Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

要約

ロイシンの変異は、リピートキナーゼ2遺伝子(LRRK2)が遺伝性パーキンソン病を引き起こす。我々はヒト末梢血中のRab10のLRRK2制御リン酸化を評価するための容易で、強い方法を開発した。これは、LRRK2キナーゼ経路活性の増加を有する個体を同定するのに役立つ可能性がある。

要約

ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)は、遺伝性パーキンソン病(PD)における最も頻繁に変異した遺伝子であり、すべての病原性LRRK2突然変異はキナーゼ機能の過剰活性化をもたらす。ここでは、ヒト末梢血中のLRRK2キナーゼ経路活性を定量化するための容易で強いアッセイを、その生理学的基質の1つであるRab10のLRRK2制御リン酸化をスレオニン73で測定することによって説明する。記載された免疫ブロット法は、MJFF-pRab10ウサギモノクローナル抗体のようなLRRK2によってリン酸化されたRab10 Thr73エピトープを認識する完全に選択的かつホスホウオンギクオン性抗体を必要とする。末梢血は容易にアクセス可能であり、好中球は豊富で均質な構成成分であるため、ヒト末梢血好中球を使用する。重要なことに、好中球はLRRK2とRab10の両方の比較的高いレベルを発現する。好中球の潜在的な欠点は、その高い固有のセリンプロテアーゼ活性であり、これは、溶菌緩衝液の一部として有機リンニューロトキシンジイソプロピルフルオロリン酸塩(DIFP)のような非常に強力なプロテアーゼ阻害剤の使用を必要とする。それにもかかわらず、好中球は、生体内のLRRK2キナーゼ経路活性の研究のための貴重なリソースであり、PDバイオレポジトリコレクションに含まれるように考慮されるべきである。

概要

パーキンソン病(PD)を遅くまたは停止する試みは、これまでのところ失敗しています。PDのリスクを引き起こすおよび/または増加するロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)における過剰活性化突然変異の発見は、LRRK2キナーゼ阻害剤^{11、2、32,3}の開発につながっている。これらは今臨床試験⁴に入りました。LRRK2の正確な機能は不明であるが、大きな進歩は、LRRK2キナ^{ーゼ5、6、7,6,7}の最初のボナフィデス生理基質としてRab10を含むRab GTPaseタンパク質のサブセットの同定であった。疾患修飾治療の時代における主な課題は、LRRK2キナーゼ活性化状態の生化学的マーカーおよびLRRK2キナーゼ阻害剤の標的関与である。

これまで、インビボにおけるLRRK2阻害剤の主な薬物動態マーカーは、LRRK2の構成的にリン酸化されたセリン残基のクラスターであり、特にセリン935は、多様なLRRK2阻害剤^88,99に応答して脱リン酸化される。しかしながら、セリン935リン酸化は、LRRK2によって直接リン酸化されておらず、キナーゼ不活性LRRK2¹⁰中に依然としてリン酸化されているため、固有の細胞LRRK2キナーゼ活性と相関しない。LRRK2キナーゼ活性はセリン1292の自己リン酸化とよく相関するが、実際には、この部位^10,11,11に対する信頼できる、そしてホスホ特異的抗体の現在の欠如による全細胞抽出物の免疫ブロット分析による内因性LRRK2キナーゼ活性に適した読み出しではない。

我々は、ヒト末梢血細胞におけるLRRK2キナーゼ経路活性を定量化するための堅牢で容易なアッセイを開発し、その生理学的標的タンパク質Rab10のリン酸化をスレオニン⁷³¹¹で測定した。末梢血は、最小限の不快感を引き起こす低リスクかつ迅速な手順である静脈切除によって容易にアクセス可能である。ヒト末梢血好中球は、LRRK2とRab10¹¹の両方の比較的高いレベルを発現する豊富な(全白血球の37~80%)と均質な細胞集団を構成するため、我々は注目する。さらに、末梢血好中球は、免疫磁気陰性アプローチを採用することにより、迅速かつ効率的に単離することができる。その後観察されたRab10リン酸化がLRRK2によって媒介されることを確実にするために、好中球の各バッチは、強力で選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤の有無にかかわらずインキュベートされる(我々はMLi-2を使用し、推奨する^{)2、12。,12}この後、プロテアーゼ阻害剤ジイソプロピルフルオロリン酸塩(DIFP)を含む緩衝液中の細胞溶出が続き、好中球¹³において高くすることが知られているセリンプロテアーゼ活性を抑制するために必要である。定量免疫ブロット法による最終分析では、Rab10 Thr73-ホスホエピトープを特異的に検出し、他のリン酸化ラブタンパク質¹⁴と交差反応しないMJFF-pRab10ウサギモノクローナル抗体を用いることにお勧めします。この抗体の選択性と特異性は、異なるRabタンパク質の過剰発現モデルおよびA549 Rab10ノックアウト細胞ライン¹⁴において検証されている。従って、強力かつ選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤²の有無にかかわらず治療された好中球の溶血体におけるRab10リン酸化の差を測定する。あるいは、定量質量分析などの他の方法によってサンプルを分析することもできる。

結論として、LRRK2制御のRab10リン酸化は、セリン935におけるLRRK2リン酸化に対するLRRK2キナーゼ活性の優れたマーカーであり、ヒト末梢血好中球は、LRRK2に関するPD研究の貴重なリソースである。我々のプロトコルは、末梢血好中球中のLRRK2経路活性を問い合わすために堅牢で容易なアッセイを提供し、LRRK2キナーゼ活性¹⁵を増加した個体の生化学的階層化を可能にする。重要なことに、このような個体は、将来のLRRK2キナーゼ阻害剤治療の恩恵を受ける可能性がある。

プロトコル

現地の英国の規制によると、人間の血液のすべての操作とピペットは、カテゴリー2の生物学的安全キャビネットで行われます。すべての手続きは、地域の倫理審査委員会に従って行われ、すべての参加者はインフォームド・コンセントを提供しています。

1. 準備

1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に100 mM EDTAを含むEDTAストック溶液1の0.1 mLを調製します。
2. PBSに1 mM EDTAを含むEDTAストック溶液2の60 mLを調製します。
3. 50 mM Tris-HCl (pH = 7.5) を含むリシスバッファーを準備し、1%(v/v) トリトン X-100、 1 mM EGTA、1 mM Na₃VO_4、50mM NaF、10 mM β-グリセロリン酸、5 mMピロリン酸ナトリウム、0.27 Mショ糖、0.1%(v/v)βメルカプトエタノール、1xプロテアーゼ阻害剤カクテル、1 μg/mLシストシン-LR、0.5mMジプロピソリン酸(DPPリン酸)
   注:著者らはEDTAフリー製品を日常的に使用していますが、EDTA含有プロテアーゼ阻害剤カクテルも機能するはずです。このリシス緩衝液は、β-メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤、ミクロシスチン-LR、およびDIFPを使用せずに事前に作製し、使用するまで4°Cで保存することができる。β-メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤、ミクロシスチン-LR、およびDIFPが使用直前にのみ添加されることを確認してください。
   注意:DIFPは有毒であり、地元の健康と安全リスク評価に続いて、ヒュームフードで注意して処理する必要があります。DIFPは、リシスバッファーに添加し、すぐに使用することができます。あるいは、DIFPを含む他のすべての成分を含む完全なリシスバッファーを、少なくとも4週間の後で使用するために-80°Cでアリクォートして保存することができる。

2. 全血からの好中球の分離

1. 血液採取管に10mLの血液を集める。チューブを7-8x反転して、そっと混ぜます。
2. 血液10mLを50mL円錐管に移す。
3. 血液に100μLのEDTAストック溶液1を加えます。やさしく混ぜます。
4. 好中球分離キット(材料表)から全血サンプルに500 μLの分離カクテル(50 μL/mL)を加えます。
5. 非常に微細な磁気ビーズを再懸濁させるために使用前に30 sの中等球分離キットからの磁気ビーズを渦。
6. 血液サンプルに500μLの磁性ビーズを加え、チューブを数回反転して軽く混ぜます。
7. 室温(RT)で5分間インキュベートします。
8. EDTAストックソリューション2でチューブを50 mLに充填します。2~3倍の上下にピペットを軽く入れ込んで混ぜます。
9. チューブをマグネットに入れ、蓋を取り外してチューブのその後の攪拌を避けます。
10. RTで10分間インキュベートします。
11. 新しい50 mL円錐形の管に好中球を含む濃縮された細胞懸濁液を注意深くピペット。
    注:磁石に接触しているチューブの側面に触れないようにし、チューブの底部にある赤血球の採取と摂動を避けてください。約10mLの赤血球懸濁液をチューブの底に残します。
12. 使用前に30 sの磁気ビーズをボルテックスし、濃縮された好中球を含むチューブに磁気ビーズの0.5 mLを追加します。管を逆にしてやさしく混ぜます。
13. RTで5分間インキュベートします。
14. チューブを磁石に入れ、蓋を取り外して、その後の動揺を避けます。
15. RTで5分間インキュベートします。
16. 新しい50 mL円錐形の管に好中球を含む濃縮された細胞懸濁液を注意深くピペット。
    メモ:磁石に接触しているチューブの側面に触れないでください。チューブの底部に約5mLの懸濁液を残します。
17. 細胞混合物から磁気ビーズを完全に除去するには、濃縮された細胞を含むチューブを磁石に入れます。
18. RTで10分間インキュベートします。
19. 新しい50 mL円錐形の管に今純粋な好中球を含んでいる濃縮された細胞懸濁液を慎重にピペット。
    メモ:磁石に接触しているチューブの側面に触れないでください。チューブの底部に約5mLの懸濁液を残します。
20. 分離した細胞を1 mM EDTAストックソリューション2と混合し、最終容積は約41mLにします。ピペットを上下に混ぜ合わせます。
21. 各チューブに約20mLの2つのチューブに溶液を均等に分割します。
22. 遠心分離機は335 x gで5分間の両方の管。
23. この遠心分離の間にMLi-2阻害剤のストック(200 μM/1,000x濃度)を-80°Cの冷凍庫から取り出し、RTに放置して、その後使用します。
24. 遠心分離ステップの直後とチューブの攪拌なしに、好中球ペレットを乱すことなく上清を注ぎます。各細胞ペレットを10mLの細胞培養培地(材料表)でRTで再懸濁し、細胞を上下に軽くピペット処理して4倍にします。

3. 純粋好中球のLRRK2キナーゼ阻害剤の治療

1. 一方のチューブに「DMSO」と他のチューブ「MLi-2」のラベルを付けます。
2. 「DMSO」ラベル付きチューブに、DMSOの10 μLを加え、10 mLピペットで2倍上下にピペットを加え、穏やかに混ぜます。「MLi-2」ラベル付きチューブに、200 μM MLi-2ストック溶液(最終濃度200 nM)の10 μLを加え、10 mLピペットで2倍上下にピペットを加え、穏やかに混ぜます。
3. RTで30分間サンプルをインキュベートし、インキュベーション中に10分ごとに反転して穏やかに混ぜます。
4. インキュベーション期間中、-80°Cの冷凍庫から0.5M DIFPストックを取り出し、氷の上のヒュームフードに入れてください。-80°C冷凍庫から1mg/mLマイクロシスチン-LRストック溶液を取り出し、RTで解凍します。リシスバッファーのアリコート(0.25 mL)を冷凍庫から取り出し、RTで解凍し、その後使用するために氷の上に置きます。
5. DMSO 1 μLを含む細胞培養培地を1 mL用意し、このDMSO再懸濁液を呼び出します。200 μM MLi-2 の 1 μL を含む RPMI メディアを 1 mL 準備し、この MLi-2 リサスペンション バッファと呼びます。
6. 30分インキュベーション期間の後、遠心分離機は335 x gで5分間の両方のチューブを。
7. 慎重に好中球ペレットを乱すことなく、各チューブ内の上清を捨てます。
8. DMSOラベルサンプルの場合、ペレットをDMSO再懸濁液バッファーの1mLに、MLi-2ラベル付きチューブ用に1mLに徐停止し、MLi-2リサスペンションバッファーの1mLにペレットを再懸濁させます。
9. 再懸濁された細胞ペレットを「DMSO」と「MLi-2」とラベル付けされた対応する遠心分離チューブに移し、両方のチューブを335 x gで3分間移動します。
10. 遠心分離工程中に、リシスバッファーを調製する。ヒュームフードでは0.5 M DIFP溶液0.25 μLを慎重に加え、0.25 μLの1 mg/mLマイクロシスチン-LRを0.25 mL溶解バッファーに加えます。混ぜて氷の上に置いておいて使います。
    注: DIFP は水溶液中では比較的不安定であるため、細胞溶解の 15 分以内に溶解バッファーに DIFP を追加します。
11. 遠心分離の直後に、慎重かつ完全に好中球ペレットを乱すことなくピペットですべての上清を除去し、氷の上にチューブを置きます。
12. DIFPおよびマイクロシスチン-LRを含む100μLのリシスバッファーを各チューブに直ちに加えます。100~200 μL のピペットを使用して、約 5 ~ 10 倍のピペットを上下にピペット処理して、細胞ペレットを再中断します。
13. 氷の上の細胞を10分間ライスします。
14. 遠心管は20,000 x gで4°Cで15分間細胞の破片を除去する。
15. 好中球の溶出物を含む「DMSO」および「MLi-2」上清を新しい遠心管に移す。デブリペレットを捨てます。
    注:好中球の溶菌は使用の準備ができているか、液体窒素で凍結し、将来の分析のために-80 °Cで保存することができます。

結果

我々のアッセイは、読み出しとしてLRRK2依存性Rab10リン酸化を用いたヒト末梢血好中球中のPD関連LRRK2キナーゼの活性化を問い合わすことを可能にする。好中球は、LRRK2およびRab10タンパク質の両方の高レベルを発現する均質で豊富な末梢白血球集団である(図1)。残りの末梢血単核細胞(PBMC)の中で、両方のタンパク質のコピー数が多い唯一の他の細胞集団は単球であるが、?...

ディスカッション

説得力のある臨床、遺伝学的、生化学的証拠は、LRRK2の重要な役割、特にパーキンソン病におけるキナーゼ機能を指摘^する。LRRK2キナーゼ阻害剤が開発され、^{臨床試験2、4、124,}に入^{っています}。そのため、患者層層と同様に、標的エンゲージメントのバイオマーカーとしてLRRK2を利用する必要があります。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	used at 1 μg/ml final concentration