酸钠，0.27 M蔗糖，0.1%（v/v）β-甲醇，1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒，1 μg/mL微囊素-LR，和0.5mm二甲丙丙酸酯（DIFP）。
   注:作者经常使用不含EDTA的产品，但含有EDTA蛋白酶抑制剂的鸡尾酒也应该有效。溶酶缓冲液无需β-甲酮乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊素-LR和DIFP即可提前制造，并储存在4°C下，直到使用。确保β-甲酮乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊西蛋白-LR和DIFP仅在使用前立即添加。
   注意:DIFP 是有毒的，应在当地健康和安全风险评估后，在烟雾罩中小心处理。DIFP 可以添加到集回液缓冲液中并立即使用。或者，包含所有其他组件（包括 DIFP）的完整水成缓冲液可以换载并储存在-80°C，以便随后使用至少 4 周。

2. 从全血中分离中性粒细胞

1. 将10mL的血液收集到血液收集管中。通过反转管 7×8x 轻轻混合。
2. 将10 mL的血液转移到50mL锥形管中。
3. 将 100 μL 的 EDTA 库存溶液 1 添加到血液中。轻轻混合。
4. 从中性粒细胞分离试剂盒（材料表）中加入500 μL的分离鸡尾酒（50 μL/mL）到整个血液样本中。
5. 使用前将中性粒体分离套件中的磁珠旋涡30s，以重新悬浮非常精细的磁珠。
6. 将500 μL的磁珠添加到血液样本中，并多次反转管子，轻轻混合。
7. 在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
8. 使用 EDTA 库存解决方案 2 将管填充到 50 mL。混合通过非常轻轻地移液向上和向下2~3倍。
9. 将管放入磁铁并取下盖子，以避免随后的管部搅拌。
10. 在RT孵育10分钟。
11. 小心地将含有中性粒细胞的浓缩细胞悬浮液移入新的50mL锥形管中。
    注:请勿触摸与磁铁接触的管侧，避免收集和干扰管底的红血球。将大约 10 mL 的红血球悬浮液留在管底。
12. 在使用前将磁珠旋30s，并将0.5 mL的磁珠添加到含有富美嗜中性粒细胞的管子中。通过反转管轻轻混合。
13. 在RT孵育5分钟。
14. 将管子放入磁铁并取下盖子，以避免随后的搅拌。
15. 在RT孵育5分钟。
16. 小心地将含有中性粒细胞的浓缩细胞悬浮液移入新的50mL锥形管中。
    注:请勿触摸与磁铁接触的管侧。将约 5 mL 的悬架留在管的底部。
17. 为确保从细胞混合物中完全去除磁珠，将含有浓缩细胞的管子放入磁铁中。
18. 在RT孵育10分钟。
19. 小心地将现在含有纯中性粒细胞的浓缩细胞悬浮液移移成新的50mL锥形管。
    注:请勿触摸与磁铁接触的管侧。将约 5 mL 的悬架留在管的底部。
20. 将分离的电池与 1 mM EDTA 库存解决方案 2 混合到约 41 mL 的最终体积。上下移液混合。
21. 将溶液平均分成两个管，每个管中约 20 mL。
22. 将两个管在 335 x g下离心 5 分钟。
23. 在此离心期间，从-80 °C冰柜中取出 MLi-2 抑制剂（200 μM/1，000x 浓度），然后留在 RT 中供后续使用。
24. 离心步骤后，立即不搅拌管，倒入上清液，而不会干扰中性粒体。通过在RT处轻轻移液细胞上下4倍，在RT的10 mL细胞培养培养基中重新悬浮每个细胞颗粒（材料表）。

3. 纯中性粒细胞的LRRK2激酶抑制剂治疗

1. 将一个管标记为"DMSO"，另一个管为"MLi-2"。
2. 到标有"DMSO"标签的管中，加入10μL的DMSO，并通过上下移液2倍，用10 mL移液器轻轻混合。到"MLi-2"标记管中，加入10 μL 200 μM MLi-2库存溶液（最终浓度200 nM），并通过上下移液器上下2倍轻轻混合。
3. 在RT中孵育样品30分钟，在孵育过程中每10分钟通过反转轻轻进行一次。
4. 在孵育期间，从-80°C冰柜中取出0.5M DIFP库存，放入冰上烟气罩中。从-80°C冷冻机中取出1mg/mL微囊霉素-LR库存溶液，在RT解冻。从冰箱中取出除位（0.25 mL）的滑液缓冲液，使其在 RT 处解冻，然后将其放在冰上，以便随后使用。
5. 准备1 mL的细胞培养基，含有1μL的DMSO，并调用此DMSO重新悬浮缓冲液。准备 1 mL 的 RPMI 介质，含有 1 μL 200 μM MLi-2，并调用此 MLi-2 重新悬架缓冲液。
6. 在30分钟的潜伏期后，将两个管以335 x g的离心机5分钟。
7. 小心地在每个管中丢弃上清液，而不会干扰中性粒体。
8. 对于 DMSO 标记的样品，在 DMSO 重新悬浮液的 1 mL 中轻轻重新悬浮颗粒，对于 MLi-2 标记管，在 MLi-2 重新悬架缓冲液的 1 mL 中重新悬浮颗粒。
9. 将重新悬浮的细胞颗粒转移到标有"DMSO"和"MLi-2"的相应离心管中，并在335 x g下将两个管离心3分钟。
10. 在离心步骤中，准备压网缓冲液。在烟囊中，小心地将0.25 μL的0.5 M DIFP溶液以及0.25μL的1mg/mL微囊精-LR添加到0.25 mL溶质液缓冲液中。混合并留在冰上，直到使用。
    注:在细胞轮变15分钟内将DIFP添加到轮回缓冲液中，因为DIFP在水溶液中相对不稳定。
11. 离心后，立即小心地用移液器完全去除所有上清剂，而不会干扰嗜中性粒体，并将管子放在冰上。
12. 立即在每个管中加入100μL的液化缓冲液，其中含有DIFP和微囊素-LR。使用 100×200 μL 移液器，通过上下移液（大约 5-10 倍）重新悬浮细胞颗粒。
13. 将冰上的细胞切碎10分钟。
14. 在 4 °C 下，在 20，000 x g下离心管 15 分钟，以清除细胞碎屑。
15. 将含有中性粒细胞的"DMSO"和"MLi-2"超钠剂转移到新的离心管中。丢弃碎屑颗粒。
    注:中性粒细胞质化液现已准备就绪，或可卡在液氮中，储存在-80°C，供将来分析。

结果

我们的测定允许用LRRK2依赖Rab10磷酸化作为读出，在人类外周血中查询PD相关的LRRK2激酶的激活。嗜中性粒细胞是一种同质和丰富的外周白细胞群，表示LRRK2和Rab10蛋白质的高水平（图1）。其余外周血单核细胞（PBMC）中唯一具有高拷贝数的两种蛋白质的细胞是单核细胞，但这些细胞只占白细胞的2-12%。这表明外周血嗜中性粒细胞是研究LRRK2控制的Rab10磷酸化的更合适的生物基质?...

讨论

令人信服的临床、遗传和生化证据表明LRRK2具有重要作用，尤其是其激酶在帕金森病^{中的作用7。}LRRK2激酶抑制剂已经开发，并进入临床试验^{22，4，12。4,12}因此，需要利用LRRK2作为生物标志物，用于目标参与和患者分层。我们的协议描述了一个强大和容易的测定，用于分析LRRK2激酶途径激活，其生理基质Rab10在人?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	used at 1 μg/ml final concentration