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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo la registrazione elettrofisiologica in vivo del potenziale di campo locale (LFP) nella corteccia motoria secondaria bilaterale (M2) dei topi, che può essere applicata per valutare la lateralizzazione dell'emisfero. Lo studio ha rivelato livelli alterati di sincronizzazione tra l'M2 sinistro e destro nei topi APP/PS1 rispetto ai controlli WT.

Abstract

Questo articolo illustra procedure complete e dettagliate sia per la registrazione bilaterale in vivo che l'analisi del potenziale sul campo locale (LFP) nelle aree corticali dei topi, utili per valutare possibili deficit di lateralità, nonché per la valutazione della connettività cerebrale e l'accoppiamento delle attività di rete neurale nei roditori. I meccanismi patologici alla base del morbo di Alzheimer (AD), una malattia neurodegenerativa comune, rimangono in gran parte sconosciuti. Alterato lateralità cerebrale è stato dimostrato in persone di invecchiamento, ma se la lateralizzazione anormale è uno dei primi segni di AD non è stato determinato. Per indagare su questo, abbiamo registrato l'LFP bilaterale in topi modello AD di 3-5 mesi, APP/PS1, insieme acontrolli di tipo selvaggio (WT) di littermate. Gli LFP della corteccia motoria secondaria sinistra e destra (M2), in particolare nella banda gamma, erano più sincronizzati nei topi APP/PS1 che nei controlli WT, suggerendo una declineta asimmetria emisferica dell'M2 bilaterale in questo modello murino AD. In particolare, i processi di registrazione e analisi dei dati sono flessibili e facili da eseguire, e possono anche essere applicati ad altri percorsi cerebrali quando conducono esperimenti che si concentrano sui circuiti neuronali.

Introduzione

Il morbo di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza1,2. La deposizione extracellulare di beta amiloide (proteina amiloide, amiloide, az) deposizione e i grovigli neurofibrillari intracellulari (NFT) sono le principali caratteristiche patologiche di AD3,4,5, ma i meccanismi alla base di AD patogenesi rimangono in gran parte poco chiare. La corteccia cerebrale, una struttura chiave nella cognizione e nella memoria, è compromessa nel6adD e i deficit motori come la camminata lenta, la difficoltà di navigazione nell'ambiente e i disturbi dell'andatura si verificano con l'avanzare dell'etàdi 7anni. La deposizione di aecuzazione e i grovigli neurofibrillari sono stati osservati anche nella corteccia premotoria (PMC) e nell'area motoria supplementare (SMA) nei pazienti affetti da AD8 e negli adulti anziani con impatto cognitivo9, indicando il coinvolgimento di un nella patogenesi AD.

Il cervello è formato da due distinti emisferi cerebrali che sono divisi da una fessura longitudinale. Un cervello sano presenta asimmetrie strutturali e funzionali10, che si chiama "lateralizzazione", permettendo al cervello di affrontare in modo efficiente più attività e attività. L'invecchiamento si traduce in un deterioramento della cognizione e della locomozione, insieme a una riduzione della lateralità cerebrale11,12. Le capacità motorie dell'emisfero sinistro sono immediatamente evidenti nel cervello sano13, ma nel cervello AD lalateralità aberrone si verifica come conseguenza del fallimento del dominio dell'emisfero sinistro associato all'atrofia corticale sinistra14, 15,16. Pertanto, la comprensione di una possibile alterazione della lateralizzazione cerebrale nella patogenesi delle AD e dei meccanismi sottostanti può fornire nuove informazioni sulla patogenesi dell'AD e portare all'identificazione di potenziali biomarcatori per il trattamento.

La misurazione elettrofisiologica è un metodo sensibile ed efficace per valutare i cambiamenti nelle attività neuronali degli animali. La riduzione dell'asimmetria emisferica negli anziani (HAROLD)17 è stata documentata dalla ricerca elettrofisiologica con il tempo di trasferimento interhemispheric sincronizzato, che mostra l'indebolimento o l'assenza di asimmetria emisferica a presentata mostaucolorata stimoli vocali negli anziani18. Utilizzando APP/PS1, uno dei modelli murini AD più comunemente utilizzati19,20,21,22, in combinazione con la registrazione extracellulare bilaterale in vivo di LFP in entrambi i M2 sinistro e destro, abbiamo ha valutato i possibili deficit di lateralità in AD. Inoltre, con semplici impostazioni dei parametri, la funzione integrata del software di analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali) fornisce un modo più veloce e più semplice per analizzare la sincronizzazione dei segnali elettrici rispetto matematicamente complesso linguaggio di programmazione, che è amichevole per i principianti con elettrofisiologia in vivo.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard (12 h ambiente chiaro/scuro, a temperatura costante, libero accesso al cibo e all'acqua) secondo il Laboratorio cinese del Ministero della Scienza e della Tecnologia dal comitato etico locale dell'Università di Guangzhou. Questa è una procedura di non sopravvivenza.

NOTA: per i dati riportati nei risultati rappresentativi, per i dati APP/PS1 (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) sono stati utilizzati per le registrazioni (n - 10, per gruppo) i controlli di tipo selvaggio (WT) a 3-5 mesi di età, sono stati utilizzati per le registrazioni (n - 10, per gruppo).

1. Anestesia animale e chirurgia

  1. Pesare e anetizzare il topo dal vostro regime di anestesia approvato dal vostro comitato locale per la cura degli animali.
  2. Eseguire un pizzico di coda o di dita con pinze per confermare l'anestesia profonda prima dell'intervento chirurgico.
  3. Posizionare il mouse in un apparato stereotassico e fissare la testa.
  4. Applicare unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per mantenere umido. Segui le tue linee guida locali per la cura degli animali per quanto riguarda l'analgesia pre e postoperatoria.
  5. Rasare i capelli con clipper chirurgici. Fare una piccola incisione (12-15 mm) nel mezzo dell'area chirurgica esposta con le forbici. Utilizzando pinze, tirare delicatamente il cuoio capelluto lontano dalla linea mediana.
  6. Separare delicatamente la pelle e rimuovere il tessuto residuo. Pulire il cranio utilizzando cotton fioc ricoperti di perossido di idrogeno.
  7. Forare due piccoli fori di radii 1,0-1,5 mm su entrambi i lati sinistro e destro del cranio per consentire l'inserimento dei microelettrodi di registrazione nelle regioni M2 sotto uno stereomicroscopio (Figura 1A).
    NOTA: Posizioni stereotaxiche di M2 bilaterale: 1,94 mm anteriore al bregma, 1,0 mm laterale alla linea mediana e 0,8-1,1 mm ventrale alla dura.
  8. Rimuovere con attenzione la dura mater con un ago di tungsteno.
  9. Tirare micropipette di borosilicate in vetro (diametro esterno: 1,0 mm) come microelettrodi di registrazione con resistenza di 1-2 M.
  10. Inserire due microelettrodi di registrazione separati riempiti con NaCl 0,5 M nei fori utilizzando micromanipolatori meccanici (a 60 , Figura 1B).

2. Registrazioni LFP in M2 bilaterale di topi

  1. Abbassare lentamente gli elettrodi di vetro sinistro e destro nelle coordinate appropriate del F2 bilaterale (Figura 1C).
  2. Per il controllo della qualità, verificare la resistenza di ogni elettrodo utilizzando l'amplificatore differenziale prima di catturare LFP.
  3. Impostare il processo di registrazione a passate alte da 0,1 hz e a passaggi bassi da 1.000 Hz con un'amplificazione di 1.000x.
  4. Raccogliere i dati LFP grezzi digitalizzati di almeno 60 s attività s s in stato stabile, con i topi che respirano in modo uniforme ad una velocità respiratoria di 2 respiri al secondo in anestesia.
  5. Dopo la registrazione, sollevare lentamente gli elettrodi dal cervello, quindi eutanasia i topi da una rapida lussazione cervicale.
  6. Salvare i dati e analizzare offline.

3. Analisi incrociata

  1. Fare clic su Analisi - Correlazione forma d'onda nel software di analisi e importare i dati.
  2. Impostazioni dei parametri
    1. Definire un segnale di forma d'onda come primo canale e l'altro come riferimento. Impostare la larghezza su 2 e l'offset su 1 (Figura 2A).
    2. Impostare la durata di entrambi gli LFP per 100 s selezionando l'ora di inizio e l'ora di fine. Premere il pulsante Elabora per eseguire l'analisi di correlazione incrociata (Figura 2B).
      NOTA: I segnali bilaterali simultanei con tali durate sarebbero abbastanza lunghi da mostrare attività spontanee neuronali, rivelando così le proprietà di base della sincronizzazione.
  3. Fare clic su File - Esporta con nome, quindi salvare i risultati della correlazione incrociata corrispondenti al grafico popup risultante in formato .txt.
  4. Aprire il file .txt (Figura 2C), rimuovere i valori di correlazione al tempo di ritardo compresi 0 - 0,01 s (poiché due onde gamma continue hanno almeno 0,01 s intervallo), quindi calcolare la media del resto dei dati di correlazione incrociata nella parte o nella media del ritardo temporale negativo il resto dei dati di correlazione incrociata nella parte positivo del ritardo temporale.

4. Analisi della coerenza

  1. Importare ed eseguire i dati nel software di analisi.
  2. Assegnare i due segnali LFP per essere il primo e il secondo canale di forma d'onda separatamente. Impostare quindi il valore della dimensione del blocco (Figura 3A).
    NOTA: Dimensione blocco indica il numero di punti dati utilizzati nell'FFT. Maggiore è la dimensione del blocco, migliore è la risoluzione della frequenza. Qui si consiglia di impostarlo come 4096.
  3. Spostare manualmente le linee tratteggiate per garantire che l'accuratezza temporale dei segnali in entrambi i canali venga impostata come lo stesso periodo (Figura 3B). Premere il pulsante Aggiungi area per caricare l'area ed eseguire l'analisi della coerenza.
  4. Fare clic su File - Salva con nome per salvare i risultati della coerenza corrispondenti al grafico popup risultante in formato .txt ( Figura3B).

Risultati

Per vedere se la patologia precoce dell'AD compromette la capacità della lateralizzazione dell'emisfero, abbiamo condotto registrazioni LFP extracellulari bilaterali nel M2 sinistro e destro dei topi APP/PS1 e controlli WT (di età compresa tra 3-5 mesi) e analizzato la correlazione incrociata di questi controlli sinistro e sinistro LFP destro. Nei topi WT, i risultati hanno dimostrato che la correlazione media tra LFP sinistro e destro in tempi positivi ritardi differiva in modo significativo da quello in tempi negativ...

Discussione

Riportiamo qui la procedura per la registrazione extracellulare bilaterale in vivo, insieme all'analisi della sincronizzazione dei segnali LFP a doppia area, che è flessibile e facile da condurre per stimare la lateralizzazione dell'emisfero cerebrale, così come connettività, direzionalità o accoppiamento tra attività neurali di due aree cerebrali. Questo può essere ampiamente utilizzato per rivelare non solo attività neuronali di gruppo, ma anche alcune proprietà di base dell'elettrofisiologia interregi...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31771219, 31871170), della Divisione Scienza e Tecnologia del Guangdong (2013KJCX0054) e della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Guangdong (2014A030313418, 2014A030313440).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AC/DC Differential AmplifierA-M SystemsModel 3000
Analog Digital converterCambridge Electronic Design Ltd.Micro1401
Glass borosilicate micropipettesNanjing spring teaching experimental equipment company161230Outer diameter: 1.0mm
Microelectrode pullerNarishigePC-10
NaClGuangzhou Chemical Reagent Factory7647-14-5
Pin microelectrode holderWorld Precision Instruments, INC.MEH3SW10
Spike2 Cambridge Electronic Design Ltd.
StereomicroscopeZeiss435064-9020-000
Stereotaxic apparatus RWD Life Science68045
UrethaneSigma-Aldrich94300

Riferimenti

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