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Resumo

Nós apresentamos in vivo a gravação eletrofisiológicos do potencial local do campo (LFP) no córtice de motor secundário bilateral (m2) dos ratos, que podem ser aplicados para avaliar o lateralization do hemisfério. O estudo revelou níveis alterados de sincronização entre o m2 esquerdo e direito em camundongos APP/PS1 comparados aos controles de WT.

Resumo

Este artigo demonstra procedimentos completos e detalhados para o registro bilateral in vivo e a análise do potencial de campo local (LFP) nas áreas corticais de camundongos, que são úteis para avaliar possíveis déficits de lateralidade, bem como para avaliando a conectividade cerebral e o acoplamento de atividades de rede neural em roedores. Os mecanismos patológicos subjacentes à doença de Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa comum, permanecem em grande parte desconhecidos. A lateralidade alterada do cérebro foi demonstrada em pessoas envelhecendo, mas se a lateralização anormal é um dos primeiros sinais de AD não foi determinada. Para investigar isso, registramos LFPs bilaterais em camundongos modelo AD de 3-5 meses de idade, APP/PS1, juntamente com controles de tipo selvagem (WT) de littermate. Os LFPs do córtex motor secundário esquerdo e direito (m2), especificamente na banda gama, foram mais sincronizados em camundongos APP/PS1 do que nos controles de WT, sugerindo uma assimetria hemisférica declinada de m2 bilaterais neste modelo de mouse AD. Notavelmente, os processos de gravação e análise de dados são flexíveis e fáceis de realizar, e também podem ser aplicados a outras vias cerebrais ao realizar experimentos que se concentram em circuitos neuronais.

Introdução

A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência1,2. A deposição de proteína beta-amilóide extracelular (proteína β-amiloide, aβ) e emaranhados neurofibrilares intracelulares (NFTS) são as principais características patológicas do anúncio3,4,5, mas os mecanismos subjacentes ao AD a patogénese permanece em grande parte obscura. O córtex cerebral, uma estrutura-chave na cognição e memória, é prejudicado na AD6, e déficits motores como caminhada lenta, dificuldade em navegar pelo ambiente e distúrbios da marcha ocorrem com o avanço da idade7. O depósito de Aβ e os emaranhados neurofibrilary foram observados igualmente no córtice premotor (PMC) e na área motora suplementar (SMA) em pacientes de AD8 e em adultos mais velhos impactados cognitivamente9, indicando a participação de um motor danificado sistema na patogénese do AD.

O cérebro é formado por dois hemisférios cerebrais distintos que se dividem por uma fissura longitudinal. Um cérebro saudável exibe assimetrias estruturais e funcionais10, que é chamado de "lateralização", permitindo que o cérebro para lidar eficientemente com várias tarefas e atividades. O envelhecimento resulta em deterioração da cognição e locomoção, juntamente com a redução da lateralidade cerebral11,12. As habilidades motoras do hemisfério esquerdo são prontamente aparentes no cérebro saudável13, mas na lateralidade aberrante do cérebro do anúncio ocorre como consequência da falha da dominância do hemisfério esquerdo associada à atrofia cortical esquerda14, 15,16. Conseqüentemente, uma compreensão de uma alteração possível da lateralização do cérebro na patogénese do AD e nos mecanismos subjacentes pode fornecer introspecções novas na patogénese do AD e conduzir à identificação de biomarcadores potenciais para o tratamento.

A medida electrofisiológica é um método sensível e eficaz de avaliar mudanças nas atividades neuronal dos animais. A redução da assimetria hemisférica em idosos (HAROLD)17 tem sido documentada por pesquisa eletrofisiológica com tempo de transferência interhemisférico sincronizado, o que mostra enfraquecimento ou ausência de assimetria hemisférica para apresentação monauralmente estímulos de fala nos idosos18. Utilizando o app/ps1, um dos modelos de mouse de anúncios mais comumente usados19,20,21,22, em combinação com a gravação extracelular bilateral in vivo de lfps no m2 esquerdo e direito, nós avaliaram possíveis déficits de lateralidade na AD. Além disso, com configurações de parâmetros simples, a função interna do software de análise de dados (veja a tabela de materiais) fornece uma maneira mais rápida e mais direta de analisar a sincronização de sinais elétricos do que matematicamente linguagem de programação complexa, que é amigável para iniciantes com eletrofisiologia in vivo .

Protocolo

Todos os animais foram emparelhados-alojados em condições padrão (12 h luz/escuro, ambiente de temperatura constante, livre acesso a alimentos e água) de acordo com o ministério chinês de ciência e tecnologia de laboratório animais diretrizes e experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local da Universidade de Guangzhou. Este é um procedimento de não-sobrevivência.

Nota: para os dados mostrados nos resultados representativos, o APP/PS1 (B6C3-TG (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) camundongos duplos transgênicos e os controles Wild-Type (WT) de littermate aos 3-5 meses de idade foram utilizados para gravações (n = 10, por grupo).

1. anestesia animal e cirurgia

  1. Pesar e anestesiizar o mouse pelo seu regime de anestesia aprovado de seu Comitê de cuidados com animais locais.
  2. Realize um aperto da cauda ou do dedo do pé com fórceps para confirmar a anestesia profunda antes da cirurgia.
  3. Posicione o mouse em um aparelho estereotódico e fixar a cabeça.
  4. Aplique pomada ocular em ambos os olhos para manter úmido. Siga suas diretrizes de cuidados com animais locais em relação à analgesia pré e pós-operatória.
  5. Depilar o cabelo usando cortadores cirúrgicos. Faça uma pequena incisão (12-15 mm) no meio da área cirúrgica exposta com tesouras. Usando fórceps, puxe suavemente o couro cabeludo para longe da linha média.
  6. Separe a pele suavemente e retire o tecido residual. Limpe o crânio usando botões de algodão revestidos com peróxido de hidrogênio.
  7. Perfure dois pequenos furos de raios 1,0-1,5 mm em ambos os lados esquerdo e direito do crânio para permitir a inserção dos microeletrodos de gravação nas regiões m2 um estereomicroscópio (Figura 1a).
    Nota: locais Estereotóricos de m2 bilaterais: 1,94 mm anterior à Bregma, 1,0 mm lateral à linha média e 0,8-1,1 mm ventral à dura-máter.
  8. Retire a dura-máter cuidadosamente com uma agulha de tungstênio.
  9. Puxe Micropipetas de borosilicato de vidro (diâmetro externo: 1,0 mm) como microeletrodos de gravação com resistência de 1-2 MΩ.
  10. Insira dois microeletrodos de gravação separados preenchidos com 0,5 M de NaCl nos furos usando Micromanipuladores mecânicos (a 60 °, Figura 1B).

2. LFP gravações em m2 bilaterais de camundongos

  1. Abaixe os eletrodos de vidro esquerdo e direito lentamente em coordenadas apropriadas de m2 bilaterais (Figura 1C).
  2. Para o controle de qualidade, teste a resistência de cada eletrodo usando o amplificador diferencial antes de capturar LFPs.
  3. Definir o processo de gravação em 0,1 Hz High-Pass e 1.000 Hz low-pass com 1, 000x amplificação.
  4. Colete dados de LFP RAW digitalizados de pelo menos 60 s atividades espontâneas em estado estável, com camundongos respirando uniformemente a uma taxa respiratória de 2 respirações por segundo anestesia.
  5. Após a gravação, levante lentamente os eletrodos para fora do cérebro, em seguida, eutanizar os camundongos por luxação cervical rápida.
  6. Salve os dados e analise offline.

3. análise de correlação cruzada

  1. Clique em análise-correlação de forma de onda no software de análise e importe os dados.
  2. Configurações de parâmetro
    1. Defina um sinal de canal de forma de onda como o primeiro canal e o outro como a referência. Defina A largura como 2 e offset como 1 (Figura 2A).
    2. Defina a duração de ambos os LFPs para 100 s selecionando a hora de início e a hora de término. Pressione o botão process para realizar a análise de correlação cruzada (Figura 2B).
      Nota: os sinais bilaterais simultâneos com tais durações seriam longos bastante mostrar atividades espontâneas neuronal, revelando desse modo as propriedades básicas da sincronização.
  3. Clique em arquivo-exportar comoe, em seguida, salve os resultados de correlação cruzada correspondentes ao gráfico pop-up resultante no formato. txt.
  4. Abra o arquivo. txt (Figura 2C), remova os valores de correlação em intervalos de tempo variou 0 ± 0, 1 s (uma vez que duas ondas gama contínuas têm pelo menos 0, 1 s intervalo), em seguida, a média do resto dos dados de correlação cruzada na parte de atraso de tempo negativo ou média o resto dos dados de correlação cruzada na parte de retardo de tempo positiva.

4. análise da coerência

  1. Importe e execute os dados no software de análise.
  2. Atribua os dois sinais LFP para ser o primeiro e segundo canais de forma de onda separadamente. Em seguida, defina o valor do tamanho do bloco (Figura 3a).
    Nota: o tamanho do bloco significa o número de pontos de dados utilizados no FFT. Quanto maior o tamanho do bloco, melhor a resolução de freqüência. Aqui recomendamos configurá-lo como 4096.
  3. Mova as linhas pontilhadas manualmente para garantir que a precisão de tempo dos sinais em ambos os canais esteja sendo definida como o mesmo período (Figura 3B). Pressione o botão Adicionar área para carregar a área e executar a análise de coerência.
  4. Clique em arquivo -salvar como para salvar os resultados de coerência correspondentes ao gráfico de pop-up resultante no formato. txt (Figura 3B).

Resultados

Para verificar se a patologia precoce do AD prejudica a capacidade de lateralização do hemisfério, realizamos gravações de LFP extracelulares bilaterais no m2 esquerdo e direito de camundongos APP/PS1 e controles de WT (com idade de 3-5 meses), e analisamos a correlação cruzada destes LFPs direito. Nos camundongos WT, os resultados demonstraram que a correlação média entre os LFPs esquerdo e direito nos atrasos de tempo positivos diferiu significativamente do que nos atrasos de tempo negativos, implicando a exi...

Discussão

Nós relatamos aqui o procedimento para a gravação extracelular in vivo bilateral, junto com analisar a sincronização de sinais da duplo-região LFP, que é flexível e fácil conduzir para estimar o lateralization do hemisfério do cérebro, assim como o conectividade, direcionalidade ou acoplamento entre as atividades neurais de duas áreas cerebrais. Isso pode ser amplamente utilizado para revelar não só as atividades grupo-neuronais, mas também algumas propriedades básicas da eletrofisiologia inter-r...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subvenções da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31771219, 31871170), a divisão de ciência e tecnologia de Guangdong (2013KJCX0054), e da Fundação de ciência natural da província de Guangdong (2014A030313418, 2014A030313440).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AC/DC Differential AmplifierA-M SystemsModel 3000
Analog Digital converterCambridge Electronic Design Ltd.Micro1401
Glass borosilicate micropipettesNanjing spring teaching experimental equipment company161230Outer diameter: 1.0mm
Microelectrode pullerNarishigePC-10
NaClGuangzhou Chemical Reagent Factory7647-14-5
Pin microelectrode holderWorld Precision Instruments, INC.MEH3SW10
Spike2 Cambridge Electronic Design Ltd.
StereomicroscopeZeiss435064-9020-000
Stereotaxic apparatus RWD Life Science68045
UrethaneSigma-Aldrich94300

Referências

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