Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

Resumo

Mutações no rico gene de leucina repetição quinase 2 (LRRK2) causam doença hereditária de Parkinson. Desenvolvemos um método fácil e robusto para avaliar a fosforilação controlada por LRRK2 de Rab10 em neutrófilos de sangue periféricos humanos. Isso pode ajudar a identificar indivíduos com aumento da atividade da via de quinase LRRK2.

Resumo

A rica incidência de quinase 2 (LRRK2) é o gene mais frequentemente mutado na doença hereditária de Parkinson (DP) e todas as mutações lRRK2 patogênicas resultam na hiperativação de sua função quinase. Aqui, descrevemos um ensaio fácil e robusto para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em neutrófilos de sangue periférico sénior humano medindo a fosforilação controlada por LRRK2 de um de seus substratos fisiológicos, Rab10 at threonine 73. A análise imunoblotting descrita requer um anticorpo totalmente seletivo e fosforespecífico que reconhece o rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como o anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10. Ele usa neutrófilos de sangue periféricos humanos, porque o sangue periférico é facilmente acessível e os neutrófilos são um constituinte abundante e homogêneo. É importante ressaltar que os neutrófilos expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab10. Uma desvantagem potencial dos neutrófilos é sua alta atividade protease serinica intrínseca, que requer o uso de inibidores de protease muito potentes, como o organophosphorus neurotoxin diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte do tampão de lise. No entanto, os neutrófilos são um recurso valioso para a pesquisa sobre a atividade da via de quinase LRRK2 in vivo e devem ser considerados para inclusão em coleções biorepositórias de DP.

Introdução

As tentativas de retardar ou parar a doença de Parkinson (DP) falharam até agora. A descoberta de mutações hiperativanas na rica incidência repetição quinase 2 (LRRK2) que causam e/ou aumentam o risco de DP levou ao desenvolvimento de inibidores de quinase LRRK2^1,2,3. Estes já entraram em ensaios clínicos⁴. A função exata do LRRK2 não é clara, mas um grande avanço tem sido a identificação de um subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluindo Rab10, como os primeiros substratos fisiológicos de boa fé da quinase LRRK2^5,6,7. Os principais desafios na era da terapêutica modificadora de doenças são marcadores bioquímicos do status de ativação da quinase LRRK2 e o engajamento alvo dos inibidores da quinase LRRK2.

Até agora, o principal marcador farmacocinético para inibidores LRRK2 in vivo tem sido um aglomerado de resíduos serinas constitutivamente fosforilados de LRRK2, em particular serino 935, que se tornam defosforilados em resposta aos diversos inibidores lRRK2^8,9. No entanto, a fosforilação serina 935 não se correlaciona com a atividade intrínseca celular LRRK2 quinase porque não é diretamente fosforilada por LRRK2 e ainda é fosforilada em quinase-inativa LRRK2¹⁰. A atividade de quinase LRRK2 correlaciona-se bem com a autofosforilação de serina 1292, mas não é em termos práticos uma leitura adequada para a atividade endógena lRRK2 quinase por análise imunoblot de extratos celulares inteiros devido à atual falta de anticorpos confiáveis e fosfoespecíficos para este site^10,11.

Desenvolvemos um ensaio robusto e fácil para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em células sanguíneas periféricas humanas que mede a fosforilação controlada por LRRK2 de sua proteína alvo fisiológica Rab10 em threonine 73¹¹. O sangue periférico é facilmente acessível por venesection, que é um procedimento de baixo risco e rápido que causa desconforto mínimo. Focamos em neutrófilos de sangue periféricos humanos porque eles constituem uma população abundante (37-80% de todos os glóbulos brancos) e células homogêneas que expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab10¹¹. Além disso, os neutrófilos sanguíneos periféricos podem ser isolados de forma rápida e eficiente, empregando uma abordagem negativa imunomagnética. Para garantir que a fosforilação rab10 subseqüente observada seja mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos é incubado com ou sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK2 (usamos e recomendamos MLi-2)^2,12. Isso é seguido por lise celular em um tampão contendo o inibidor de protease fluorofosfato de diisopropílico (DIFP), que é necessário para suprimir a atividade de protease serina intrínseca que é conhecida por ser alta em neutrófilos¹³. Para a análise final por imunoblotação quantitativa, recomendamos o uso do anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10 que detecta especificamente o Rab10 Thr73-phosphoepitope e não reage cruzadamente com outras proteínas rab fosforiladas¹⁴. A seletividade e especificidade deste anticorpo foi validada em modelos de superexpressão de diferentes proteínas Rab e uma linha de células knock-out A549 Rab10¹⁴. Assim, medimos a diferença na fosforilação rab10 em lisatos neutrófilos que foram tratados com e sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK2². Alternativamente, as amostras também poderiam ser analisadas por outros métodos, como espectrometria de massa quantitativa.

Em conclusão, a fosforilação rab10 controlada por LRRK2 é um marcador superior da atividade de quinase LRRK2 à fosforilação LRRK2 na serina 935 e os neutrófilos de sangue periféricos humanos são um recurso valioso para a pesquisa de PD em LRRK2. Nosso protocolo fornece um ensaio robusto e fácil para interrogar a atividade da via LRRK2 em neutrófilos sanguíneos periféricos e permite a estratificação bioquímica de indivíduos com aumento da atividade de quinase LRRK2¹⁵. É importante ressaltar que esses indivíduos podem se beneficiar de futuros tratamentos inibidores de quinase LRRK2.

Protocolo

De acordo com a regulamentação local do Reino Unido, todas as manipulações e pipetting de sangue humano são realizadas em um gabinete de segurança biológica de categoria 2. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o conselho de ética local e todos os participantes forneceram consentimento informado.

1. Preparação

1. Prepare 0,1 mL de EDTA Stock Solution 1 contendo EDTA de 100 mM em solução salina tamponada por fosfato (PBS).
2. Preparar 60 mL de EDTA Stock Solution 2 contendo 1 mM EDTA em PBS.
3. Prepare o tampão de lyse contendo 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerosfato, pirofosfato de sódio de 5 mM, 0,27 M sacarose, 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol, 1x coquetel inibidor de protease, 1 μg/mL microcistona-LR e 0,5 mM de fluorofosfato diisopropyl (DIFP).
   NOTA: Os autores usam rotineiramente um produto livre de EDTA, mas um coquetel inibidor de protease contendo EDTA também deve funcionar. O tampão de lyse pode ser feito com antecedência sem o β-mercaptoetanol, inibidores de protease, microcistina-LR e DIFP, e armazenado a 4 °C até o uso. Certifique-se de que o β-mercaptoetanol, inibidores de protease, microcistina-LR e DIFP só é adicionado imediatamente antes do uso.
   ATENÇÃO: O DIFP é tóxico e deve ser tratado com cuidado em uma capa de fumaça após avaliação local de riscos de saúde e segurança. O DIFP pode ser adicionado ao buffer de lysis e usado imediatamente. Alternativamente, o buffer de lyse completo contendo todos os outros componentes, incluindo DIFP, pode ser alicitado e armazenado a -80 °C para uso subsequente por pelo menos 4 semanas.

2. Isolamento neutrophil de sangue total

1. Coletar 10 mL de sangue em um tubo de coleta de sangue. Misture suavemente invertendo tubos 7-8x.
2. Transfira 10 mL de sangue para um tubo cônico de 50 mL.
3. Adicione 100 μL de EDTA Stock Solution 1 ao sangue. Misture delicadamente.
4. Adicione 500 μL do coquetel de isolamento (50 μL/mL) do kit de isolamento neutrófilo(Table of Materials)à amostra de sangue completa.
5. Vórtice as contas magnéticas do kit de isolamento de neutrófilos para 30 s antes de usar, a fim de resuspender as finas contas magnéticas.
6. Adicione 500 μL das contas magnéticas à amostra de sangue e misture suavemente invertendo o tubo várias vezes.
7. Incubar à temperatura ambiente (RT) por 5 min.
8. Encha o tubo a 50 mL com a solução de estoque EDTA 2. Misture muito suavemente pipetando para cima e para baixo 2-3x.
9. Coloque o tubo no ímã e remova a tampa para evitar a agitação subseqüente do tubo.
10. Incubar por 10 min no RT.
11. Pipeette cuidadosamente a suspensão celular enriquecida que contém os neutrófilos em um novo tubo cônico de 50 mL.
    NOTA: Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã e evite a coleta e perturbação dos glóbulos vermelhos na parte inferior do tubo. Deixe aproximadamente 10 mL da suspensão de glóbulos vermelhos para trás na parte inferior do tubo.
12. Vórtice as contas magnéticas para 30 s antes do uso e adicionar 0,5 mL das contas magnéticas ao tubo que contém os neutrófilos enriquecidos. Misture suavemente invertendo o tubo.
13. Incubar no RT por 5 min.
14. Coloque o tubo no ímã e remova a tampa para evitar agitação subseqüente.
15. Incubar no RT por 5 min.
16. Pipeette cuidadosamente a suspensão celular enriquecida que contém os neutrófilos em um novo tubo cônico de 50 mL.
    NOTA: Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã. Deixe aproximadamente 5 mL da suspensão na parte inferior do tubo.
17. Para garantir a remoção completa das contas magnéticas da mistura celular, coloque o tubo contendo as células enriquecidas no ímã.
18. Incubar por 10 min no RT.
19. Cuidadosamente pipeette a suspensão celular enriquecida que agora contém neutrófilos puros em um novo tubo cônico de 50 mL.
    NOTA: Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã. Deixe aproximadamente 5 mL da suspensão na parte inferior do tubo.
20. Misture as células isoladas com a solução de estoque EDTA 2 de 1 mM para um volume final de aproximadamente 41 mL. Pipeta para cima e para baixo para misturar.
21. Divida a solução igualmente em dois tubos com aproximadamente 20 mL em cada tubo.
22. Centrifugar ambos os tubos a 335 x g por 5 min.
23. Durante esta centrifugação, tire o estoque inibidor MLi-2 (concentração de 200 μM/1.000x) do congelador -80 °C e deixe no RT para uso subsequente.
24. Imediatamente após o passo de centrifugação e sem agitação dos tubos, despeje o sobrenadante sem perturbar as pelotas de neutrófilos. Ressuspensão de cada pelota celular em 10 mL de mídia de cultura celular(Tabela de Materiais)em RT, encanando suavemente as células para cima e para baixo 4x.

3. Tratamento inibidor de quinase LRRK2 de neutrófilos puros

1. Etiquetar um tubo "DMSO" e o outro tubo "MLi-2".
2. Ao tubo rotulado "DMSO", adicione 10 μL de DMSO e misture suavemente, pipetando para cima e para baixo 2x com uma pipeta de 10 mL. Ao tubo rotulado "MLi-2", adicione 10 μL de 200 μM MLi-2 solução de estoque (concentração final 200 nM) e misture suavemente encanando para cima e para baixo 2x com uma pipeta de 10 mL.
3. Incubar as amostras por 30 min em RT. Misture suavemente por inversão a cada 10 min durante a incubação.
4. Durante o período de incubação, remova o estoque de 0,5 M DIFP do congelador -80 °C e coloque em uma coifa de fumaça no gelo. Remova a solução de estoque de microcistina-LR de 1 mg/mL do congelador -80 °C e deixe no RT para descongelar. Retire uma alíquota (0,25 mL) do tampão de lyse do congelador, deixe-o descongelar em RT e, em seguida, coloque-o no gelo para uso subsequente.
5. Prepare 1 mL de meio de cultura celular contendo 1 μL de DMSO e chame este buffer de resuspensão DMSO. Prepare 1 mL de mídia RPMI contendo 1 μL de 200 μM MLi-2 e chame este buffer de resuspensão MLi-2.
6. Após o período de incubação de 30 min, centrifuge ambos os tubos a 335 x g por 5 min.
7. Descarte cuidadosamente o sobrenadante em cada tubo sem perturbar a pelota de neutrófilos.
8. Para a amostra rotulada DMSO resuspender suavemente a pelota em 1 mL do tampão de resuspensão DMSO e para o tubo rotulado MLi-2, resuspenda a pelota em 1 mL do tampão de resuspensão MLi-2.
9. Transfira as pelotas de células resuspensas para tubos de centrifugação correspondentes rotulados como "DMSO" e "MLi-2" e centrífugaambos ambos os tubos a 335 x g por 3 min.
10. Durante a etapa de centrifugação, prepare o tampão de lyse. Na capa de fumaça adicione cuidadosamente 0,25 μL de solução DIFP de 0,5 M, bem como 0,25 μL de microcistina-LR de 1 mg/mL ao tampão de lyse de 0,25 mL. Misture e deixe no gelo até o uso.
    NOTA: Adicione DIFP ao buffer de lyse dentro de 15 minutos de lyse celular, porque o DIFP é relativamente instável em uma solução aquosa.
11. Imediatamente após a centrifugação, remova cuidadosamente e completamente todo o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar a pelota de neutrófilos e coloque os tubos no gelo.
12. Adicione imediatamente 100 μL de tampão de lyse contendo DIFP e microcistina-LR a cada tubo. Usando uma pipeta de 100-200 μL, resuspenda as pelotas celulares encantando para cima e para baixo cerca de 5-10x.
13. Lyse as células no gelo por 10 min.
14. Tubos de centrífuga a 20.000 x g por 15 min a 4 °C para remover detritos celulares.
15. Transfira os supernatantes "DMSO" e "MLi-2" contendo os lisatos neutrófilos para novos tubos de centrifugação. Descarte a pelota de detritos.
    NOTA: Os lisatos neutrófilos estão agora prontos para uso ou podem ser congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C para análise futura.

Resultados

Nosso ensaio permite interrogar a ativação da quinase LRRK2 associada ao PD em neutrófilos de sangue periférico humano com a fosforilação Rab10 dependente de LRRK2 como leitura. Os neutrófilos são uma população homogênea e abundante de glóbulos brancos periféricos que expressa altos níveis tanto das proteínas LRRK2 quanto Rab10(Figura 1). A única outra população celular entre as células mononucleares periféricas remanescentes (PBMCs) com alto número de cópias de ambas a...

Discussão

Evidências clínicas, genéticas e bioquímicas convincentes apontam para um papel importante para o LRRK2 e, em particular, sua função quinase na doença de Parkinson⁷. Os inibidores da quinase LRRK2 foram desenvolvidos e estão entrando em ensaios clínicos^2,4,12. Como tal, há a necessidade de explorar o LRRK2 como um biomarcador para o engajamento do alvo, bem como a estratificação do paciente. N...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	used at 1 μg/ml final concentration