Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

Resumo

A doença aguda do enxerto contra o hospedeiro (DECH) é uma limitação significativa para pacientes que recebem transplante de células-tronco hematopoiéticas como terapia para deficiências hematológicas e malignidades. A DECH aguda ocorre quando as células T do doador reconhecem os tecidos hospedeiros como um antígeno estrangeiro e montam uma resposta imune ao hospedeiro. Os tratamentos atuais envolvem drogas imunossupressoras tóxicas que tornam os pacientes suscetíveis à infecção e recorrência. Assim, há uma pesquisa contínua para fornecer uma terapia aguda de GVHD que possa eficazmente alvejar pilhas de T do doador e reduzir efeitos laterais. Muito deste trabalho pré-clínico usa o modelo murino xenogênico GVHD (xenoGVHD) que permite o teste de terapias imunossupressoras em células humanas em vez de células murinas em um sistema in vivo. Este protocolo descreve como induzir xenoGVHD e como cego e padronizar a pontuação clínica para garantir resultados consistentes. Adicionalmente, este protocolo descreve como usar o PCR digital para detectar pilhas de T humanas em tecidos do rato, que podem subseqüentemente ser usados para quantificar a eficácia de terapias testadas. O modelo de xenoGVHD fornece não somente um modelo para testar terapias de GVHD mas toda a terapia que pode suprimir pilhas de T humanas, que poderiam então ser aplicadas a muitas doenças inflamatórios.

Introdução

A transplantação hematopoietic allogeneic da pilha de haste (HSCT) transformou-se tratamento rotineiro para os pacientes que sofrem das malignidades hematológicas tais como a leucemia com prognóstico pobre. Uma complicação significativa do TCTH é A doença aguda do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Um estudo 2012 relatou que a DECH aguda se desenvolveu em 39% dos pacientes com TCTH recebendo transplantes de doadores irmãos e 59% dos pacientes que receberam transplantes de doadores não relacionados¹. A DECH aguda ocorre quando as células T derivadas de doadores atacam os órgãos do receptor. A única terapia bem-sucedida para a DECH é o tratamento com drogas altamente imunossupressoras², que são altamente tóxicos e aumentam o risco de infecção e recorrência tumoral. Assim, apesar das melhorias que foram feitas na sobrevivência aguda do GVHD nos últimos anos^3,4,⁵, há ainda uma necessidade crítica para terapias melhoradas do GVHD com toxicidade mínima que promovem a remissão a longo prazo.

O objetivo geral dos seguintes métodos é induzir e marcar GVHD xenogénica (xenogvhd). O modelo de xenoGVHD foi desenvolvido como uma ferramenta para induzir a DECH aguda com células humanas, em vez de células murinas, permitindo a tradução mais direta da pesquisa pré-clínica de GVHD para ensaios clínicos⁶. Este modelo envolve intravenosamente injetar células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) em camundongos Nod-scid Il-2rγnull (NSG) que são irradiados células. As células t humanas injetadas são ativadas por células apresentadoras de antígeno humano (APCs) apresentando antígeno murino e as células t ativadas migram para tecidos distantes, resultando em inflamação sistêmica e, finalmente^, morte^6,7, ⁸ . º ^{, 9} anos de ^{, 10}. patologia da doença e progressão no modelo xenoGVHD imitar de perto a GVHD aguda humana. Especificamente, as células t humanas patogênicas são reativas às proteínas do complexo de histocompatibilidade Major murino (MHC), que é semelhante à aloreatividade da célula t na GVHD humana^6,9. A principal vantagem do modelo xenoGVHD sobre o modelo de incompatibilidade de MHC do mouse, o outro modelo de GVHD amplamente utilizado, é que permite o teste de terapias em células humanas, em vez de células murinas. Isto permite o teste dos produtos que podem diretamente ser traduzidos à clínica sem nenhumas modificações porque são feitos para alvejar pilhas humanas. Recentemente, este modelo foi usado para testar um anticorpo humano de anti-Il-2¹¹, pilhas de T reguladoras Thymic humanas (tregs)¹² e pilhas de haste mesenquimais humanas¹³ como tratamentos potenciais para o GVHD agudo. Em um contexto mais largo, este modelo pode ser usado como um ensaio in vivo da supressão para todo o tipo da droga ou da pilha que possa suprimir a atividade humana da pilha de T. Por exemplo, Stockis et al.¹⁴ utilizaram o modelo de xenoGVHD para estudar o efeito do bloqueio da integrina αVβ8 na atividade supressora de TREG in vivo. Assim, o modelo de xenoGVHD pode fornecer a introspecção no mecanismo de toda a terapia que alvejam pilhas de T em um ajuste in vivo.

Um método adicional descrito neste protocolo é como detectar pilhas de T humanas em tecidos do rato usando a reacção em cadeia digital do polymerase (dPCR). O objetivo deste método é oferecer uma ferramenta para quantificar a migração e proliferação de células T em tecidos-alvo, que medem a eficácia das terapias imunossupressoras sendo testadas neste modelo. a dPCR é um método relativamente novo para quantificação de ácidos nucleicos¹⁵. Momentaneamente, a mistura da reação do PCR é dividida nas divisórias que contêm números pequenos da seqüência do alvo ou do nenhum alvo de todo. A sequência alvo é então amplificada e detectada usando corantes de intercalação de DNA ou sondas fluorescentes específicas do alvo. o dpcr quantifica o número de cópias da sequência de alvos com base na fração de partições positivas e nas estatísticas de Poisson^15,16. A detecção de células T com dPCR requer muito menos tecido em comparação com outros métodos alternativos, incluindo citometria de fluxo e histologia, podendo ser realizada em tecido congelado ou fixo. dPCR não requer uma curva padrão para determinar os números de cópia, nem são réplicas técnicas necessárias. Isto reduz a quantidade de reagente e o ADN do molde necessários para dPCR comparado ao PCR quantitativo tradicional (qPCR)¹⁶. Particionar a reação de PCR em subreações na dPCR concentra efetivamente alvos¹⁷. Assim, o dPCR é primeiramente uma ferramenta para a deteção de alvos raros em uma grande quantidade de ADN do não-alvo. Por exemplo, o dPCR está sendo usado para detectar a contaminação bacteriana no leite¹⁸, identificar mutações raras no gene¹⁹do receptor do estrogen, e detectar o ADN de circulação do tumor no sangue dos pacientes²⁰. Neste protocolo, o dPCR sere como uma ferramenta eficiente para detectar e quantificar pilhas de T humanas nos tecidos dos ratos com xenoGVHD.

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Protocolo

Todos os experimentos de mouse foram realizados em conformidade, e com a aprovação da Universidade de Kansas Medical Center institucional cuidados com animais e Comitê de uso. Todas as amostras de sangue humano saudáveis foram obtidas consentimento informado e com aprovação do Conselho de revisão institucional do centro médico da Universidade de Kansas.

1. irradiação de camundongos NSG

1. Um dia antes da injeção de PBMC, irradiar camundongos NSG antigos de 8 – 12 semanas (qualquer sexo pode ser usado). Em um gabinete de biossegurança estéril, coloque camundongos em uma gaiola de torta esterilizada ou microisolador. Irradiar camundongos em um cs¹³⁷ fonte ou pequeno animal irradiador (por exemplo, RS 2000) com uma dose total de 150 cgy com rotação lenta para garantir até mesmo a irradiação.
2. Coloc ratos em gaiolas limpas em um armário estéril da Biossegurança.

2. preparação de PBMC humano para injecção

1. Colete sangue humano saudável suficiente para isolar 1,1 x 10⁷ PBMC por mouse. Diluir o sangue heparinizado em um volume igual de soro bovino fetal a 2% (FBS) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
   Nota: com este protocolo, o rendimento de PMBC é geralmente 0,5 – 1 x 10⁷ por 10 ml de sangue total. Cada rato receberá 10⁷ PBMC em 100 ΜL de PBS. O extra 1 x 10⁶ em 10 μL por o rato assegura-se de que cada rato receba a dosagem cheia de PBMC, se há quaisquer edições com seringas de enchimento.
2. Adicione um meio de gradiente de densidade de separação de linfócitos de 15 mL (por exemplo, Ficoll) a um tubo cônico de 50 mL e, em seguida, sobreponha cuidadosamente até 25 mL de sangue diluído em cima do gradiente de densidade. Centrifugue o tubo contendo gradiente de densidade e sangue diluído a 400 x g por 40 min à temperatura ambiente sem freio.
3. Colha a interface PBMC em 10 mL de PBS em um tubo cônico de 50 mL. Centrifugue as células a 400 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante.
4. Afrouxe a pelota sacudendo o tubo e ressuscitá-lo em 10 mL de PBS para lavar o PBMC. Centrifugue as células a 400 x g durante 5 min.
5. Opcional Descarte o sobrenadante e lyse glóbulos vermelhos (RBCs) na pelota da pilha adicionando um volume de tampão do lysis do amônia-cloreto-potássio (ACK) que é igual ao volume da pelota. Ressuscite suavemente o pellet e gire o tubo por 30 – 60 s. Encha o tubo com a mídia RPMI sem soro e Centrifugue o tubo em 400 x g por 5 min.
6. Retire o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 5 mL de PBS. Contar as células usando Tripan exclusão azul com um hemocitômetro e um microscópio.
7. Centrifugue as células a 400 x g durante 5 min. Retire o sobrenadante e reressuscitem as células a 1 x 10⁸ células/ml em PBS.

3. retro-injeção orbital de PBMC humano em camundongos²¹

1. Coloc uma câmara da anestesia em uma capa do fluxo laminar para manter a esterilidade. Pré-carregue a câmara de anestesia com 5% de isoflurano e 1 L/min de caudal de oxigénio durante 5 min.
2. Reduza o isoflurano para 2% e coloque os camundongos da mesma gaiola na câmara de anestesia. Uma vez que os ratos perdem endireitar, anestesiar camundongos por 5 min na câmara. Durante este tempo, pré-encha a seringa com 100 μL (1 x 10⁷ pilhas) da suspensão da pilha.
3. Coloc o rato em uma almofada de aquecimento com seu nariz em um cone do nariz para manter a anestesia. Verifique a perda de consciência por beliscar uma almofada de pé e verificando a falta de reflexo.
4. Restrain mouse com o polegar e dedo médio. Insira o 28 G 1/2 na agulha com o chanfro para baixo lateral ao canthus medial, através da membrana conjunctival até que a parte traseira do olho esteja alcangado. Retraia ligeiramente a agulha e injete lentamente 100 μL de células (1 x 10⁷ células).
5. Retire totalmente a agulha e elimine-a correctamente da seringa e da agulha. Feche a pálpebra e aplique uma ligeira pressão no local da injecção com uma esponja de gaze.
6. Examine o local de injeção para inchaço ou outro trauma visível. Permita que o rato recupere a consciência em uma gaiola estéril alinhada com as toalhas de papel para impedir a aspiração do fundamento antes de mover-se para a gaiola Home. Após qualquer sangramento ter parado, aplique uma única gota de proparacaína ao olho para analgesia.
   Nota: a injeção da veia cauda é um método alternativo de injeção intravenosa de PBMC para este protocolo, conforme descrito por Macholz et al.²².

4. escore clínico da DECH aguda em camundongos (Figura 1)²³

1. Meça a contagem de GVHD cada outro dia até que os ratos alcancem uma contagem de uns 2 e então todos os dias até o dia do sacrifício.
   1. Coloque a gaiola em uma capa de fluxo laminar, retire o alimento e a água e volte a colocar a tampa. Pontuação atividade observando camundongos por 5 min e atribuir pontuações da seguinte forma: 0 = mouse começa a andar dentro de alguns minutos e continua andando em torno da gaiola, 1 = mouse leva um mais de um par de minutos para se levantar e caminha lentamente em torno de gaiola, 2 = mouse não se levanta em 5 min e só caminha quando tocado.
2. Pesar cada rato em uma taça de vidro e dar um escore de perda de peso : 0 = < 10% de mudança, 1 = 10 – 25% de mudança e 2 = > 25% de mudança.
3. Enquanto o mouse ainda está no copo, inspecionar para a postura: 0 = normal, 1 = hunching em repouso, 2 = hunching prejudica o movimento; textura de pele: 0 = normal, 1 = rugido leve a moderado, 2 = rufiagem grave e integridade da pele : 0 = normal, 1 = escala de patas/cauda, 2 = áreas óbvias de pele desnaturada (olhar para orelhas, cauda e patas para escamação).
4. Com cinco categorias e uma pontuação de 0 – 2 para cada categoria, um rato pode atingir uma pontuação máxima de 10. Quando um mouse atinge uma pontuação de 7 ou maior ou atinge 42 dias após a injeção, eutanizar mouse via CO₂ eutanásia ou outro método aprovado pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais locais.
   Nota: para garantir a exatidão dos resultados, a pontuação é realizada por um pesquisador que está cego para os grupos de tratamento²⁴. Adicionalmente, embora > 20% da perda de peso corporal seja o ponto final humano recomendado para muitos protocolos de IACUC, com a aprovação adicional de IACUC da justificação deste protocolo pode ser obtido.

5. colhendo tecidos para DNA genómico de camundongos eutanasiados e isolando DNA genómico

1. Ratos dissecar usando ferramentas cirúrgicas estéreis. Corte um pequeno pedaço de tecido de cerca de 3 mm x 0,5 mm de tamanho de um órgão de interesse, por exemplo, pulmão, fígado ou baço. Pesar a amostra do tecido e coloc a parte do tecido em um tubo 1,5 mL estéril. Se coletar vários tecidos, lave as ferramentas com etanol entre cortar cada órgão.
2. Congele os tecidos submergindo os tubos contendo o tecido em nitrogênio líquido até que ele pare de borbulhar e armazene em-80 ° c durante a noite. Descongelar as amostras de tecido e lyse-los de acordo com um DNA genômica (gDNA) kit de isolamento.
3. Isole o DNA genómico de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito no kit. Certifique-se de notar a quantidade de tecido que foi processado por microlitro de gDNA eluída (mg/μL).
   Nota: os tecidos congelados podem ser armazenados em-80 ° c para processamento em um momento posterior.

6. quantificação de células T humanas utilizando PCR digital (Figura 2)

1. Prepare reações digitais do PCR de acordo com o protocolo para tinturas de ligação do ADN para a máquina digital do PCR que está sendo usada. Use os seguintes primers específicos para o DNA genómico do Epsilon humano CD3 (seqüência de referência de NCBI: NG_ 007383.1); Iniciador dianteiro: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, primer reverso: GCCCTACCAGCTGTGGAAAC. Estes primers renderá uma única faixa de 105 BP.
   Nota: Adicionar 0,5 μL de uma enzima de restrição, como a HindIII, a cada reacção para digerir o ADN genómico. Certifique-se de testar diferentes diluições de gDNA para otimizar a separação de gotículas positivas e negativas. Adicionalmente, um subconjunto de células T infiltrantes pode ser células T reguladoras não patogênicas. Essas células podem ser quantificadas usando primers adicionais para marcadores de células T regulatórias.
2. Realize a reacção de PCR digital nas seguintes condições: tampa a 105 ° c, 95 ° c durante 10 min (1 ciclo); 95 ° c para 30 s, rampa 2 ° c/s e 55 ° c por 1 minuto, rampa 2 ° c/s (40 ciclos); 72 ° c por 10 min, 12 ° c Hold.
   Nota: estes parâmetros podem precisar de ser ajustados dependendo do equipamento digital do PCR.
3. Adquira dados de PCR digital com software de análise. Dados do relatório como números de cópias por mg de tecido utilizando a seguinte equação: (número de cópias/μL) x (μL de gDNA em reacção) x (factor de diluição)/(mg de tecido/μL de gDNA total)

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Resultados

Os ratos de NSG de idade 8-12-Week irradiados sublethally de ambos os sexos que receberam o PBMC humano começaram a indicar sinais clínicos de GVHD em torno do dia 10 injeção do borne comparados aos ratos do controle negativo que receberam PBS somente (Figura 1a). Camundongos XenoGVHD tiveram sobrevida mediana de 23,5 dias (Figura 1b). Com PCR digital, as células T humanas positivas do Epsilon CD3 podiam ser detectadas nas a...

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Discussão

A progressão da doença é geralmente consistente no modelo xenoGVHD, mesmo com a injeção de PBMC de diferentes doadores, de modo que vários experimentos podem ser combinados. As etapas chaves exigidas para manter esta consistência são técnica apropriada da injeção de i.v., cegando e marcando consistente. Um estudo de Nervi et al.²⁵ demonstrou que, comparado à injeção venosa da veia cauda, as injeções retroorbitais de PBMC resultaram em Engraftment mais consistente e em DECH mais gra...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tubes	Fisher	05-408-129
10 mL serological pipet	VWR International	89130-898
10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin pipette tips	Rainin	17001118	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
50 mL conical tube	VWR International	89039-656
96-Well ddPCR plate	Bio-Rad	12001925
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	Lonza	10-548E	Optional
Alcohol Wipes	Fisher Scientific	6818
Anesthesia Chamber	World Precision Instruments	EZ-178	Provided by animal facility
Anesthesia Machine	Parkland Scientific	PM1002	Provided by animal facility
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set	Becton Dickinson	367281
DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864007
DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O	Life Technologies	1811318
Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
Insulin Syringe	Fisher Scientific	329424
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	Provided by animal facility
Liquid nitrogen	N/A	N/A
Mouse Irradiator Pie Cage	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	Holds up to 11 mice
Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 pipetman	MidSci	A-1000
P200 pipetman	MidSci	A-200
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Rainin	17013805	Do not use other pipettes or pipet tips for droplet generation
Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506
qPCR plates	VWR International	89218-292
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	12001925	Includes droplet generator, droplet reader, laptop computer, software, associated component consumables, for EvaGreen or probe-based digital PCR applications
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-Rad	1864033
RNase and DNase-free plate seal	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640	Life Technologies	12633012
Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)	Fisher Scientific	67522
Sterile Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	21040CV
Sterile reservoir	VWR International	89094-662
Surgial Scissors	Kent Scientific	INS600393-4
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650914-4