Isolamento del neutrofilo del sangue periferico umano per interrogare il percorso di LRRK2 Kinase associato al Parkinson valutando Rab10 Phosphorylation

Riepilogo

Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell'attività del percorso della chinasi LRRK2.

Abstract

La leucina ricca di chinasi 2 (LRRK2) è il gene più frequentemente mutato nella malattia ereditaria del Parkinson (PD) e tutte le mutazioni patogene dell'LRRK2 provocano l'iperattivazione della sua funzione di chinasi. Qui, descriviamo un saggio facile e robusto per quantificare l'attività della via della chinasi LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici dell'uomo misurando la fosforolazione controllata da LRRK2 di uno dei suoi substrati fisiologici, Rab10 alla trenolina 73. L'analisi dell'immunoblotting descritta richiede un anticorpo completamente selettivo e fosfospecifico che riconosca l'epitopo Rab10 Thr73 fosforerilato da LRRK2, come l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10. Esso utilizza neutrofili del sangue periferici umani, perché il sangue periferico è facilmente accessibile e i neutrofili sono un costituente abbondante e omogeneo. È importante sottolineare che i neutrofili esprimono livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10. Un potenziale inconveniente dei neutrofili è la loro elevata attività intrinseca di proteasi serina, che richiede l'uso di inibitori della proteasi molto potenti come la diisopropylfluorofosfati (DIFP) organosa. Tuttavia, i neutrofili sono una risorsa preziosa per la ricerca sull'attività del percorso della chinasi LRRK2 in vivo e dovrebbero essere considerati per l'inclusione nelle collezioni di biorepository della PD.

Introduzione

I tentativi di rallentare o fermare il morbo di Parkinson (PD) sono finora falliti. La scoperta di mutazioni iperattive nella leucina ricca ripetizione chinasi 2 (LRRK2) che causano e/o aumentano il rischio di PD ha portato allo sviluppo di inibitori della chinasi LRRK2^1,2,3. Questi sono ora entrati negli studi clinici⁴. L'esatta funzione di LRRK2 non è chiara, ma un importante progresso è stata l'identificazione di un sottoinsieme di proteine Rab GTPase, tra cui Rab10, come il primo substrati fisiologici in buona fede della chinasi LRRK2^5,6,7. Le sfide chiave nell'era delle terapie che modificano la malattia sono i marcatori biochimici dello stato di attivazione della chinasi LRRK2 e l'impegno mirato degli inibitori della chinasi LRRK2.

Finora, il principale marcatore farmacocinetico per gli inibitori di LRRK2 in vivo è stato un gruppo di residui di serine costituiti da fosforesti di LRRK2, in particolare serine 935, che diventano deforfatiti in risposta a diversi inibitori di LRRK2^8,9. Tuttavia, la fosfororylazione serina 935 non è correlata all'attività intrinseca della china lRRK2 cellulare perché non è direttamente fosforilata da LRRK2 ed è ancora fosforilata in lRRK2^10. L'attività della chinasi LRRK2 si correla bene con l'autofosfororylazione della serina 1292, ma in termini pratici non è una lettura adatta per l'attività endogena della chinaltra LRRK2 mediante l'analisi immunoblot di estratti di cellule intere a causa dell'attuale mancanza di anticorpi affidabili e fosforici per questo sito^10,11.

Abbiamo sviluppato un saggio robusto e facile per quantificare l'attività della vaginasi l'LRRK2 nelle cellule del sangue periferiche umane che misura l'fosfororylazione controllata da LRRK2 della sua proteina bersaglio fisiologica Rab10 alla trelina 73¹¹. Il sangue periferico è facilmente accessibile tramite venesezione, che è un basso rischio e una procedura rapida che causa un disagio minimo. Ci concentriamo sui neutrofili del sangue periferici umani perché costituiscono un'abbondante popolazione di cellule bianche (37-80% di tutti i globuli bianchi) e una popolazione omogenea di cellule che esprime livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10¹¹. Inoltre, i neutrofili del sangue periferico possono essere isolati in modo rapido ed efficiente utilizzando un approccio immunomagnetico negativo. Per garantire che la successiva fosfororylazione Rab10 osservata sia mediata da LRRK2, ogni lotto di neutrofili viene incubato con o senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK2 (usiamo e raccomandiamo MLi-2)^2,12. Questo è seguito da lisi cellulare in un buffer contenente l'inibitore della proteasi (DIisophofosfato) (DIFP), che è necessario per sopprimere l'attività intrinseca della proteasi serina che è nota per essere ad alta neutrofili¹³. Per l'analisi finale mediante immunoblotting quantitativa, si consiglia di utilizzare l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10 che rileva specificamente il Rab10 Thr73-phosphoepitope e non reagisce incrociatamente con altre proteine Rab fosforolate¹⁴. La selettività e la specificità di questo anticorpo è stata convalidata in modelli di sovraespressione di diverse proteine Rab e una linea cellulare Knock-out A549 Rab10¹⁴. Così, misuriamo la differenza nella fosforilazione Rab10 nei lismi neutrofili che sono stati trattati con e senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK2². In alternativa, i campioni potrebbero anche essere analizzati con altri metodi, come la spettrometria di massa quantitativa.

In conclusione, la fosfororylazione Rab10 controllata da LRRK2 è un marcatore superiore dell'attività della chinasi LRRK2 alla fosforolazione LRRK2 a serine 935 e i neutrofili ematici periferici umani sono una risorsa preziosa per la ricerca della PD in LRRK2. Il nostro protocollo fornisce un saggio robusto e facile per interrogare l'attività del percorso LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici e consente la stratificazione biochimica di individui con aumento dell'attività della chinasi LRRK2¹⁵. È importante sottolineare che tali individui possono beneficiare del futuro trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2.

Protocollo

Secondo la normativa locale del Regno Unito, tutte le manipolazioni e il pipettaggio del sangue umano sono intrapresi in un armadietto di sicurezza biologica di categoria 2. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il comitato di revisione etica locale e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Preparazione

1. Preparare 0,1 mL di EDTA Stock Solution 1 contenente 100 mM EDTA in salina con buffer fosfato (PBS).
2. Preparare 60 mL di EDTA Stock Solution 2 contenente 1 mM EDTA in PBS.
3. Preparare il buffer di lisi contenente 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na₃VO₄, 50 mM NaF, 10 mM, 5 mM di pirofafato di sodio, 0,27 M di saccarosio, 0,1% (v/v)-mercaptoetanolo, 1x cocktail inibitore della proteasi, 1g/mL microcystin-LR e 0,5 mM di fluorofosofato di diisopillo (DIFP).
   NOTA: Gli autori utilizzano abitualmente un prodotto privo di EDTA, ma dovrebbe funzionare anche un cocktail con inibitore della proteasi contenente EDTA. Il buffer di lisi può essere effettuato in anticipo senza il mercaptoetanolo, gli inibitori della proteasi, la microcistina-LR e la DIFP, e conservato a 4 gradi centigradi fino all'uso. Assicurarsi che gli inibitori di proteasi, la microcistina-LR e la DIFP vengano aggiunti solo immediatamente prima dell'uso.
   NPITA': DIFP è tossico e deve essere maneggiato con cura in una cappa di fumi a seguito della valutazione locale dei rischi per la salute e la sicurezza. DIFP può essere aggiunto al buffer di lisi e utilizzato immediatamente. In alternativa, il buffer di lisi completo contenente tutti gli altri componenti, incluso DIFP, può essere rivestito a -80 gradi centigradi per un uso successivo per almeno 4 settimane.

2. Isolamento dei neutrofili dal sangue intero

1. Raccogliere 10 mL di sangue in un tubo di raccolta del sangue. Mescolare delicatamente invertendo i tubi 7-8x.
2. Trasferire 10 mL di sangue in un tubo conico da 50 mL.
3. Aggiungere al sangue 100 l di soluzione EDTA Stock Solution 1. Mescolare delicatamente.
4. Aggiungete 500 l del cocktail di isolamento (50 l/mL) dal kit di isolamento dei neutrofili (Tabella dei materiali) all'intero campione di sangue.
5. Vorticare le perle magnetiche dal kit di isolamento neutrofilo per 30 s prima dell'uso al fine di risospendere le perline magnetiche molto fini.
6. Aggiungere 500 l di perline magnetiche al campione di sangue e mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte.
7. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
8. Riempire il tubo a 50 mL con EDTA Stock Solution 2. Mescolare con molto delicatamente pipetting su e giù 2-3x.
9. Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione del tubo.
10. Incubare per 10 min a RT.
11. Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL.
    NOTA: Non toccare il lato del tubo che è in contatto con il magnete ed evitare la raccolta e la perturbazione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Lasciare circa 10 mL della sospensione del globulo rosso dietro nella parte inferiore del tubo.
12. Vorticare le perline magnetiche per 30 s prima dell'uso e aggiungere 0,5 mL delle perline magnetiche al tubo contenente i neutrofili arricchiti. Mescolare delicatamente invertendo il tubo.
13. Incubare a RT per 5 min.
14. Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare agitazioni successive.
15. Incubare a RT per 5 min.
16. Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL.
    NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo.
17. Per garantire la completa rimozione delle perline magnetiche dalla miscela cellulare, posizionare il tubo contenente le cellule arricchite nel magnete.
18. Incubare per 10 min a RT.
19. Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che ora contiene neutrofili puri in un nuovo tubo conico 50 mL.
    NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo.
20. Mescolare le celle isolate con 1 mM EDTA Stock Solution 2 ad un volume finale di circa 41 mL. Pipette su e giù per mescolare.
21. Dividere la soluzione equamente in due tubi con circa 20 mL in ogni tubo.
22. Centrifuga entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.
23. Durante questa centrifuga estraendo il congelatore MLi-2 dell'inibitore (concentrazione di 200 m/1.000x) dal congelatore a -80 gradi centigradi e lasciare a RT per un uso successivo.
24. Immediatamente dopo la fase di centrifugazione e senza agitazione dei tubi, versare il supernatante senza disturbare i pellet neutrofili. Risospendere ogni pellet cellulare in 10 mL di colture cellulari (Tabella dei materiali) a RT con il pipettaggio dolce delle cellule su e giù 4x.

3. Trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2 dei neutrofili puri

1. Etichettare un tubo "DMSO" e l'altro tubo "MLi-2".
2. Al tubo etichettato "DMSO", aggiungere 10 L di DMSO e mescolare delicatamente convogliando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL. Al tubo con etichetta "MLi-2", aggiungere 10 o L di 200 MLi-2 soluzione stock (concentrazione finale 200 nM) e mescolare delicatamente pipettando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL.
3. Incubare i campioni per 30 min a RT. Mescolare delicatamente per inversione ogni 10 min durante l'incubazione.
4. Durante il periodo di incubazione, rimuovere lo stock DIFP da 0,5 M dal congelatore -80 gradi e posizionarlo in una cappa di fumi sul ghiaccio. Rimuovere 1 soluzione di riserva di microcistina-LR mg/mL dal congelatore -80 gradi centigradi e lasciare scongelare rt. Togliere dal congelatore un'aliquota (0,25 mL) del buffer di lisi, lasciarlo scongelare a RT, quindi posizionarlo sul ghiaccio per un uso successivo.
5. Preparare 1 mL di supporto di coltura cellulare contenente 1 OL di DMSO e chiamare questo buffer di sospensione DMSO. Preparare 1 mL di supporti RPMI contenenti 1 L L di 200 MLi-2 e chiamare questo buffer di sospensione MLi-2.
6. Dopo il periodo di incubazione di 30 min, centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.
7. Scartare con cura il supernatante in ogni tubo senza disturbare il pellet di neutrofilino.
8. Per il campione etichettato DMSO resospendere delicatamente il pellet in 1 mL del buffer di sospensione DMSO e per il tubo etichettato MLi-2, risospendere il pellet in 1 mL del buffer di sospensione MLi-2.
9. Trasferire i pellet cellulari risospesi nei corrispondenti tubi di centrifugazione etichettati "DMSO" e "MLi-2" e centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 3 min.
10. Durante la fase di centrifugazione, preparare il buffer di lisi. Nel cofano del fume aggiungere con attenzione 0,25 l di 0,5 M di soluzione DIFP e 0,25 L di 1 mg/mL microcistina-LR al buffer di lisi da 0,25 mL. Mescolare e lasciare sul ghiaccio fino all'uso.
    NOTA: Aggiungere DIFP al buffer di lisi entro 15 min di lisi cellulare, perché DIFP è relativamente instabile in una soluzione acquosa.
11. Subito dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione e completamente tutti i supernatali con una pipetta senza disturbare il pellet di neutrofilino e posizionare i tubi sul ghiaccio.
12. Aggiungere immediatamente 100 l di tampone di lisi contenente DIFP e microcistina-LR ad ogni tubo. Utilizzando una pipetta da 100-200 gradi, sospendere i pellet cellulari conilando su e giù circa 5-10x.
13. Liscile le cellule sul ghiaccio per 10 min.
14. Centrifuga tubi a 20.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i detriti cellulari.
15. Trasferire i supernatanti "DMSO" e "MLi-2" contenenti i lismi neutrofili in nuovi tubi di centrifugazione. Scartare il pellet di detriti.
    NOTA: I lisati neutrofili sono ora pronti per l'uso o possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi per analisi future.

Risultati

Il nostro saggio permette di interrogare l'attivazione della chinasi LRRK2 associata alla PD nei neutrofili del sangue periferici umani con la fosforo laphorylazione Rab10 dipendente da LRRK2 come lettura. I neutrofili sono una popolazione omogenea e abbondante di globuli bianchi periferici che esprime alti livelli di proteine LRRK2 e Rab10 (Figura 1). L'unica altra popolazione cellulare tra le restanti cellule mononucleari del sangue periferiche (PBMC) con un alto numero di copie di entramb...

Discussione

Compelling evidenze cliniche, genetiche e biochimiche indicano un ruolo importante per LRRK2 e in particolare la sua funzione di chinasi nella malattia di Parkinson⁷. Gli inibitori della chinasi LRRK2 sono stati sviluppati e stanno entrando negli studi clinici^2,4,12. Come tale, è necessario sfruttare LRRK2 come biomarcatore per l'impegno con il bersaglio e per la stratificazione del paziente. Il nostro p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette tips	Sarstedt	70.762	or equivalent
1.5 mL Micro tubes	Sarstedt	72.690.001	or equivalent
10 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1254.025	or equivalent
10 μL Pipette tips	Sarstedt	70.113	or equivalent
15 mL falcon tube	Cellstar	188 271	or equivalent
200 μL Pipette tips	Sarstedt	70.760.002	or equivalent
25 mL Pipette tips	Sarstedt	86.1685.001	or equivalent
50 mL falcon tube	Cellstar	227 261	or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube	BD	BD 367525	or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge	Beckman		or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)	Sigma	D0879	Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions
Dimethyl sulfoxide	Sigma	6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190094	or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet	Stemcell	18002	for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	Stemcell	19666	This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA	Sigma	E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge	Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)	Sigma	278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).			alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)	Merck	438194-10MG	or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR	Enzo Life Sciences	ALX-350-012-M001	1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC.
Na3VO4	Aldrich	450243
NaF	Sigma	S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system	Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher	21875034	or equivalent
sodium pyrophosphate	Sigma	S22
sucrose	Sigma	S0389
β-glycerophosphate	Sigma	50020
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21]	abcam	ab230261
Anti-α-tubulin	Cell Signaling Technologies	5174	used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT	LI-COR	926-68020	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW	LI-COR	926-32210	used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW	LI-COR	926-32211	used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody	generated by nanoTools (nanotools.de)	not applicable*	used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody	Antibodies Incorporated	75-253	used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2	MRC PPU Reagents and Services	UDD2	used at 1 μg/ml final concentration