마우스의 보조 모터 피질에서 양측 지역 필드 전위 기록을 가진 반구 측면화의 평가

요약

우리는 마우스의 양측 이차 모터 피질 (M2)에서 국소 전위 (LFP)의 생체 내 전기 생리학적 기록을 제시하며, 이는 반구 측면화를 평가하기 위해 적용될 수 있다. 연구 결과는 WT 통제에 비교된 APP/PS1 마우스에 있는 좌우 M2 사이 동기화의 변경한 수준을 밝혔습니다.

초록

이 문서는 가능한 측면 적자를 평가하는 데 유용한 마우스의 피질 영역에서 생체 내 양자 기록 및 로컬 필드 전위 (LFP)의 분석에 대한 완전하고 상세한 절차를 보여줍니다. 설치류에서 뇌 연결 및 신경 네트워크 활동의 커플링을 평가합니다. 일반적인 신경 퇴행성 질환인 알츠하이머 병(AD)의 근본적인 병리학 적 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 변경된 두뇌 측면은 노화 사람들에서 입증되었습니다, 그러나 이상한 측공은 AD의 초기 표시의 한개인지 여부는 결정되지 않았습니다. 이를 조사하기 위해 3-5개월 된 AD 모델 마우스APP/PS1에 리터메이트 야생형(WT) 대조군과 함께 양측 LFP를 기록했습니다. 좌우 보조 모터 피질(M2)의 LFP는 특히 감마 대역에서 WT 대조군보다 APP/PS1 마우스에서 더 동기화되었으며, 이 AD 마우스 모델에서 양측 M2의 반구적 비대칭이 감소됨을 시사한다. 특히, 기록 및 데이터 분석 프로세스는 유연하고 수행하기 쉽고, 또한 신경 회로에 초점을 맞춘 실험을 수행 할 때 다른 뇌 경로에 적용 할 수 있습니다.

서문

알츠하이머병(AD)은 치매의 가장 흔한형태이며 1,^2. 세포외 베타 아밀로이드 단백질(β-아밀로이드 단백질, Aβ) 증착 및 세포내 신경섬유 엉킴(NFTs)은 AD 3,^4,5의주요 병리학적 특징이지만 AD의 근본적인 메커니즘은 병인은 크게 불분명남아 있습니다. 인식과 기억의 핵심 구조인 대뇌 피질은 AD^6에서손상되고, 느린 보행, 환경 탐색 의어려움 및 걸음걸이 장애와 같은 운동 결핍은^7세가되면 발생합니다. Aβ 증착 및 신경 섬유성 엉킴은 또한 AD 환자 8의 전운동 피질(PMC) 및 보조 운동 영역(SMA)에서 관찰되었으며, 인지적으로 영향을 받은 노인^9,손상된 운동장의 침범을 나타내는 AD 병인의 시스템.

뇌는 세로 균열에 의해 분할되는 두 개의 별개의 대뇌 반구에 의해 형성된다. 건강한 두뇌는 구조적 및 기능적 비대칭^10을모두 나타내며, 이는 "측면화"라고 불리며, 뇌가 여러 작업과 활동을 효율적으로 처리할 수 있도록 합니다. 노화는 뇌 측면의 감소와 함께 인식및 운동의 악화를 초래한다^11,12. 좌반구의 운동 능력은 건강한^{뇌(13)에서}쉽게 명백하지만, AD 뇌의 비정상적인 측면성은 좌측 피질 위축과 관련된 좌반구 우세의 실패의 결과로 발생한다^{14, 15,16}. 그러므로, AD 병인및 근본적인 기계장치에 있는 두뇌 측면화의 가능한 변경의 이해는 AD 병인에 새로운 통찰력을 제공하고 처리를 위한 잠재적인 biomarkers의 확인으로 이끌어 낼 수 있습니다.

전기 생리학적 측정은 동물의 신경 활동의 변화를 평가하는 민감하고 효과적인 방법입니다. 장로 (HAROLD)^17에서 반구 성 비대칭의 감소는 동기화 된 간반구 전달 시간과 전기 생리학적 연구에 의해 문서화되었습니다, 이는 약화 또는 반구 비대칭의 부재를 보여줍니다. 노인의 음성 자극¹⁸. APP / PS1을 활용, 가장 일반적으로 사용되는 AD 마우스 모델 중 하나^19,20,21,22,좌우 M2 모두에서 LFP의 생체 내 양측 세포 외 기록과 함께, 우리는 AD에서 가능한 측면 적자를 평가했습니다. 또한 간단한 매개 변수 설정을 통해 데이터 분석 소프트웨어의 내장 기능(재료 표참조)은 수학적으로보다 전기 신호의 동기화를 보다 빠르고 간단하게 분석할 수 있는 방법을 제공합니다. 복잡한 프로그래밍 언어, 이는 생체 내 전기 생리학 초보자에게 친절.

프로토콜

중국 과학기술정보통신부(SOf Of Science And The 공) 연구실 의 지침에 따라 모든 동물은 표준 조건(12시간 빛/어두운, 일정한 온도 환경, 음식과 물에 대한 자유로운 접근)에 따라 페어링처리되었으며 실험은 승인되었습니다. 광저우대학교 지역윤리위원회에 회부한다. 이것은 비 생존 절차입니다.

참고: 대표적인 결과에 표시된 데이터의 경우, APP/PS1(B6C3-Tg(Ap6C3-Tg) 85Dbo/J) 이중 형질전환 마우스 및 3-5개월의 리터메이트 야생형(WT) 대조군을 기록(그룹당 n=10)에 사용하였다.

1. 동물 마취 및 수술

1. 현지 동물 관리 위원회에서 승인된 마취 요법으로 마우스를 계량하고 마취합니다.
2. 수술 전에 깊은 마취를 확인하기 위해 집게로 꼬리 또는 발가락 핀치를 수행합니다.
3. 마우스를 입체 전지 장치에 놓고 머리를 고정합니다.
4. 촉촉한 유지를 위해 두 눈에 눈 연고를 바하십시오. 수술 전 및 수술 후 진통에 관한 현지 동물 관리 지침을 따르십시오.
5. 수술용 클리퍼를 사용하여 모발을 면도하십시오. 가위로 노출 된 수술 부위 의 중간에 작은 절개 (12-15mm)를 만듭니다. 집게를 사용하여 두피를 중간선에서 부드럽게 당깁니다.
6. 피부를 부드럽게 분리하고 잔류 조직을 제거합니다. 과산화수소 코팅 면봉을 사용하여 두개골을 청소합니다.
7. 두개골의 왼쪽과 오른쪽 모두에 반경 1.0-1.5 mm의 두 개의 작은 구멍을 뚫어 기록 된 미세 전극을 입체 현미경으로 M2 영역에 삽입 할 수 있습니다 (그림1A).
   참고 : 양측 M2의 입체 위치 : 브레그마에 1.94 mm 전방, 미드 라인에 1.0 mm 측면, 그리고 dura에 0.8-1.1 mm 복부.
8. 텅스텐 바늘로 경막미를 조심스럽게 제거하십시오.
9. 유리 보로실리케이트 마이크로파이펫(외경: 1.0mm)을 1-2MΩ의 저항으로 마이크로 전극을 기록합니다.
10. 기계식 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 0.5 M NaCl으로 채워진 두 개의 별도의 기록 마이크로 전극을 구멍에 삽입합니다(60°, 그림 1B).

2. 마우스의 양측 M2에 LFP 기록

1. 왼쪽 및 오른쪽 유리 전극을 양측 M2의 적절한 좌표로 천천히 낮춥니다(그림1C).
2. 품질 관리를 위해 LFP를 캡처하기 전에 차동 증폭기를 사용하여 각 전극의 저항을 테스트합니다.
3. 1,000x 증폭으로 0.1Hz 하이패스 및 1,000Hz 로우 패스로 레코딩 프로세스를 설정합니다.
4. 안정된 상태에서 적어도 60s의 자발적인 활동의 디지털화된 원시 LFP 데이터를 수집, 마취하에 초당 2 호흡의 호흡 속도로 균등하게 호흡 마우스와.
5. 기록 후, 천천히 뇌에서 전극을 제기, 다음 빠른 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.
6. 데이터를 저장하고 오프라인으로 분석합니다.

3. 상호 상관 분석

1. 분석 - 분석 소프트웨어의 파형 상관 관계를 클릭하고 데이터를 가져옵니다.
2. 매개 변수 설정
   1. 하나의 파형 채널 신호를 첫 번째 채널로 정의하고 다른 하나는 참조로 정의합니다. 너비를 2로 설정하고 간격띄우기는 1(그림2A)으로 설정합니다.
   2. 시작 시간과 종료 시간을 선택하여 두 LfP의 기간을 100초로 설정합니다. 프로세스 버튼을 눌러 상호 상관 분석을 수행합니다(그림2B).
      참고 : 이러한 기간과 동시 양측 신호는 신경 자발적 활동을 표시하기에 충분히 길어, 따라서 동기화의 기본 특성을 공개.
3. 파일 - 내보내기를클릭한 다음 결과 팝업 차트에 해당하는 상관 간 결과를 .txt 형식으로 저장합니다.
4. .txt 파일 (그림2C)을 열고, 시간 시한의 상관 값을 제거하여 0 ± 0.01 s (두 개의 연속 감마 파는 적어도 0.01 s 간격을 갖기 때문에), 음의 시간 지연 부분 또는 평균에서 나머지 상호 상관 데이터를 평균합니다. 양수 시간 지연 부분의 나머지 상호 상관 데이터입니다.

4. 일관성 분석

1. 분석 소프트웨어에서 데이터를 가져오고 실행합니다.
2. 두 LFP 신호를 제1 및 제2 파형 채널로 별도로 지정합니다. 그런 다음 블록 크기 값을 설정합니다(그림3A).
   참고: 블록 크기는 FFT에 사용되는 데이터 점수를 의미합니다. 블록 크기가 클수록 주파수 분해능이 향상됩니다. 여기서는 4096으로 설정하는 것이 좋습니다.
3. 점선을 수동으로 이동하여 두 채널의 신호에 대한 시간 정확도가 같은 기간으로 설정되도록 합니다(그림3B). 영역 추가 버튼을 눌러 영역을 로드하고 일관성 분석을 수행합니다.
4. 파일 클릭 - 저장As를 저장하여 결과 팝업 차트에 해당하는 일관성 결과를 .txt 형식(그림3B)으로저장합니다.

결과

초기 AD 병리학이 반구 측면화의 용량을 손상시키는지 확인하기 위해 APP/PS1 마우스및 WT 대조군(3-5개월 숙성)의 좌우 M2에서 양측 세포 외 LFP 기록을 실시하고 이들 좌측및 좌측및 좌측의 상호상관관계를 분석하였다. 오른쪽 LFP. WT 마우스에서, 결과는 양수 시간 시차에 좌우 LFP 사이의 평균 상관관계가 음의 시간 시차에서 그와 크게 다르다는 것을 보여주었으며, WT 컨트롤의 M2 영역에서 반구 적 비?...

토론

우리는 여기에 생체 내 양측 세포 외 기록에 대한 절차를보고, 이중 영역 LFP 신호의 동기화를 분석과 함께, 이는 모두 유연하고 뇌 반구 측면화를 추정하기 위한 수행하기 쉬운, 뿐만 아니라 연결, 방향성 또는 두 뇌 영역의 신경 활동 간의 커플링. 이것은 그룹 신경 활동뿐만 아니라 지역 간 전기 생리학의 몇 가지 기본 특성, 특히 진동 활동 이나 시스템이없는 실험실을 선별하는 데 관심이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC/DC Differential Amplifier	A-M Systems	Model 3000
Analog Digital converter	Cambridge Electronic Design Ltd.	Micro1401
Glass borosilicate micropipettes	Nanjing spring teaching experimental equipment company	161230	Outer diameter: 1.0mm
Microelectrode puller	Narishige	PC-10
NaCl	Guangzhou Chemical Reagent Factory	7647-14-5
Pin microelectrode holder	World Precision Instruments, INC.	MEH3SW10
Spike2	Cambridge Electronic Design Ltd.
Stereomicroscope	Zeiss	435064-9020-000
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68045
Urethane	Sigma-Aldrich	94300