Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e segnare la malattia in un modello di malattia xenogeneica innesto contro ospite (xenoGVHD). xenoGVHD fornisce un modello in vivo per studiare l'immunosoppressione delle cellule T umane. Inoltre, descriviamo come rilevare le cellule T umane nei tessuti con la PCR digitale come strumento per quantificare l'immunosoppressione.

Abstract

La malattia acuta di innesto contro ospite (GVHD) è una limitazione significativa per i pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche come terapia per carenze ematologiche e neoplasie. Il GVHD acuto si verifica quando le cellule T donatrici riconoscono i tessuti ospiti come un antigene estraneo e montano una risposta immunitaria all'ospite. Gli attuali trattamenti riguardano farmaci immunosoppressori tossici che rendono i pazienti suscettibili di infezione e recidiva. Così, C'è ricerca in corso per fornire una terapia acuta GVHD che può efficacemente indirizzare le cellule T del donatore e ridurre gli effetti collaterali. Gran parte di questo lavoro pre-clinico utilizza il modello murino xenogeno GVHD (xenoGVHD) che consente di testare le terapie immunosoppressive sulle cellule umane piuttosto che murine cellule in un sistema in vivo. Questo protocollo descrive come indurre xenoGVHD e come accecare e standardizzare il punteggio clinico per garantire risultati coerenti. Inoltre, questo protocollo descrive come utilizzare la PCR digitale per rilevare le cellule T umane nei tessuti dei topi, che possono essere successivamente utilizzate per quantificare l'efficacia delle terapie testate. Il modello xenoGVHD non solo fornisce un modello per testare le terapie GVHD, ma qualsiasi terapia che può sopprimere le cellule T umane, che potrebbe quindi essere applicata a molte malattie infiammatorie.

Introduzione

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeniche (HSCT) è diventato un trattamento di routine per i pazienti affetti da neoplasie ematologiche come la leucemia con prognosi infausta. Una complicazione significativa dell'HSCT è la malattia acuta di innesto contro l'ospite (GVHD). Uno studio del 2012 ha riferito che il GVHD acuto si è sviluppato nel 39% dei pazienti con HSCT che hanno ricevuto trapianti da donatori fratelli e 59% dei pazienti sottoposti a trapianto da donatori non correlati¹. Il GVHD acuto si verifica quando le cellule T derivate dal donatore attaccano gli organi del destinatario. L'unica terapia di successo per gVHD è il trattamento con farmaci altamente immunosoppressivi², che sono altamente tossici e aumentano il rischio di infezione e recidiva del tumore. Così, nonostante i miglioramenti che sono stati fatti nella sopravvivenza acuta GVHD negli ultimi anni^3,4,5, c'è ancora una necessità critica per il miglioramento delle terapie GVHD con tossicità minima che promuovono la remissione a lungo termine.

L'obiettivo generale dei seguenti metodi è quello di indurre e segnare GVHD xenogeneico (xenoGVHD). Il modello xenoGVHD è stato sviluppato come strumento per indurre GVHD acuto con cellule umane piuttosto che cellule murine permettendo una traduzione più diretta della ricerca GVHD pre-clinica agli studi clinici⁶. Questo modello prevede l'iniezione per via endovenosa di cellule mononucleari del sangue periferiche umane (PBMC) in topi NOD-SCID IL-2R - null (NSG) irradiati sublethaldalmente. Le cellule T umane iniettate vengono attivate da cellule che presentano antigene umano (APC) che presentano l'antigene murno e le cellule T attivate migrano verso tessuti distanti con conseguente infiammazione sistemica e infine la morte^{6,7, 8} (IN vio ^{, 9} (in vie ^{, 10}. La patologia della malattia e la progressione nel modello xenoGVHD imitano strettamente il GVHD acuto umano. In particolare, le cellule T umane patogene sono reattive a murine principali proteine complesse di istocompatibilità (MHC), che è simile all'alloreattività delle cellule T nel GVHD umano^6,9. Il vantaggio principale del modello xenoGVHD rispetto al modello di mismatch MHC del mouse, l'altro modello GVHD ampiamente usato, è che consente di testare le terapie sulle cellule umane piuttosto che sulle cellule murine. Ciò consente di testare i prodotti che possono essere tradotti direttamente in clinica senza alcuna modifica perché sono fatti per indirizzare le cellule umane. Recentemente, questo modello è stato utilizzato per testare un anti-IL-2 umano¹¹, cellule T regolatorie umane (Tregs)¹² e cellule staminali mesenchymiche umane¹³ come potenziali trattamenti per la GVHD acuta. In un contesto più ampio, questo modello può essere utilizzato come un saggio di soppressione in vivo per qualsiasi farmaco o tipo di cellula che può sopprimere l'attività delle cellule T umane. Ad esempio, Stockis et al.¹⁴ hanno utilizzato il modello xenoGVHD per studiare l'effetto del blocco dell'attività soppressiva di Treg in vivo. Pertanto, il modello xenoGVHD può fornire informazioni sul meccanismo di qualsiasi terapia mirata alle cellule T in un ambiente in vivo.

Un ulteriore metodo descritto in questo protocollo è come rilevare le cellule T umane nei tessuti dei topi utilizzando la reazione a catena di polimerasi digitale (dPCR). L'obiettivo di questo metodo è quello di offrire uno strumento per quantificare la migrazione e la proliferazione delle cellule T nei tessuti bersaglio, che misurano l'efficacia delle terapie immunosoppressive testate in questo modello. dPCR è un metodo relativamente nuovo per la quantificazione degli acidi nucleici¹⁵. In breve, la miscela di reazione PCR è divisa in partizioni che contengono piccoli numeri della sequenza di destinazione o nessun bersaglio a tutti. La sequenza bersaglio viene quindi amplificata e rilevata utilizzando coloranti intercalari del DNA o sonde fluorescenti specifiche del bersaglio. dPCR quantifica il numero di copie della sequenza di destinazione in base alla frazione di partizioni positive e alle statistiche di Poisson^15,16. Il rilevamento delle cellule T con dPCR richiede molto meno tessuto rispetto ad altri metodi alternativi, tra cui citometria di flusso e istologia, e può essere eseguito su tessuto congelato o fisso. dPCR non richiede una curva standard per determinare i numeri di copia, né sono necessarie repliche tecniche. In questo modo si riduce la quantità di DNA di reagente e modello necessaria per il dPCR rispetto al tradizionale PCR quantitativo (qPCR)¹⁶. Partizionare la reazione PCR in sottoreazioni in dPCR concentra efficacemente gli obiettivi¹⁷. Pertanto, dPCR è principalmente uno strumento per il rilevamento di bersagli rari in una grande quantità di DNA non bersaglio. Ad esempio, dPCR viene utilizzato per rilevare la contaminazione batterica nel latte¹⁸, identificare rare mutazioni nel gene del recettore degli estrogeni¹⁹e rilevare il DNA tumorale circolante nel sangue dei pazienti²⁰. In questo protocollo, dPCR funge da strumento efficiente per rilevare e quantificare le cellule T umane nei tessuti di topi con xenoGVHD.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti in conformità, e con l'approvazione dell'University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Tutti i campioni di sangue umano sano sono stati ottenuti sotto il consenso informato e con l'approvazione da parte dell'Institutional Review Board presso l'Università del Kansas Medical Center.

1. Irradiazione di topi NSG

1. Un giorno prima dell'iniezione DI PBMC, irradiano vecchi topi NSG da 8 a 12 settimane (entrambi i sessi possono essere usati). In un armadio sterile di biosicurezza, posizionare i topi in una gabbia sterilizzata o in un microisolatore. irradiare topi in una fonte di Cs¹³⁷ o in un piccolo irradiatore animale (ad esempio, RS 2000) con una dose totale di 150 cGy con rotazione lenta per garantire anche l'irradiazione.
2. Mettere i topi in gabbie pulite in un armadio sterile di biosicurezza.

2. Preparazione del PBMC umano per l'iniezione

1. Raccogliere abbastanza sangue umano sano da isolare 1,1 x 10⁷ PBMC per topo. Diluire il sangue eparanato in un volume uguale del 2% di siero bovino fetale (FBS) in fosfato bufferizzato salina (PBS).
   NOTA: Con questo protocollo, la resa del PMBC è generalmente 0,5–1 x 10⁷ per 10 mL di sangue intero. Ogni mouse riceverà 10⁷ PBMC in 100 , l'l di PBS. L'extra 1 x 10⁶ su 10 l per mouse assicura che ogni mouse riceva l'intero dosaggio di PBMC, in caso di problemi con il riempimento delle siringhe.
2. Aggiungere 15 mL di densità di separazione dei linfociti media per il gradiente medio (ad esempio, Ficoll) a un tubo conico da 50 mL, quindi sovrapporre con cura fino a 25 mL di sangue diluito sopra il gradiente di densità. Centrifugare il tubo contenente gradiente di densità e sangue diluito a 400 x g per 40 min a temperatura ambiente senza freno.
3. Raccogliere l'interfaccia PBMC in 10 mL di PBS in un tubo conico da 50 mL. Centrifugare le cellule a 400 x g per 10 min. Rimuovere il supernatante.
4. Allenta il pellet sfogliando il tubo e risospende nuovamente in PBS da 10 mL per lavare il PBMC. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min.
5. (Facoltativo) Eliminare il globulo rosso (RBC) supernatante e liscile nel pellet cellulare aggiungendo un volume di buffer di lisi di ammonio-cchiuro-potassio (ACK) che è uguale al volume di pellet. Risospendere delicatamente il pellet e ruotare il tubo per 30-60 s. Tubo di riempimento con supporti RPMI senza sè e centrificare il tubo a 400 x g per 5 min.
6. Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 5 mL di PBS. Contare le cellule usando l'esclusione blu trypan con un emocitometro e un microscopio.
7. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e rimettere in sospensione le cellule a 1 x 10⁸ cellule / mL in PBS.

3. Iniezione retroorbitale di PBMC umano nei topi²¹

1. Mettere una camera di anestesia in un cappuccio a flusso laminare per mantenere la sterilità. Pre-carica della camera di anestesia con 5% di isoflurane e 1 l/min di flusso di ossigeno per 5 min.
2. Ridurre l'isoflurane al 2% e mettere i topi dalla stessa gabbia nella camera di anestesia. Una volta che i topi perdono il rinfarto, anestesizzano i topi per 5 min in camera. Durante questo periodo, pre-riempire la siringa con 100 (1 x 10⁷ celle) di sospensione cellulare.
3. Posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento con il naso in un cono naso per mantenere l'anestesia. Controllare la perdita di coscienza pizzicando una pedana e controllando la mancanza di riflesso.
4. Restringere il mouse con il pollice e il dito medio. Inserire il 28 G 1/2 nell'ago con la smussata laterale al canto mediale, attraverso la membrana congiuntivale fino a raggiungere la parte posteriore dell'occhio. Ritrarre leggermente l'ago e iniettare lentamente 100 .L di cellule (1 x 10⁷ cellule).
5. Ritrarre completamente l'ago e smaltire correttamente la siringa e l'ago. Chiudere la palpebra e applicare una leggera pressione al sito di iniezione con una spugna di garza.
6. Esaminare il sito di iniezione per il gonfiore o altri traumi visibili. Permettere al topo di riprendere coscienza in una gabbia sterile rivestita con asciugamani di carta per evitare l'aspirazione di biancheria da letto prima di trasferirsi in gabbia di casa. Dopo che qualsiasi sanguinamento si è fermato, applicare una singola goccia di proparacaina all'occhio per l'analgesia.
   NOTA: L'iniezione di vena tail è un metodo alternativo di iniezione endovenosa di PBMC per questo protocollo come descritto da Macholz et al.²².

4. Punteggio clinico del GVHD acuto nei topi (Figura 1)²³

1. Misurare il punteggio GVHD a giorni alterni fino a quando i topi raggiungono un punteggio di un 2 e poi ogni giorno fino al giorno di sacrificio.
   1. Mettere la gabbia in un cappuccio laminare, rimuovere il cibo e l'acqua e rimettere il coperchio. L'attività del punteggio osservando i mouse per 5 minuti e assegnare i punteggi come segue: 0 - il mouse inizia a camminare entro un paio di minuti e continua a camminare intorno alla gabbia, 1 mouse prende più di un paio di minuti per alzarsi e cammina lentamente intorno gabbia, 2 - il mouse non si alza in 5 min e cammina solo quando toccato.
2. Pesare ogni mouse in un becher di vetro e dare un punteggio di perdita di peso: 0 - <10% di cambiamento, 1 - 10-25% cambiamento e 2 > 25% cambiamento.
3. Mentre il topo è ancora nel becher, ispezionare per la postura: 0 - normale, 1 - curvo a riposo, 2 - curvo altera il movimento; texture di pelliccia: 0 - normale, 1 - da lieve a moderata ruffling, 2 - ruffling grave, e l'integrità della pelle : 0 - normale, 1 spuntato delle zampe / coda, 2 - aree evidenti di pelle denudata (guarda orecchie, coda e zampe per il ridimensionamento).
4. Con cinque categorie e un punteggio di 0–2 per ogni categoria, un mouse può raggiungere un punteggio massimo di 10. Quando un topo raggiunge un punteggio di 7 o superiore o raggiunge 42 giorni dopo l'iniezione, eutanasia topo tramite eutanasia CO₂ o altro metodo approvato dal Comitato locale per la cura e l'uso degli animali.
   NOTA: Per garantire l'accuratezza dei risultati, il punteggio viene eseguito da un ricercatore che è accecato ai gruppi di trattamento²⁴. Inoltre, anche se >20% della perdita di peso corporeo è l'endpoint umano raccomandato per molti protocolli IACUC, con ulteriore giustificazione iACUC approvazione di questo protocollo può essere ottenuto.

5. Raccolta di tessuti per il DNA genomico da topi eutanasia e isolare il DNA genomico

1. I topi dissetati che utilizzano strumenti chirurgici sterili. Tagliare un piccolo pezzo di tessuto di circa 3 mm x 0,5 mm di dimensione da un organo di interesse, ad esempio, polmone, fegato o milza. Pesare il campione di tessuto e posizionare il pezzo di tessuto in un tubo sterile da 1,5 mL. Se si raccolgono più tessuti, lavare gli utensili con etanolo tra il taglio di ogni organo.
2. Congelare i tessuti immergendo i tubi contenenti il tessuto in azoto liquido fino a quando non smette di ribollire e conservare in -80 gradi durante la notte. Scongelare i campioni di tessuto e liverli secondo un kit di isolamento del DNA genomico (gDNA).
3. Isolare il DNA genomico secondo le istruzioni del produttore come descritto nel kit. Assicurarsi di notare la quantità di tessuto che è stato elaborato per microlitro di gDNA eluito (mg/L).
   NOTA: I tessuti congelati possono essere conservati a -80 gradi centigradi per l'elaborazione in un secondo momento.

6. Quantificazione delle cellule T umane utilizzando PCR digitale (Figura 2)

1. Preparare le reazioni PCR digitali secondo il protocollo per i coloranti di legame del DNA per la macchina PCR digitale in uso. Utilizzare i seguenti primer specifici per il DNA genomico dell'epsilon CD3 umano (NCBI Reference Sequence: NG_007383.1); Primer in avanti: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, Inverti primer: GCCCTACCAGCTGGGGAAAC. Questi primer produrranno una singola banda di 105 bp.
   NOTA: Aggiungere 0,5 l di un enzima di restrizione, come HindIII, ad ogni reazione per digerire il DNA genomico. Assicurarsi di testare diverse diluizioni gDNA per ottimizzare la separazione delle goccioline positive e negative. Inoltre, un sottoinsieme di cellule T infiltranti può essere cellule T regolatorie non patogene. Queste cellule possono essere quantificate utilizzando primer aggiuntivi per marcatori di cellule T regolatori.
2. Eseguire la reazione PCR digitale nelle seguenti condizioni: Coperchio a 105 gradi centigradi, 95 gradi centigradi per 10 min (1 ciclo); 95 s per 30 s, rampa 2 C/s e 55 gradi c per 1 min, rampa 2 C /s (40 cicli); 72 gradi centigradi per 10 min, 12 gradi centigradi.
   NOTA: potrebbe essere necessario regolare questi parametri in base alle apparecchiature PCR digitali.
3. Acquisire dati PCR digitali con software di analisi. Riportare i dati come numero di copie per mg di tessuto utilizzando la seguente equazione: (numero di copie/l) x (L di gDNA in reazione) x (fattore di diluizione)/(mg del tessuto/l del gDNA totale)

Risultati

I vecchi topi NSG da 8-12 settimane irradiati sottolethaltale di entrambi i sessi che hanno ricevuto il PBMC umano hanno iniziato a mostrare segni clinici di GVHD intorno al giorno 10 dopo l'iniezione rispetto ai topi di controllo negativi che ricevevano solo PBS (Figura 1A). Mouse XenoGVHD ha avuto una sopravvivenza mediana di 23,5 giorni (Figura 1B). Con la PCR digitale, le cellule T umane positive dell'epsilon CD3 potrebbero e...

Discussione

La progressione della malattia è generalmente coerente nel modello xenoGVHD, anche con l'iniezione di PBMC da donatori diversi, in modo da poter combinare più esperimenti. I passaggi chiave necessari per mantenere questa coerenza sono la tecnica di iniezione i.v. corretta, il punteggio accecante e coerente. Uno studio di Nervi et al.²⁵ ha dimostrato che rispetto all'iniezione di vena della coda per via endovenosa, le iniezioni retroorbitali di PBMC hanno provocato un innesto più coerente e un G...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optional
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Provided by animal facility
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Provided by animal facility
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgial Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4