在异种性鼠模型中的移植-无源疾病的诱导和评分,以及使用数字PCR对小鼠组织中人类T细胞的定量

摘要

在这里,我们提出了一个协议,以诱导和评分疾病在异种移植-宿主疾病(xenoGVHD)模型。xenoGVHD为研究人类T细胞的免疫抑制提供了一个体内模型。此外,我们介绍如何使用数字PCR检测组织中的人类T细胞,作为量化免疫抑制的工具。

摘要

急性移植物对宿主疾病(GVHD)是接受造血干细胞移植治疗血液学缺陷和恶性肿瘤的患者的重大限制。当供体T细胞识别宿主组织为外来抗原并对宿主进行免疫反应时,就会发生急性GVHD。目前的治疗涉及毒性免疫抑制药物,使患者容易感染和复发。因此,有正在进行的研究,以提供急性GVHD治疗,可以有效地瞄准供体T细胞和减少副作用。临床前的大部分工作都使用异种性GVHD(xenoGVHD)鼠模式,该模型允许在人体细胞上测试免疫抑制疗法,而不是体内体内的鼠细胞。该协议概述了如何诱导xenoGVHD以及如何使临床评分失明和标准化,以确保结果一致。此外,该协议还描述了如何使用数字PCR检测小鼠组织中的人类T细胞,随后可用于量化经测试疗法的疗效。xenoGVHD模型不仅提供了一个测试GVHD疗法的模型,而且提供了任何可以抑制人类T细胞的疗法,然后可以应用于许多炎症性疾病。

引言

异体造血干细胞移植(HSCT)已成为血液恶性肿瘤患者(如白血病,预后不良)的常规治疗。HSCT 的一个重要并发症是急性移植物与宿主疾病 (GVHD)。2012年的一项研究报告说,39%接受兄弟姐妹移植的HSCT患者和接受不相关捐赠者移植的患者中有59%出现急性GVHD。急性GVHD发生在供体衍生的T细胞攻击受体的器官时。GVHD唯一成功的治疗方法是使用高免疫抑制^药物2进行治疗,这种药物毒性极强,增加了感染和肿瘤复发的风险。因此,尽管近年来急性GVHD存活率有所^改善,但仍然迫切需要改进GVHD疗法,其毒性最小,能够促进长期缓解。

以下方法的总体目标是诱导和评分异种性GVHD(xenoGVHD)。xenoGVHD模型被开发为一种工具,诱导急性GVHD与人体细胞,而不是鼠细胞允许更直接地翻译临床前GVHD研究临床试验6。该模型涉及静脉注射人外周血单核细胞(PBMC)到NOD-SCID IL-2Rnull(NSG)小鼠,亚致命性辐照。注入的人类T细胞被人类抗原呈现细胞(ApCS)激活,呈现鼠抗原,被激活的T细胞迁移到遥远的组织,导致全身炎症,最终死亡6,7,^8,9,10.疾病病理学和进展在xenoGVHD模型密切模仿人类急性GVHD。具体来说,致病性人T细胞对鼠主要组织相容性复合物(MHC)蛋白有反应性,类似于人类GVHD6、9中的T细胞均能活性。xenoGVHD模型比小鼠MHC不匹配模型,另一个广泛使用的GVHD模型的主要优点是,它允许测试在人类细胞,而不是小鼠细胞的治疗。这允许测试产品,可以直接翻译到诊所,没有任何修改,因为它们是针对人类细胞。最近,该模型已用于测试人类抗IL-2抗体11、人类胸腺调控T细胞(Tregs)12和人类中位体^干细胞13作为急性GVHD的潜在治疗方法。在更广泛的环境中,该模型可用作任何药物或细胞类型,可以抑制人类T细胞活性的体内抑制测定。例如,Stockis^等人14使用xenoGVHD模型来研究阻断整数αV+8对体内Treg抑制活性的影响。因此,xenoGVHD模型可以提供对在体内环境中针对T细胞的任何治疗机制的洞察。

该协议中描述的另一种方法是如何使用数字聚合酶链反应(dPCR)检测小鼠组织中的人类T细胞。该方法的目的是提供一个工具,以量化目标组织中T细胞的迁移和增殖,从而测量在此模型中测试的免疫抑制疗法的疗效。dPCR是核^酸15定量的一种相对较新的方法。简单地说,PCR反应混合物被划分为包含少量目标序列或根本没有目标的分区。然后,使用DNA间插染料或荧光靶特异性探针放大和检测目标序列。dPCR根据正分区和泊森的统计数据15、16的百分数对目标序列的拷贝数进行量化。与其他替代方法(包括流式细胞学和组织学)相比,使用 dPCR 检测 T 细胞所需的组织要少得多,并且可以在冷冻或固定组织上执行。dPCR 不需要标准曲线来确定拷贝号,也不需要技术复制。与传统定量PCR(qPCR)16相比,这减少了dPCR所需的试剂和模板DNA的数量。将PCR反应划分为dPCR中的亚反应,有效地集中了^目标17。因此,dPCR主要是检测大量非目标DNA中罕见靶点的工具。例如,dPCR用于检测^牛奶18中的细菌污染,识别雌激素受体^基因19中的罕见突变,并检测患者血液中的循环肿瘤DNA20。在此协议中,dPCR作为检测和量化具有xenoGVHD的小鼠组织中人类T细胞的有效工具。

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研究方案

所有小鼠实验均符合堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。所有健康的人类血液样本都是在知情同意下取得的,并经堪萨斯大学医学中心机构审查委员会批准。

1. NSG小鼠的辐照

1. 在PBMC注射前一天,照射8-12周大的NSG小鼠(可使用任何性别)。在无菌生物安全柜中,将小鼠放入消毒的馅饼笼或微隔离器中。在Cs¹³⁷源或小型动物辐照器(例如,RS 2000)中照射小鼠,总剂量为150 cGy,旋转缓慢,以确保均匀照射。
2. 将老鼠放入无菌生物安全柜的清洁笼子里。

2. 制备用于注射的人体PBMC

1. 收集足够的健康人体血液,每只小鼠分离1.1 x 10⁷ PBMC。在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中以等于 2% 的胎儿牛血清 (FBS) 稀释肝化血液。
   注:使用此协议,PMBC 的收率一般为每 10 mL全血 0.5–1 x 10 7。每只小鼠在100 μL的PBS中将收到10⁷ PBMC。每只小鼠额外增加 1 x 10⁶ μL,确保每只小鼠在填充注射器时收到全剂量的 PBMC。
2. 将 15 mL 淋巴细胞分离密度梯度培养基(例如 Ficoll)添加到 50 mL 锥形管中,然后在密度梯度顶部小心地覆盖高达 25 mL 的稀释血液。在不踩刹车的情况下,将含有密度梯度的管在400 x g下稀释40分钟。
3. 在 50 mL 锥形管中将 PBMC 接口收获到 10 mL 的 PBS 中。使细胞在400 x g下离心10分钟,取出上清液。
4. 通过轻拂管松开颗粒,并在 10 mL PBS 中重新悬浮以清洗 PBMC。使细胞在400 x g下离心5分钟。
5. (可选)通过添加等于颗粒体积的氯化铵-氯化钾(ACK)溶化缓冲液,在细胞颗粒中丢弃上清液和溶酶红血球(RBCs)。轻轻重新悬浮颗粒,将管旋转30-60秒。用无血清RPMI介质填充管,在400 x g下离心管5分钟。
6. 去除上清液,并在5 mL的PBS中重新悬浮细胞颗粒。使用血细胞计和显微镜使用锥体蓝色排除数细胞。
7. 在400 x g下使细胞离心5分钟,在PBS中去除上清液,并在1 x 10⁸细胞/mL处重新悬浮细胞。

3.将人类PBMC的逆轨注射到^小鼠21

1. 将麻醉室放在层流罩中以保持无菌。用5%的亚福兰和1升/分钟氧气流速为麻醉室预充电5分钟。
2. 将异二苯减为2%,并将同一笼子里的老鼠放入麻醉室。一旦小鼠失去正确的权利,麻醉小鼠在室内5分钟。在此期间,预填充注射器与100μL(1 x 10⁷细胞)的细胞悬浮液。
3. 将鼠标放在加热垫上,鼻子放在鼻锥中以保持麻醉。通过捏脚垫和检查是否缺乏反射来检查意识是否丧失。
4. 用拇指和中指约束鼠标。将 28 G 1/2 插入针头中,将斜面侧下到中直,穿过结膜,直到达到眼睛的背面。稍微缩回针头,慢慢注射100 μL的细胞(1 x 10⁷细胞)。
5. 完全收回针头并妥善处理注射器和针头。用纱布海绵关闭眼睑,对注射部位施加温和的压力。
6. 检查注射部位有有有有有有有肿胀或其他可见创伤。让老鼠在用纸巾衬里的无菌笼子里恢复意识,以防在移至家中笼子之前吸入床上用品。停止出血后,在眼睛上涂抹一滴蛋白酶,以治疗失气。
   注:尾静脉注射是本方案静脉注射PBMC的替代方法,如麦克霍尔茨^等人22所述。

4. 小鼠急性GVHD的临床评分(图1)23

1. 每隔一天测量一次GVHD分数,直到老鼠达到2分,然后每天直到牺牲的一天。
   1. 将笼子放在层流罩中,取出食物和水,然后重新盖上盖子。通过观察小鼠 5 分钟并分配以下分数来得分活动:0 = 鼠标在几分钟内开始行走,并在笼子里继续走动,1 = 鼠标需要超过几分钟才能站起来,在笼子里慢慢走动,2 = 鼠标不会起床5分钟,只在触摸时步行。
2. 在玻璃烧杯中称量每只鼠标,并给出一个减肥分数:0 = <10% 变化,1 = 10±25% 变化,2 = >25% 变化。
3. 当鼠标仍在烧杯中时,检查姿势:0 = 正常,1 = 静止时驼背,2 = 驼背损害运动;毛皮质地:0 = 正常, 1 = 轻度到中度褶皱, 2 = 严重褶皱, 和皮肤完整性: 0 = 正常, 1 = 爪子/尾巴的缩放, 2 = 明显区域脱光的皮肤 (看耳朵, 尾巴和爪子的缩放).
4. 有五个类别,每个类别的分数为 0⁄2,鼠标的最高得分可以达到 10。当小鼠达到7分或以上或注射后42天时,通过CO2安乐死或当地机构动物护理和使用委员会批准的其他方法对小鼠实施安乐死。
   注:为了确保结果的准确性,评分由对治疗^组24致盲的研究人员执行。此外,虽然 >20% 的体重损失是许多 IACUC 协议的推荐人道终点,但可以获得 IACUC 批准该协议的其他理由。

5. 从安乐死小鼠中采集基因组DNA组织并分离基因组DNA

1. 使用无菌手术工具解剖小鼠。从感兴趣的器官(如肺、肝脏或脾脏)切割一块约 3 mm x 0.5 mm 大小的小块组织。称量组织样本,并将组织片放入无菌的 1.5 mL 管中。如果收集多个组织,在切割每个器官之间用乙醇清洗工具。
2. 通过浸入含有组织的管液氮来冷冻组织,直到其停止冒泡并储存在-80°C过夜。根据基因组DNA(gDNA)分离试剂盒解冻组织样本并对其进行乳化。
3. 根据试剂盒中描述的制造商说明分离基因组DNA。请务必注意每微升洗脱 gDNA (mg/μL) 处理的组织量。
   注:冷冻组织可储存在-80°C,稍后处理。

6. 使用数字PCR定量人类T细胞 (图2)

1. 根据所使用的数字PCR机的DNA结合染料协议制备数字PCR反应。使用以下特定于人类CD3环子基因组DNA的引物(NCBI参考序列:NG_007383.1);前进引物:AGGCTGCCATACTACAG,反向引物:GCCCTAGCTGGGAAAC。这些引基器将产生105 bp的单波段。
   注:在消化基因组DNA的每个反应中加入0.5 μL的限制性酶,如HindIII。请务必测试不同的gDNA稀释,以优化正负液滴的分离。此外,渗透T细胞的子集可能是非致病性调节性T细胞。这些细胞可以使用额外的引物来定量调节性T细胞标记。
2. 在以下条件下进行数字PCR反应:在105°C下盖,95°C10分钟(1个循环);95 °C 30 秒,斜坡 2 °C/s 和 55 °C 1 分钟,斜坡 2 °C/s (40 个周期);72 °C 10 分钟,12°C 保持。
   注:这些参数可能需要根据数字 PCR 设备进行调整。
3. 使用分析软件获取数字 PCR 数据。使用以下公式报告每毫克组织的副本数:(拷贝数/μL) x (反应中的 gDNA μL) x(稀释因子)/(组织/μL 的总 gDNA 毫克)

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结果

接受人类PBMC的8-12周大NSG小鼠在注射后第10天左右开始出现GVHD的临床症状,而只接受PBS的阴性对照小鼠则开始出现GVHD的临床症状(图1A)。XenoGVHD小鼠的中位存活期为23.5天(图1B)。使用数字PCR,CD3 epsilon阳性人类T细胞可以在接受人类PBMC的小鼠的肺和肝脏样本中检测到。注射PBS的小鼠的组织样本被用作对照组(图2)。

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讨论

在 xenoGVHD 模型中,疾病进展通常是一致的,即使从不同的捐赠者注射 PBMC,因此可以组合多个实验。保持这种一致性所需的关键步骤是适当的 i.v. 注射技术、致盲和一致的评分。Nervi^等人25日的研究表明,与静脉注射尾静脉注射相比,PBMC的逆轨注射可产生更一致的移植和更严重的GVHD。Leon-Rico^等人26日还表明,与尾静脉注射相比,逆转轨道注射在小鼠体内的造血干细胞移植?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optional
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Provided by animal facility
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Provided by animal facility
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgial Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4