디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

요약

여기서, 우리는 xenogeneic 이식편 대 숙주 질환(xenoGVHD) 모델에서 질병을 유도하고 점수를 매기는 프로토콜을 제시한다. xenoGVHD는 인간 T 세포의 면역 억제를 연구하는 생체 내 모델을 제공한다. 추가적으로, 우리는 면역 억제를 정량화하는 공구로 디지털 PCR를 가진 조직에서 인간 적인 T 세포를 검출하는 방법을 기술합니다.

초록

급성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)은 혈액학적 결핍 및 악성 종양에 대한 치료로서 조혈 줄기 세포 이식을 받는 환자에게 상당한 제한이다. 급성 GVHD는 공여자 T 세포가 외국 항원으로 숙주 조직을 인식하고 숙주에게 면역 반응을 장착할 때 발생한다. 현재 처리는 감염과 재발에 영향을 받기 쉬운 환자를 렌더링하는 유독한 면역 억제 약을 관련시킵니다. 따라서, 기증자 T 세포를 효과적으로 표적으로 하고 부작용을 감소시킬 수 있는 급성 GVHD 치료를 제공하기 위한 연구가 진행 중이다. 이 전 임상 작업의 대부분은 생체 내 시스템에서 뮤린 세포보다는 인간 세포에 면역 억제 요법의 테스트를 허용 하는 xenogenic GVHD (xenoGVHD) 뮤린 모델을 사용 합니다. 이 프로토콜은 xenoGVHD를 유도하는 방법과 일관된 결과를 보장하기 위해 임상 점수를 장님과 표준화하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 마우스 조직에 있는 인간 적인 T 세포를 검출하기 위하여 디지털 PCR를 사용하는 방법을 기술합니다, 이후에 시험된 치료의 효험을 정량화하기 위하여 이용될 수 있는. xenoGVHD 모델은 GVHD 요법을 테스트하는 모델뿐만 아니라 인간 T 세포를 억제 할 수있는 모든 치료법을 제공하며, 이는 많은 염증성 질환에 적용 될 수 있습니다.

서문

동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 가난한 예후를 가진 백혈병과 같은 혈액학적 악성 종양으로 고통받는 환자를 위한 일상적인 처리가 되었습니다. HSCT의 중요한 합병증은 급성 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)입니다. 2012년의 한 연구에서는 급성 GVHD가 형제 기증자로부터 이식을 받는 HSCT 환자의 39%와 관련없는기증자로부터 이식을 받는 환자의 59%에서 개발되었다고 보고했습니다 1. 급성 GVHD는 기증자 유래 T 세포가 수령인의 장기를 공격할 때 발생합니다. GVHD에 대한 유일한 성공적인 치료법은 매우 독성이 높고 감염 및 종양 재발의 위험을 증가시키는 고면역 억제 제²로 치료하는 것입니다. 따라서, 최근 몇 년 동안 급성 GVHD 생존에서 이루어진 개선에도 불구하고 3,^4,5,장기 완화를 촉진하는 최소한의 독성으로 개선된 GVHD 요법에 대한 중요한 필요성이 여전히 존재한다.

다음 방법의 전반적인 목표는 xenogeneic GVHD (xenoGVHD)를 유도하고 점수를 매기는 것입니다. xenoGVHD 모델은 임상 시험 6에 전임상 GVHD 연구를 보다 직접적으로 번역할 수 있도록 뮤린 세포가아닌 인간 세포로 급성 GVHD를 유도하는 도구로 개발되었다. 이 모형은 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 SUBlethally 조사되는 NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) 마우스로 주입하는 것을 관련시킵니다. 주입된 인간 T 세포는 인간 항원 제시 세포(APC)에 의해 활성화되어 뮤린 항원과 활성화된 T세포가 전신 염증을 초래하고 궁극적으로 사망하는 먼 조직으로 이동한다 6,^{7, 8개 , 9개 , 10}. xenoGVHD 모델의 질병 병리학 및 진행은 인간의 급성 GVHD를 밀접하게 모방합니다. 구체적으로, 병원성 인간 T 세포는 인간 GVHD^6,9에서T 세포 동모활성과 유사한 뮤린 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질에 반응한다. 마우스 MHC 불일치 모델, 다른 널리 사용되는 GVHD 모델에 비해 xenoGVHD 모델의 주요 장점은, 뮤린 세포보다는 인간 세포에 대한 치료법의 테스트를 허용한다. 이것은 인간 세포를 표적으로 하기 위하여 만들어지기 때문에 어떤 수정도 없이 진료소에 직접 번역될 수 있는 제품의 시험을 허용합니다. 최근, 이 모델은 급성 GVHD에 대한 잠재적 치료제로서 인간 항-IL-2^항체(11),인간 흉선 조절 T 세포(Tregs)¹² 및 인간 중간엽 줄기세포(13)를 시험하는데 사용되고 있다. 더 넓은 맥락에서, 이 모델은 인간 T 세포 활성을 억제할 수 있는 임의의 약물 또는 세포 유형에 대한 생체내 억제 분석법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Stockis et al.^14는 xenoGVHD 모델을 사용하여 생체 내 트레그 억제 활성에 대한 인테그린 αVβ8 차단 효과를 연구하였다. 따라서, xenoGVHD 모델은 생체 내 설정에서 T 세포를 표적화하는 임의의 치료의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

이 프로토콜에 기재된 추가방법은 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR)을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포를 검출하는 방법이다. 이 방법의 목표는 표적 조직에서 T 세포의 이동 및 증식을 정량화하는 도구를 제공하는 것이며, 이는 이 모델에서 시험되는 면역 억제 요법의 효능을 측정하는 것입니다. dPCR은 핵산(15)의 정량화를위한 비교적 새로운 방법이다. 간단히, PCR 반응 혼합물은 타겟 서열의 작은 숫자를 포함하는 파티션으로 분할또는 전혀 타겟이 없다. 표적 서열은 DNA 인터컬레이터 염료 또는 형광 표적 특이적 프로브를 사용하여 증폭및 검출된다. dPCR은 양극분할및 푸아송통계의 분수에 기초하여 대상 시퀀스의 사본 수를 정량화한다^15,16. dPCR로 T 세포를 검출하는 것은 유세포 분석 및 조직학을 포함하여 다른 대체 방법에 비해 훨씬 적은 조직을 필요로 하며, 동결 또는 고정 된 조직에서 수행 될 수있다. dPCR은 복사 번호를 결정하기 위해 표준 곡선이 필요하지 않으며 기술 복제가 필요하지 않습니다. 이는 기존의 정량적 PCR(qPCR)^16에비해 dPCR에 필요한 시약 및 템플릿 DNA의 양을 감소시킨다. PCR 반응을 dPCR에서 하위 반응으로 분할하는 것은 효과적으로 타겟^17을집중시다. 따라서, dPCR은 주로 다량의 비표적 DNA에서 희귀 표적을 검출하기 위한 도구이다. 예를 들어, dPCR은^{우유(18)에서}세균 오염을 검출하고, 에스트로겐 수용체 유전자(19)에서 드문 돌연변이를 식별하고, 환자의 혈액에서 순환 종양 DNA를 검출하는 데 사용된다(20). 이 프로토콜에서, dPCR은 xenoGVHD를 가진 마우스의 조직에서 인간 T 세포를 검출하고 정량화하기 위한 효율적인 도구역할을 한다.

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프로토콜

모든 마우스 실험은 캔자스 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 거쳐 준수하고 승인을 받아 수행되었습니다. 모든 건강한 인간 혈액 샘플은 캔자스 대학 의료 센터의 기관 검토 위원회의 승인을 받고 정보에 입각한 동의하에 얻어졌습니다.

1. NSG 마우스의 조사

1. PBMC 주입 하루 전에, 조사 8-12 주 오래 된 NSG 마우스 (어느 섹스 사용할 수 있습니다). 멸균 된 생체 안전 성 캐비닛에 살균 된 파이 케이지 또는 마이크로 이졸레이터에 마우스를 놓습니다. Cs¹³⁷ 소스 또는 작은 동물 조사기(예를 들어, RS 2000)에서 마우스를 조사하여 총 투여량 150 cGy의 느린 회전으로 균등한 조사를 보장한다.
2. 멸균 된 생체 안전 캐비닛에 깨끗한 케이지에 마우스를 놓습니다.

2. 주입을 위한 인간 PBMC의 준비

1. 마우스 당 1.1 x 10⁷ PBMC를 분리하기에 충분한 건강한 인간의 혈액을 수집합니다. 헤파린화된 혈액을 인산완충식염수(PBS)에서 2% 태아 소 혈청(FBS)의 동일한 부피로 희석합니다.
   참고:이 프로토콜을 사용하면 PMBC 수율은 일반적으로 전혈 의 10 mL 당 0.5-1 x 10 7입니다. 각 마우스는 PBS의 100 μL에서 10⁷ PBMC를 받게 됩니다. 마우스당 1x10⁶ in 10 μL을 추가하면 각 마우스가 주사기를 채우는 데 문제가 있을 경우 PBMC의 전체 복용량을 받을 수 있습니다.
2. 50 mL 원엽 튜브에 15 mL 림프구 분리 밀도 그라데이션 배지 (예 : Ficoll)를 추가 한 다음 밀도 구배 위에 희석 된 혈액을 최대 25 mL까지 조심스럽게 오버레이하십시오. 제동없이 실온에서 40 분 동안 400 x g에서 밀도 그라데이션 및 희석 된 혈액을 포함하는 튜브를 원심 분리합니다.
3. PBMC 인터페이스를 50 mL 원추형 튜브에서 10 mL의 PBS로 수확합니다. 세포를 400 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
4. 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 풀고 10 mL PBS에서 다시 일시 중단하여 PBMC를 세척합니다. 세포를 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
5. (선택 사항) 암모늄-염화-칼륨(ACK) 용해 완충액을 추가하여 세포 펠릿에 상류층 및 용해 적혈구(RBC)를 폐기하고 펠릿 부피와 동일한 용해 완충액을 제거한다. 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하고 튜브를 30-60초 동안 소용돌이치면 30-60초 동안 튜브를 세럼프리 RPMI 로 채우고 튜브를 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
6. 상급체를 제거하고 PBS의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단시다. 혈세포계와 현미경으로 trypan 파란색 제외를 사용하여 세포를 계산합니다.
7. 세포를 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리. 상류세포를 제거하고 PBS에서 1 x 10^{8 셀} / mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.

3. 마우스에 인간 PBMC의 복고풍 궤도 주입²¹

1. 무균을 유지하기 위해 마취 챔버를 층류 후드에 놓습니다. 마취 챔버를 5 % 이소플루란 및 1 L / 분 산소 유량으로 5 분 동안 미리 충전하십시오.
2. 이소플루란을 2%로 줄이고 같은 케이지에서 생쥐를 마취실에 넣습니다. 일단 마우스가 오른쪽을 분실하면, 챔버에서 5 분 동안 마우스를 마취. 이 시간 동안, 세포 현탁액의 100 μL (1 x 10⁷ 세포)로 주사기를 미리 채웁니다.
3. 마취를 유지하기 위해 코콘에 코를 가진 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 발 패드를 꼬집고 반사 부족을 확인하여 의식 상실을 확인하십시오.
4. 엄지손가락과 가운데 손가락으로 마우스를 제지합니다. 28 G 1/2 바늘에 경사를 내측 캔티스로 측면으로 삽입하고, 눈 뒤쪽에 도달 할 때까지 결막을 통해 삽입하십시오. 바늘을 약간 후퇴시키고 천천히 100 μL의 세포 (1 x 10⁷ 세포)를 주입하십시오.
5. 바늘을 완전히 철회하고 주사기와 바늘을 적절하게 폐기하십시오. 눈꺼풀을 닫고 거즈 스폰지로 주사 부위에 가벼운 압력을 가합니다.
6. 붓기 또는 다른 눈에 보이는 외상에 대 한 주사 사이트를 검사. 홈 케이지로 이동하기 전에 침구의 열망을 방지하기 위해 종이 타월 줄 지어 멸균 케이지에서 의식을 회복 마우스를 할 수 있습니다. 출혈이 멈춘 후 진통을 위해 눈에 프로파라카인 한 방울을 바르고.
   참고: 꼬리 정맥 주사는 Macholz 외^22에의해 기술된 바와 같이 이 프로토콜을 위한 PBMC의 정맥 주입의 대체 방법이다.

4. 마우스에서 급성 GVHD의임상 점수 (그림 1)²³

1. GVHD 점수를 격일로 측정하여 마우스가 2점에 도달할 때까지 매일 그리고 희생의 날까지 매일 점수를 측정합니다.
   1. 케이지를 라미나 흐름 후드에 넣고 음식과 물을 제거하고 뚜껑을 다시 닫습니다. 5 분 동안 마우스를 관찰하고 다음과 같이 점수를 할당하여 점수를 점수 : 0 = 마우스는 몇 분 이내에 걷기 시작하고 케이지 주위를 걷기 시작하고, 1 = 마우스는 일어나서 케이지 주위에 천천히 걷는 데 몇 분 이상 걸립니다, 2 = 마우스는 일어나지 않습니다. 5 분 만 누르면 만져도 걸어야합니다.
2. 유리 비커에 각 마우스를 무게와 체중 감소 점수를 제공 : 0 = <10 % 변화, 1 = 10-25 % 변경 및 2 = >25 % 변경.
3. 마우스가 여전히 비커에 있는 동안 자세를검사합니다: 0 = 정상, 1 = 나머지에서 굽기, 2 = 직함 운동이 손상됩니다. 모피 질감: 0 = 정상, 1 = 중간 주름에 온화한, 2 = 심한 주름, 피부 무결성 : 0 = 정상, 발 / 꼬리의 1 = 스케일링, 2 = 누드 피부의 명백한 영역 (스케일링을위한 귀, 꼬리 및 발을 보십시오).
4. 다섯 가지 범주와 각 카테고리에 대해 0-2의 점수로 마우스는 최대 점수 10에 도달할 수 있습니다. 마우스가 7점 이상에 도달하거나 42일 주사 후 도달하면, CO2 안락사 또는 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 다른 방법을 통해 마우스를 안락사시한다.
   참고 : 결과의 정확성을 보장하기 위해, 점수는 치료 그룹^24에눈을 멀게 한 연구원에 의해 수행됩니다. 추가적으로, 비록 >20% 체중 감소의 많은 IACUC 프로토콜에 대 한 권장된 인간적인 종점, 이 프로토콜의 추가 정당화 IACUC 승인을 얻을 수 있다.

5. 안락사 된 마우스에서 게놈 DNA를위한 조직을 수확하고 게놈 DNA를 분리

1. 멸균 수술 도구를 사용하여 마우스를 해부하십시오. 관심있는 기관(예: 폐, 간 또는 비장)에서 약 3 mm x 0.5 mm 크기의 작은 조직을 잘라냅니다. 조직 샘플을 계량하고 조직 조각을 멸균 된 1.5 mL 튜브에 놓습니다. 여러 조직을 수집하는 경우, 각 장기를 절단 사이에 에탄올로 도구를 씻어.
2. 액체 질소에 조직을 포함하는 튜브를 침수하여 조직을 동결하여 버블링을 멈추고 하룻밤 -80°C에 보관합니다. 조직 샘플을 해동하고 게놈 DNA (gDNA) 격리 키트에 따라 그들을 용해.
3. 키트에 기재된 바와 같이 제조업체의 지침에 따라 게놈 DNA를 분리합니다. 용출 된 gDNA (mg / μL)의 마이크로 리터 당 처리 된 조직의 양을 주의하십시오.
   참고 : 냉동 조직은 나중에 처리를 위해 -80 °C에서 보관 할 수 있습니다.

6. 디지털 PCR을 사용하여 인간 T세포의 정량화 (그림 2)

1. 사용되는 디지털 PCR 기계에 대한 DNA 결합 염료에 대한 프로토콜에 따라 디지털 PCR 반응을 준비한다. 인간 CD3 엡실론 게놈 DNA에 특이적인 다음 프라이머를 사용하소서(NCBI 기준 서열: NG_007383.1); 포워드 프라이머: AGGCTGCCTAACTCCCAAG, 역프라이머: GCCCTACCAGCTGTGGAAC. 이 프라이머는 105 bp의 단일 대역을 생성합니다.
   참고: 게놈 DNA를 소화하기 위해 각 반응에 HindIII와 같은 제한 효소의 0.5 μL을 추가합니다. 양성 및 음성 방울의 분리를 최적화하기 위해 다른 gDNA 희석을 테스트해야합니다. 부가적으로, 침투하는 T 세포의 서브세트는 비병원성 조절 T 세포일 수 있다. 이들 세포는 조절 T 세포 마커에 대한 추가 프라이머를 사용하여 정량화될 수 있다.
2. 다음과 같은 조건하에서 디지털 PCR 반응을 수행한다: 105°C에서 뚜껑, 10분 동안 95°C(1사이클); 30초의 경우 95°C, 경사로 2°C/s 및 1분 동안 55°C, 램프 2°C/s(40사이클); 72°C에서 10분, 12°C 를 유지한다.
   참고: 이러한 매개 변수는 디지털 PCR 장비에 따라 조정해야 할 수 있습니다.
3. 분석 소프트웨어로 디지털 PCR 데이터를 수집합니다. 다음 방정식을 사용하여 조직의 mg당 사본 수로 데이터를 보고합니다: (반응시 gDNA의 μL) x (희석 인자)/(총 gDNA의 조직/μL mg)

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결과

인간 PBMC를 받은 남녀 모두의 8-12주 령 NSG 마우스를 치명적으로 조사한 결과, PBS만을 받은 음성 대조군 마우스에비해 10일 전후의 GVHD의 임상 적 징후를 보이기 시작했다(도 1A). XenoGVHD 마우스는 23.5 일의중간 생존을 가졌다 (도 1B). 디지털 PCR을 사용하면, CD3 엡실론 양성 인간 T 세포는 인간 PBMC를 수신한 마우스의 폐 및 간 샘플에?...

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토론

질병 진행은 일반적으로 xenoGVHD 모델에서 일관적이며, 다른 공여자로부터 PBMC를 주사하더라도, 그래서 여러 실험을 결합할 수 있다. 이러한 일관성을 유지하는 데 필요한 주요 단계는 적절한 즉 주입 기술, 눈가리개 및 일관된 점수입니다. Nervi 등^25에 의한 연구는 정맥 꼬리 정맥 주사에 비해, PBMC의 복고풍 궤도 주사가 더 일관된 생착과 더 심한 GVHD 귀착되었다는 것을 보여주었습...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optional
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Provided by animal facility
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Provided by animal facility
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgial Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4