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摘要

在小鼠的双边二次运动皮层(M2)中,我们提供局部场势(LFP)的体内电生理记录,可用于评估半球侧化。研究表明,与WT对照组相比,APP/PS1小鼠左右M2的同步水平发生了变化。

摘要

本文演示了小鼠皮质区域局部场势 (LFP)的体内双边记录和分析的完整、详细的程序,这些程序可用于评估可能的横向缺陷,以及评估啮齿动物中大脑连接和神经网络活动的耦合。阿尔茨海默氏病(AD)是一种常见的神经退行性疾病,其病理机制在很大程度上仍不为人所知。改变的大脑侧向在老年人中已经得到证明,但异常横向化是否是AD的早期迹象之一尚未确定。为了调查这一点,我们在 3-5 个月大的 AD 模型小鼠 APP/PS1 中记录了双边 LfSP,以及垃圾野生类型 (WT) 控件。左、右二级运动皮层(M2),特别是在伽马带,在APP/PS1小鼠中比在WT对照中更同步,这表明此AD小鼠模型中双边M2的半球不对称性下降。值得注意的是,记录和数据分析过程灵活且易于执行,在进行以神经元回路为重点的实验时,也可以应用于其他大脑通路。

引言

阿尔茨海默病(AD)是痴呆症1,2最常见的形式。细胞外β淀粉样蛋白(β-淀粉样蛋白,A+)沉积和细胞内神经纤维缠结(NFTs)是AD3、4、5的主要病理特征,但AD背后的机制发病机制在很大程度上仍不清楚。大脑皮层是认知和记忆的关键结构,在AD6中受损,运动缺陷,如缓慢行走,导航环境困难和步态障碍发生与7岁。在AD患者8和认知影响老年人9的前期运动皮层(PMC)和辅助运动区(SMA)中也观察到了发育前沉积和神经纤维纠结,表明运动受损。AD发病机制中的系统。

大脑由两个不同的大脑半球组成,由纵向裂缝分割。健康的大脑表现出结构和功能不对称10,这被称为"横向化",使大脑能够有效地处理多种任务和活动。衰老导致认知和运动恶化,同时大脑侧向减少11,12。左半球的运动能力在健康的大脑13中显而易见,但在AD脑异常的侧向性中,由于左半球的统治力与左皮质萎缩14相关而失败, 15,16.因此,了解AD发病机制中大脑横向化的可能变化及其基本机制,可能为AD发病机制提供新的见解,并导致确定潜在的治疗生物标志物。

电生理测量是评价动物神经元活动变化的一种灵敏而有效的方法。通过电生理学研究与同步的半球间转移时间,记录到老年人半球不对称的减少(HAROLD)17,这表明半球不对称的弱化或缺乏单体呈现老年人的言语刺激18。使用APP/PS1,最常用的AD鼠标型号之一19,20,21,22,结合体内双边的LLFP在左和右M2的细胞外记录,我们评估 AD 中可能的横向缺陷。此外,通过简单的参数设置,数据分析软件的内置功能(参见材料表)提供了一种比数学上更快速、更直接的电信号同步分析方法复杂的编程语言,对具有体内电生理学的初学者友好。

研究方案

根据中国科技部《动物实验室指南》,所有动物均按标准条件(12小时明/暗、恒温环境、免费获得食物和水)配对安置,并通过了实验由广州大学地方伦理委员会。这是一个非生存程序。

注:对于代表性结果中显示的数据,APP/PS1(B6C3-Tg(ApPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J)在3-5个月大时使用双转基因小鼠和垃圾野生型(WT)对照组进行录音(n = 每组10个)。

1. 动物麻醉和手术

  1. 通过您当地动物护理委员会批准的麻醉方案对小鼠进行称重和麻醉。
  2. 在手术前用钳子进行尾巴或脚趾捏合,以确认深层麻醉。
  3. 将鼠标放置在立体设备中并固定其头部。
  4. 在两只眼睛上涂抹眼膏,保持湿润。遵循您当地有关术前和术后痛感的动物护理指南。
  5. 用手术剪发。用剪刀在暴露的手术区中间做一个小切口(12-15毫米)。使用钳子,轻轻地将头皮从中线拉开。
  6. 轻轻分离皮肤并去除残留组织。使用涂有过氧化氢的棉芽清洁头骨。
  7. 在头骨的左右两侧钻两个小孔半径 1.0-1.5 mm,以便将记录微电极插入立体显微镜下的 M2 区域(图 1A)。
    注:双边M2的立体位置:1.94毫米前向布雷格马,1.0毫米横向到中线,0.8-1.1毫米通风口到杜拉。
  8. 用钨针小心地取出杜拉母体。
  9. 将玻璃硼硅酸盐微移液管(外径:1.0 mm)作为记录电阻为1-2 MΩ的微电极。
  10. 使用机械微操作器(在 60°,图 1B) 将两个填充 0.5 M NaCl 的独立记录微电极插入孔中。

2. 小鼠双边M2中的LFP记录

  1. 将左右玻璃电极缓慢地降至双边 M2 的适当坐标中(图 1C)。
  2. 为了进行质量控制,在捕获 LP 之前,使用差分放大器测试每个电极的电阻。
  3. 将录制过程设置为 0.1 Hz 高通和 1,000 Hz 低通,放大 1,000 倍。
  4. 收集至少60s在稳定状态下的自发活动的数字化原始LFP数据,小鼠在麻醉下以每秒2次呼吸的呼吸速度均匀呼吸。
  5. 录音后,缓慢地将电极从大脑中抬起,然后通过快速宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
  6. 保存数据并脱机分析。

3. 交叉关联分析

  1. 单击分析 - 分析软件中的波形关联并导入数据。
  2. 参数设置
    1. 将一个波形通道信号定义为第一个通道,将另一个定义为参考。将宽度设置为 2,偏移设置为 1 (图 2A)。
    2. 通过选择开始时间和结束时间,将两个 LLP 的持续时间设置为 100 s。按"过程"按钮执行交叉关联分析 (图 2B)。
      注:同时具有这种持续时间的双边信号将足够长,以显示神经元自发活动,从而揭示同步的基本特性。
  3. 单击"文件 - 导出为",然后以 .txt 格式保存与结果弹出窗口对应的交叉关联结果。
  4. 打开 .txt 文件 (图 2C),删除时间滞后范围为 0 ± 0.01 s 的关联值(因为两个连续伽马波具有至少 0.01 s 间隔),然后在负时滞部分或平均值中平均其余交叉相关数据正时滞部分中的其余交叉相关数据。

4. 一致性分析

  1. 在分析软件中导入并运行数据。
  2. 分别分配两个 LFP 信号作为第一和第二波形通道。然后设置块大小值 (图 3A)。
    注: 数据块大小是指 FFT 中使用的数据点数。块大小越大,频率分辨率越好。在这里,我们建议将其设置为 4096。
  3. 手动移动虚线,以确保两个通道中信号的时间精度设置为同一周期(图 3B)。按"添加区域"按钮加载区域并执行一致性分析。
  4. 单击"文件 - 保存"以保存与生成的弹出式图表对应的一致性结果(图 3B)。

结果

为了了解早期AD病理学是否损害半球横向化的能力,我们在APP/PS1小鼠的左右M2和WT对照(3-5个月)进行了双边细胞外LFP记录,并分析了这些左和正确的 LLFP。在WT小鼠中,结果表明,正时滞时左右LLFP之间的平均相关性与负时滞时的平均相关性存在显著差异,这暗示了WT对照M2区域存在半球不对称(图4 C;WT-正,0.08161 = 0.01246;WT-负,0.0206 ± 0.01218;p = 4.74531E-4 < 0.001 通过两个样本t

讨论

我们在这里报告体内双边细胞外记录的过程,以及分析双区域LFP信号的同步,这既灵活又易于进行,用于估计大脑半球的横向化,以及两个大脑区域的神经活动之间的连接性、方向性或耦合性。这不仅可以广泛用于揭示组神经元活动,还可以揭示区域间电生理学的一些基本特性,特别是对于对筛选振荡活动感兴趣的实验室或没有系统多通道记录在行为动物23。

...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金(31771219,31871170)、广东省科学技术厅(2013KJCX0054)和广东省自然科学基金(2014A030313418) 的资助。2014A030313440)。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AC/DC Differential AmplifierA-M SystemsModel 3000
Analog Digital converterCambridge Electronic Design Ltd.Micro1401
Glass borosilicate micropipettesNanjing spring teaching experimental equipment company161230Outer diameter: 1.0mm
Microelectrode pullerNarishigePC-10
NaClGuangzhou Chemical Reagent Factory7647-14-5
Pin microelectrode holderWorld Precision Instruments, INC.MEH3SW10
Spike2 Cambridge Electronic Design Ltd.
StereomicroscopeZeiss435064-9020-000
Stereotaxic apparatus RWD Life Science68045
UrethaneSigma-Aldrich94300

参考文献

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