用于阿尔韦拉尔巨噬细胞和CD4和T细胞免疫造血和HIV储液评估的支气管性洗浴液和匹配血液的处理

摘要

我们描述了一种处理支气管性肠液的方法,以及通过抗逆转录病毒疗法对慢性艾滋病毒感染者进行匹配的外周血,以评估肺艾滋病毒储存。这些方法导致获得高度纯的CD4 T细胞和海泡巨噬细胞,随后可用于免疫分型和HIV DNA/RNA定量通过超敏感聚合酶链反应。

摘要

支气管镜检查是一种医疗程序,通过支气管镜将正常的盐水注射到肺部,然后进行吸管,去除支气管皮浴液(BAL)液体。BAL流体富含细胞,因此可以提供肺免疫环境的"快照"。CD4 T细胞是HIV储层中的最佳特征,同时有强有力的证据表明,组织巨噬细胞,包括海泡巨噬细胞(AM),也作为病毒储存库。然而,在建立和维持艾滋病毒水库方面,AM的作用仍不得而知。因此,开发一种处理BAL流体的方案,以获得可用于病毒学和免疫学测定的细胞,以表征和评估肺内的细胞群和子集,对于理解肺作为HIV的作用具有相关性储 层。在这里,我们描述了这样的协议,采用标准技术,如简单的离心和流式细胞仪。CD4 T细胞和AM可用于后续应用,包括免疫分光和HIVDNA和RNA定量。

引言

治疗艾滋病毒感染所面临的最重要的挑战之一是潜在的HIV储存库的存在,在抗逆转录病毒疗法(ART)1、2中断后,导致血浆病毒血症反弹。虽然长期抗逆转录病毒疗法期间的HIV储存库在若干组织隔间中都有详细记录,包括继发性淋巴器官、肠道相关淋巴组织(GALT)和中枢神经系统(CNS),但肺作为研究领域被忽视自前抗逆转录病毒时代3。然而,肺部在艾滋病毒的发病机制中起着核心作用。事实上,肺症状是艾滋病相关机会性感染的第一个指标4。即使在现代抗逆转录病毒疗法时代,艾滋病毒感染者患传染性和非传染性肺病的风险也比没有艾滋病毒的人大。例如,艾滋病毒感染者感染肺炎链球菌侵入性感染以及慢性阻塞性肺病(COPD)5、6 ) 的风险较高。此外,结核病和艾滋病毒的合并感染是世界某些地区,特别是撒哈拉以南非洲的一个重大公共卫生挑战,因为艾滋病毒感染者患结核病的可能性是没有^{艾滋病毒7}的人的16至27倍。虽然已经提出了8、9、10这种易感于肺部感染和慢性疾病的一些解释,但HIV感染者的精确细胞机制血浆病毒载量仍然较高,肺并发症的风险尚未完全阐明。重要的是,HIV是肺部感染和慢性疾病的一个很强的危险因素,与吸烟状态无关。

因此,分析肺部的免疫环境对于了解其在健康和疾病中的作用至关重要。虽然非侵入性、诱导性痰样本往往含有大量上皮细胞和碎屑,且含有罕见的肺淋巴细胞,且无 AM,因此其作用仅限于特定应用。相反,在没有疑似疾病的情况下,由于有大出血和肺气肿(肺衰竭)的相关风险,无法进行组织大活检。此外,大多数肺免疫细胞主要位于粘膜水平,在呼吸过程中,肺在呼吸过程中不断受到抗原的刺激。为此,获得BAL流体的支气管镜检查具有为淋巴细胞和AM提供相对安全访问的优势(见图1)。 巨噬细胞在BAL流体中构成最大的细胞比例,其次是淋巴^细胞11。因此,建立一种处理BAL液体以用于后续应用的方法非常有用,例如免疫分体、细胞培养、转录组学或任何其他应用。此处概述的处理 BAL 流体的协议根据之前描述和优化的各种下游检测的一般程序进行了调整。这种方法允许分离肺淋巴和骨髓粘膜免疫细胞,使其表象和功能表征,以及评估艾滋病毒携带者成人的艾滋病毒储存库。

为了建立这个协议,我们使用以下标准来招募15名学习参与者。要获得参与这项研究的资格,他们必须是符合以下标准的艾滋病毒感染者:(1) 抗逆转录病毒疗法至少3年;(2) 抗逆转录病毒疗法,至少3年;(3) 抗逆转录病毒疗法,3年以上;(3) 抗逆转录病毒疗法,在抗逆转录病毒疗法中至少3年。(3) 参加抗逆转录病毒疗法,至少3年;(3) 参加抗逆转录病毒疗法,至少3年。(3) 参加抗逆转录病毒疗法至少3年(2) 抑制病毒载量 (VL) 至少 3 年;(3) CD4 T 细胞计数为 +200/mm^3;(4)愿意接受研究性肺科和支气管镜检查。有以下标准的患者被排除在研究之外:(1)对支气管镜的禁忌症;(2)高出血风险:凝血病或华法林或氯匹格雷治疗;(3)血小板减少症(低血小板);(4)主动性肺感染或其他急性脉动过程;(5) 怀孕/试图怀孕。

研究方案

该研究议定书直接基于《赫尔辛基宣言》中的原则,并得到了麦吉尔大学健康中心机构审查委员会(RI-MUHC,#15-031、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、北京大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、北京大学、北京大学、魁北克大学、魁北克大学、北京大学、魁北克大学、北京大学、北京大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克大学、魁北克蒙特利尔(QAM,#602)和蒙特利尔大学中心(CR-CHUM,#15-180)。

1. 支气管活拉·拉瓦奇

注:本节介绍由持牌呼吸学家在呼吸^{治疗师16、17}的协助下进行的支气管镜检查。

1. 准备手术所需的器件,包括支气管镜和盐水。给病人的喉咙后部施药喷雾。尽可能避免过度使用局部麻醉。将心脏引线涂抹到胸部,以监测心率和节律,并在手的第一根手指上使用氧气探针,以监测氧饱和度。将鼻管插入鼻孔,以提供补充氧气。
2. 将患者置于上位位置。在呼吸学家或麻醉师在场的情况下,静脉注射镇药 0.01-0.04 毫克/千克和芬太尼 50-100 μg(以方便患者舒适和尽量减少咳嗽反射)。
3. 推进柔性支气管镜,直到将其楔入所需的亚段支气管。用注射器注射盐水(每次50-60 mL),然后轻轻吸(50-80毫米汞柱)。洗漱液将收集在注射器中,然后转移到收集容器。
4. 重复刷新至总计 200-300 mL 的洗漱。如果可能,收集至少 100 mL 的 BAL 液体。
5. 将 BAL 液体放在冰上。

2. BAL细胞的隔离

注:必须在 II 级 (BSL2) 或更高级别的生物安全柜无菌条件下执行以下程序。

1. 将 BAL 样品保存在冰上,直到处理。
   1. 将 BAL 在原始收集管中涡旋,并使用血清移液器将其转移到 50 mL 管中。如果 BAL 液体出现非常浑浊或被丝状组织污染,则通过 70 μm 尼龙网状过滤器将液体过滤到新的 50 mL 管中。
   2. 在 200 x g下在 4°C 下离心 10 分钟。将上清液转移到新的 50 mL 管中。用移液器尖端轻轻分解颗粒,并将其重新悬浮在 1 mL 的 RPMI 1640 介质中。
   3. 将1 mL的上清液转移到10x 1.5 mL微离心管中,将剩余的上清液转移到15 mL管,每个管10 mL。将所有上清管储存在-80°C。
2. 处理BAL细胞颗粒。
   1. 将颗粒重新悬浮在 10 mL 的 RPMI 1640 中,每 25 mL 的原始样品。在 200 x g下在 4°C 下离心 10 分钟。将上清液转移到新的 15 mL 管(在确保颗粒中有足够的细胞后丢弃)。
   2. 在 RPMI 1640 + 10% 胎儿牛血清 (FBS) 中重新悬浮颗粒,并使用锥体蓝色和血细胞计计数。
      注:如果 BAL 流体在分拣前没有通过细胞的粘附分离,则继续执行第 4 节。

3. BAL细胞的依从性(可选)

注:此替代协议可以在或代替单元排序之前执行。必须在 BSL2 机柜(或更高版本)的无菌条件下执行以下步骤。

1. 将所需数量的 BAL 细胞分拣到新的 15 mL 管中,并组成 1.5 x 10⁶巨噬细胞/mL 的正确体积。在6孔板中每孔2mL的电池板,在37°C下孵育2小时,CO 2%,以留出时间粘附。
2. 孵育后,小心吸出含有非粘附细胞的培养剂,并将其转移到15 mL管中。在室温 (RT) 下以 300 x g离心 10 分钟。在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 2 % FBS 中,在 1 x 10⁷细胞/mL 处去除上清液并重新悬浮,并将悬浮液转移到 5 mL 圆底聚苯乙烯管中。这个淋巴细胞部分现在准备染色细胞排序。
3. 在板中剩余的粘附细胞中,每孔加入1 mL细胞分离溶液(见材料表),在37°C下孵育至少15分钟,CO2为5%,直到细胞用移液器尖端从板中轻松分离。
4. 使用移液器尖端轻轻但彻底地刮取井面上的粘附细胞,并使用井中的 1 mL 液体帮助分离。将细胞转移到新的15 mL管中。用 1 mL 的 PBS 清洗水井,并将其添加到同一管中。使用 PBS 将管的含量组成为 5 mL。
5. 在RT下以300 x g离心10分钟,去除上清液,在1 x 10⁷细胞/mL PBS = 2%FBS处重新悬浮,并将悬浮液转移到5mL圆底聚苯乙烯管中。这种骨髓部分现在准备染色细胞分类。

4. 外周血单核细胞的分离

注:必须在 BSL2 机柜(或更高版本)的无菌条件下执行以下步骤。

1. 在支气管镜检查的同一天(一般直接在BAL收集之前),从乙二胺乙酸(EDTA)管(每管约10 mL)的供体获得六管静脉血管。
2. 在RT处,在300 x g下离心将血管分离15分钟。将血浆转移到1mL等分管中1.5 mL微离心管,并将其储存在-80°C。
3. 执行密度梯度分离。
   1. 在每个血管中加入 2 mL 的 RPMI 1640,并使用血清移液器混合均匀。
   2. 转移到 3x 50 mL 管,并使用 RPMI 1640 将每个管的体积增加到 25 mL。
   3. 在RT处准备另一批3x 50 mL管,每根管含有20 mL淋巴细胞分离介质(LSM)(见材料表)。缓慢而轻轻地将25 mL稀释的血液在三管的LSM顶部,将管保持45°角.
   4. 在 RT 下以 600 x g离心 25 分钟,加速度低且无减速(制动器关闭)。
4. 对外周血单核细胞(PBMC)进行清洗。
   1. 使用血清移液器将管中两个液相界面处的细胞层转移到50 mL管中;如果体积超过30 mL,将其分成两管。使用 PBS 将每个管的体积增加到 50 mL。
   2. 在 RT 下以 700 x g离心 5 分钟,并尽可能去除上清液。
   3. 用PBS重新悬浮颗粒,将体积补至25 mL。在 RT 下以 350 x g离心 10 分钟,并尽可能去除上清液。
   4. 重复步骤 4.4.3 中描述的洗涤步骤。
   5. 将颗粒悬浮在 PBS 的 5 mL = 2% FBS 中,并计算细胞数。

5. 对整个 BAL 细胞和 PBMC 进行排序

注:必须在 BSL2(或更高版本)的无菌条件下执行以下步骤。

1. 准备包含 PBS = 5% FBS = 25 mM HEPES (pH 7.4) 的分拣缓冲液。准备 5 mL 圆底聚苯乙烯管,带 1 mL FBS,用于收集已排序的细胞子集。
2. 执行染色。
   1. 准备3x 5 mL圆底聚苯乙烯管,每个管用于BAL(粘附后全细胞或淋巴细胞和骨髓分馏)和PBMC(见第4节)。对于每个子集,准备一个带细胞的管进行分拣,并准备两个5 x 10⁵细胞管,用于无染色和可存活的染色补偿控制。
   2. 在 350 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。取出上生子,将细胞重新悬浮在 100 μL PBS 中的对照组,并将其存储在 4°C,直到补偿控制可以像步骤 5.2.6 中所述进行准备。
   3. 在PBS = 5%FBS中制备Fc受体(FcR)阻断试剂的1:20稀释(参见材料表- 以防止在FcR表达细胞上抗体与FcR的非特异性结合)。在250μL的FcR阻断混合物中,重新悬浮细胞,以1 x10⁷细胞对细胞进行分类。在4°C下孵育1小时。
   4. 孵育后,将适当的抗体鸡尾酒(见表1)加入细胞,在黑暗中4°C孵育1小时。
   5. 染色1小时后,在细胞中加入1 mL的PBS,并在350 x g下在4°C下离心5分钟。在分拣缓冲液中去除上清液并重新悬浮细胞,使其在250 μL中具有1 x 10⁷个细胞。如果需要,通过70μm过滤器过滤细胞。
   6. 准备薪酬控制。
      1. 在微离心管中每1mL的PBS中,每增加三滴抗小鼠Ig、α和负控制补偿珠(见材料表),并将100μL转移到每根5mL圆底聚苯乙烯管中用于补偿。为鸡尾酒中每种含氟铬准备一根管子。要使用。
      2. 在鸡尾酒中加入1μL的每种抗体,加入含有珠子的不同管中。在步骤 5.2.1 中留出的 5 x 10⁵细胞的管中添加 1 μL 的可存活性染色。在黑暗中4°C孵育20分钟。
      3. 在每个管中加入1 mL的PBS,并在4°C下以350 x g离心5分钟。去除上清液,在250μL的PBS中重新悬浮颗粒。在黑暗中储存在4°C,直到需要为止。
   7. 通过荧光活性细胞分拣(FACS)将细胞分类成用1mL FBS制备的收集管,轻轻旋转,用血清涂覆管的两侧。
      1. 在低压下对 BAL 细胞进行排序。门单元首先排除噪声,包括活的CD45+细胞,并在此总体门内出双容单元(见图3)。 在较大的骨髓群中,CD206和CD169双阳性细胞作为AM;在较小的淋巴细胞群中分离CD3+细胞,并分拣CD4和CD8的单阳性种群(参见图3;在代表性结果部分详述的浇注策略)。
      2. 对 PBMC 进行排序时,门单元首先排除噪声,并包括活的 CD45⁺单元,并在此总体门内出双精度单元。接下来,在CD3细胞和CD3^-总体内的门,首先在CD14上对单阳性单核细胞进行门,然后在CD3和CD8上的CD3+总体门内对两个阳性群体进行排序(门控策略详于代表性结果部分。

6. AM 和 PBMC 的免疫分量

注:必须在 BSL2 机柜(或更高版本)的无菌条件下执行以下步骤。

1. 将每个 AM 和 PBMC 各加 100 万个,以两个独立的 5 mL 圆底聚苯乙烯管。在 300 x g下在 4°C 下离心 5 分钟,并去除上清液。
2. 执行 FcR 阻断以提高抗体染色的特异性。为此,在PBS的100μL中重新悬浮细胞= 2%FBS,并加入1.4μL的FcR阻断试剂。在 4 ^oC 下孵育 20 分钟。
3. 执行细胞外染色。
   1. 使用FcR块孵育后,加入所需的细胞外抗体鸡尾酒,涡旋管,在黑暗中4°C孵育1小时。
   2. 在4°C下加入500μL的PBS和在350 x g下离心5分钟,洗涤2倍。
4. 准备固定和渗透(参见所用特定试剂的材料表)。
   1. 使用 1 部分渗透缓冲液和 3 部分稀释缓冲液制备渗透溶液。将颗粒重新悬浮在1 mL的渗透溶液中,在黑暗中4°C下孵育40分钟。
   2. 使用1部分洗涤缓冲液和4部分H₂O制备洗涤溶液,将2 mL的洗涤溶液添加到渗透细胞中,并在350 x g下在4°C下离心5分钟。拆下上清液。
5. 执行细胞内染色。
   1. 在100μL的1倍洗涤溶液中重新悬浮细胞,加入所需的细胞内抗体,涡旋管,在黑暗中4°C孵育至少1小时。
   2. 在RT处加入2 mL的洗涤溶液和以350 x g的离心机5分钟。去除上清液,在200 μL的PBS中重新悬浮颗粒。将细胞储存在黑暗中4°C,直到需要为止。

7. BAL细胞的剩余部分

注:必须在 BSL2 机柜(或更高版本)的无菌条件下执行以下步骤。

1. 细胞数允许,冷冻保存来自BAL细胞颗粒的活细胞(从步骤2.2.2开始)。
   1. 制备含有 90% FBS + 10% 二甲基亚硫酸盐 (DMSO) 的冷冻介质。
   2. 在4°C下以300 x g将细胞离心10分钟。取出上清液,在低温小瓶中重新悬浮在1.5 mL的冷冻介质中。将低温小瓶转移到受控速率冷冻容器(参见材料表),并将其置于-80°C。温度达到一度,将细胞转移到液氮中,以便长期储存。
2. 将 BAL 细胞保留为干颗粒。
   1. 将剩余的细胞转移到1.5 mL微离心管中。在反顶离心机中以6,000 x g离心1分钟,在不干扰颗粒的情况下,尽可能去除上清液。将颗粒储存在-80°C。

8. 艾滋病毒DNA和RNA定量

注:必须在 BSL2 机柜(或更高版本)的无菌条件下执行以下步骤。

1. 艾滋病毒DNA定量总数
   1. 为了避免对BAL解糖碎片的聚合酶链反应(PCR)的抑制,使用DNA提取试剂盒(见材料表)根据制造商的说明从BAL细胞样本中提取DNA。在下面描述的预扩增步骤(步骤8.1.3)中,将15μL的DNA与主混合物结合使用。
   2. 准备标准曲线稀释。
      1. 如上所述,使用DNA提取试剂盒从2 x 10⁶ ACH-2细胞的颗粒中提取DNA(见材料表)。
      2. 脱氧核糖核酸洗脱后,对ACH-2 DNA进行连续10倍稀释,产生6个稀释,范围从3 x10⁵细胞到每15μL3个细胞。
   3. 执行预放大步骤。
      1. 在单独的房间中,为n = 2 个样品准备主混合物,包括 1x 聚合酶缓冲液、3 mM MgCl 2、300 μM dNTP 和 2.5 U的 Taq DNA 聚合酶(参见材料表)和 4 种引物中各 300 nM(参见步骤 8.1.3.2)。在三联井中执行所有测量。
      2. 使用引种hCD3OUT5'、hCD3OUT3'、ULF1和UR1从人类CD3和HIV中生成扩增DNA(见表2中的序列)。请注意,两个基因都在同一管中预扩。轻轻混合,然后向下旋转管,以确保完全混合。
      3. 在 96 孔 PCR 板中每孔分配 35 μL 的主混合物,并添加 15 μL 的标准或样本 DNA。总反应体积为50μL。
      4. 执行预放大(在 95°C 下变性 8 分钟,然后 12 个循环 95°C 1 分钟,55°C 为 40 秒,72°C 为 1 分钟,在 72°C 下伸长 15 分钟)。
   4. 执行实时 PCR。
      1. 要量化CD3和HIVDNA,准备两个含有1xPCR反应主混合物(见材料表)、1,250 nM适当引物和100 nM探针的主混合物。使用引体HCD3IN5'和HCD3IN3'和探针CD3FamZen在一次反应中量化人类CD3,引引UR2和LambdaT和探针UHIV FamZen在另一种反应中量化HIVDNA(见表2中的序列)。在qPCR适应管中分配每个混合物的13.6μL。
      2. 在无菌水中、DNase、RNase和蛋白酶中,在1:10稀释预扩增PCR产物。将每个稀释样品的6.4 μL加入qPCR组合的13.6 μLqPCR混合物中,在qPCR适应管中,总反应体积为20μL。
      3. 使用以下程序执行实时 PCR:在 95°C 下变性 4 分钟,40 个 95°C 周期,3 秒,60°C,单次采集 10 秒。
      4. 从标准曲线中推断每个反应管中的HIV拷贝和数细胞等效数。计算艾滋病毒DNA拷贝/10⁶个细胞的数量。
2. HIV RNA 定量
   1. 根据制造商的说明,使用RNA提取试剂盒(见材料表)从BAL细胞样本中提取RNA。在下面描述的逆转录和预扩增步骤中使用此RNA的17μL(步骤8.2.4)。
   2. 在体外合成并精确量化的LTR-gag RNA作为标准使用;它被刺入健康的供体RNA提取物,用于GUSB规范化。制备6个连续10倍稀释本标准,对应3 x 10⁵细胞到3个副本的LTR-gag RNA在17μL。
   3. 在96孔PCR板中分配每个标准稀释剂的17μL和每个样品,并在25°C下用DNase(见材料表)处理样品10分钟,以去除污染物基因组DNA。加入2μL的25 mM EDTA,在65°C下孵育样品10分钟,停止反应。
   4. 执行逆转录 (RT) 和预放大 PCR。
      1. 根据制造商的说明,使用一步式 RT-PCR 套件执行此步骤(参见材料表)。使用引源GUSB正向1,GUSB反向1,UR1和ULF1从人类GUSB生成扩增的cDNA作为内务管理基因和LTR-gagHIVRNA(见表2中的序列)。GUSB 值将用于使艾滋病毒值规范化。
      2. 在同一96孔PCR板中,将每孔31μL的主混合物分配,该板含有DNase处理的标准和样品,并混合良好。总反应体积为50μL。
      3. 根据制造商的说明运行板 16 个周期,退火温度为 55°C。
   5. 执行实时 PCR。
      1. 准备两个主混合物,其中包含 1x PCR 反应主混合物(如步骤 8.1.4.1 中的上文)、1250 nM 适当的引物和 100 nM 探针。使用引基GUSB正向2,GUSB反向2,并探针GUSB-HEX在一个反应中量化GUSB cDNA;使用引基器UR2、LambdaT和探针UHIV FamZen在另一种反应中量化HIV cDNA(参见表2中的序列)。
      2. 在qPCR自适应管中分配每个主混合物的13.6 μL。在无菌水中稀释RT预扩增PCR产物1:10,无DNase、RNase和蛋白酶,并将每个稀释样品或标准中的6.4μL添加到适当的PCR混合物中。总反应体积为20μL。
      3. 使用以下程序执行实时 PCR:在 95°C 下变性 4 分钟,40 个循环 95°C,3 秒,60°C,单次采集 10 秒(选择 FamZen 绿色通道,为 HEX 选择黄色)。

结果

在大多数不吸烟者中,BAL液体在无菌容器中接收,是一种略浑浊的黄橙色液体。如果供体在支气管镜检查期间进行内囊活检,并且发生了一些出血,则液体的颜色可能更粉红。如果捐赠者是吸烟者,液体的颜色可能较深。离心后,BAL 上清液几乎清晰,略带橙色,而细胞颗粒的颜色范围从白色到非常深棕色,具体取决于样品的状况以及捐赠者是否是吸烟者。

在计算整个BAL样本时,可以可视化不同的细胞类型,包括直径约17μm的较大圆形巨噬细胞和直径为7.3μm的较小圆形淋巴细胞(见图2)。 巨噬细胞在吸烟者中扩大约40%18。细胞类型之间的区别允许单独计算巨噬细胞和淋巴细胞。现场可能也可以看到一些碎片,特别是在吸烟者的样品中。巨噬细胞是BAL中最丰富的细胞类型,在非^吸烟者20中约占85%,它们在吸烟者中丰富,因此看起来几乎排他性。

BAL 细胞具有聚合的倾向,因此在所有操作过程中必须很好地混合它们。即使经过几次洗涤步骤,颗粒也可能显得黑暗。如果在为细胞分拣染色后,在馏分中明显有丝状碎片,则先通过70μm过滤器将细胞通过,然后再通过细胞分拣机。

BAL细胞的分拣必须在低压下进行,以确保水滴大小足以容纳巨噬细胞。首先对细胞进行门控,以包括所有CD45⁺²¹个细胞,然后根据可行性确保所有死细胞被排除(参见图3)。然后选择单细胞,在此,两个群体根据大小和形态进行封闭,即较大的骨髓细胞和较小的淋巴细胞(见图3)。 在较大的细胞内,细胞在CD206^22、23和CD169²²上封闭,双阳性细胞被分类为AM,而在较小的细胞中,CD3⁺细胞被选择并在CD4和CD8上封闭;CD4 单阳性和 CD8 单阳性细胞排序(参见图 3)。使用的标记是根据先前描述的AM表型选择的,如在噬^细胞23中发现的曼诺感受体CD206和西亚洛丁受体CD169^22。

对 PBMC 进行排序时,首先将细胞封闭在正向和侧散射上,该群体应显示均质淋巴细胞总体,所有这些群体均被采集,不包括接近零轴的噪声(未显示数据)。总体在活力和CD45上封闭,并使用活CD45+细胞。然后,该人口在 CD3 上进行封闭;为了分离单核细胞,CD3^-总体随后在CD14上被封闭,并且对所有单个阳性细胞进行排序.为了分离淋巴细胞子集,CD3⁺细胞在CD4和CD8上封闭,对单个阳性和细胞群进行排序。

图 1:协议概述。显示协议的工作流的示意图,包括生成的样本的潜在下游用途。PBMC = 外周血单核细胞;BAL = 支气管静脉洗漱;LSM = 淋巴细胞分离培养基。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:整个BAL流体的显微镜场视图。来自 (A) 非吸烟者和 (B) 吸烟者具有可见淋巴细胞 (L)、巨噬细胞 (M) 和红血球 (RBC) 的显微镜图像.放大率为 1,000 倍(10 倍眼部和 100 倍镜头,带油浸)。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:代表门控策略,用于整个 BAL 细胞的细胞分类。用于从整个 BAL 细胞样本中对球泡巨噬细胞 (AM)、CD4 和 CD8 T 细胞进行排序的浇注策略。请点击此处查看此图的较大版本。

样品	抗体	氟铬	克隆	每个测试的体积 (μL)
巴尔和PBMC	活/死	APC-H7	-	1
	CD45	PE-Cy7	HI30	5
	CD3	亚历克萨700	UCHT1	2
	CD4	PE-cy5	RPA-T4	4
	CD8	BV605	SK1	3
仅限 BAL	CD206	体育	19.2	10
	CD169	BB515	7-239	5
仅限 PBMC	CD14	BV786	M5E2	5

表1:用于对整个BAL细胞和分离的PBMC进行分类的流面板。

目标	步	引种名称	引种序列
艾滋病毒总DNA或HIV LTR-Gag RNA	预扩增PCR	UR1	5'-CCA TCT TCC TTC TTC TAG C-3'
		ULF1	5' - ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT TCT TG TGG TGG TGG TTA GAC-3'
	实时PCR	UR2	5'-CTG AGG GAT 反恐塔塔塔 CC-3'
		兰姆达特	5' -ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'
		UHIV FamZen:	5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3'
CD3 DNA	预扩增PCR	HCD3 出 5'	5' - ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'
		HCD3 出 3'	5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3'
	实时PCR	HCD3 在 5'	5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3'
		HCD 3 in 3'	5'-CCT CTC AGC CAT TTA AGT A-3'
		CD3 法姆森:	5'//56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCA T/3IABkFQ/-3'
GUSB RNA	预扩增PCR	GUSB 转发 1:	5'-ACC TAG AAT CTG CTT ACT A-3'
		GUSB 反向 1:	5'- GTT CAA ACA GAT CAC ATC ATA C-3'
	实时PCR	GUSB 转发 2:	5' - TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3'
		GUSB 反向 2:	5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3'
		GUSB-HEX:	5'-/5HEX/TCGCCACA/ZEN/CCAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'

表2:HIVDNA和RNA定量的引因和探针序列。

讨论

本文描述了一种处理BAL流体的方法,以获得CD4 T细胞和AM,以及匹配的PBMC,可以研究研究肺部的HIV储层。我们最近从匹配的外周血和BAL样本中报告了CD4 T细胞中的HIVDNA定量,我们的研究小组证明,肺CD4 T细胞中的HIV含量是外周^{血15细胞的13}倍。然而,AM中的HIVDNA水平是供体的,因此,到目前为止,淋巴细胞中的HIVDNA水平与巨噬^细胞15相比没有一致的相关性。然而,获得这些主要巨噬细胞子集将是一个重要工具,可以询问这个问题,并在艾滋病毒储存中更好地了解肺部的病毒载量。

在抗逆转录病毒前和其他几个使用BAL流体的研究中,参与者进行支气管镜检查,以诊断疑似病理或获得呼吸道^症状3的微生物诊断。然而,我们能够招募参与者没有任何活跃的肺症状或疾病,所有参与者签署了道德同意^表15。我们能够从我们中心招募参与其他研究的参与者,例如阻塞性^肺病24的肺活量检测研究,以及那些进行其他研究程序,如白血病和结肠 镜 检查。先前对艾滋病毒感染者的研究表明,利他主义是促使人们参与研究的一^{个关键因素。}与许多人类标本一样,我们注意到了大量的人对人变异性。没有办法"预测"我们从哪些参与者获得BAL与良好的或较差的细胞产量。与外周血不同,外周血产生相当一致的淋巴细胞数量,BAL液体中的细胞数量非常多变。向肺部注入更大的正常盐水(希望获得 BAL 液体的更大回报)并不总是可能的,因为大体积的正常盐水通常与更多的咳嗽和较高的发烧后胸腔镜检查风险相关。我们注意到,使用直径较小(而不是更大的)支气管镜,使呼吸学家能够深入到支气管中,获得含有更多细胞的液体。一项一致的发现是,吸烟者在BAL液体中具有比淋巴细胞大得多的AM比例,预计当AM吞没碎片和颗粒物时,这种水平会更大。此外,我们观察到,来自吸烟者的BAL液体含有碎片,这些碎片可能会阻塞所使用的设备,如PCR机器和流式细胞计。在高污染地区或更频繁地暴露于空气质量差的个人,也可能发现类似的问题。

关于它们在建立艾滋病毒储存库和病毒持久性方面的作用,CD4 T细胞和AM的纯度是一个关键考虑因素。因此,我们选择使用荧光活性细胞分类(FACS)来获得高纯细胞群。收集的BAL液体也可能被血液污染,因为在支气管镜检查期间,预计会有轻微的出血;天真的B细胞的存在将表明这一点,细胞可以在红细胞流液缓冲液中洗涤,以规避这个问题。研究BAL流体的另一个挑战涉及量化炎症标记和细胞因子,这对理解HIV的^持久性26很重要。由于灌输的盐水稀释BAL液体,炎症中介和细胞因子的水平可能难以测量。虽然已经提出了尿素校正因子来解释稀释,但描述其用途的文献^{相对较少。}

AM 是高度自荧光的,这在细胞分选和流式细胞学型型分析中带来了问题。特别是,这种影响在吸烟者中更为明显,他们的AM可能完全呈黑色,显著影响他们的自荧光。当被标准蓝色488nm激光激发时,AM自荧光处于峰值约540nm,与常用偶联物(如FITC和PE29、30)的荧光光谱重叠。值得注意的是,可以使用两个独立的激光来激发 FITC 和 PE(例如,蓝色 488 激光的 PE 和 FITC)。为了克服 FITC 固有的自发光,我们使用未染色的 AM 来确定自荧光背景。此外,使用荧光减1(FMO)控制对于解决这些技术问题非常有用。较大的珠子(例如7.5 μm)可用于补偿巨噬细胞种群,而较小的珠子(例如3.0 μm)则更紧密,可用于补偿淋巴细胞种群。更合适的方法是使用一小部分细胞作为单染色控制,在子集上使用已知的、高度表达的标记,如HLA-DR或CD45,与每个所需的氟铬结合,这将允许更多准确的补偿比珠子可以实现的。对于吸烟者的样本,这种策略是特别有用的,因为巨噬细胞是更大,更多的自荧光。此外,从制备步骤开始,整个BAL样本可以在一个板中培养,然后按协议第3节所述进行分拣,以便通过依从来分离种群。这样,粘附巨噬细胞可以从其他非粘附细胞(如淋巴细胞)中分离出来。如果淋巴细胞和AM种群被分离,而不是一起检查,补偿就不那么具有挑战性了;然而,依靠依从将导致巨噬细胞的损失,这是当细胞数已经限制时的重要考虑因素。此外,依从步骤可能导致粘附单核细胞的意外激活,这可能会影响使用这些细胞生成的下游结果。有效分类细胞到更纯净的种群的价值必须权衡与限制有更少的这样的细胞为后续实验。

其他模型,最显著的是鼠类模型,已经被用来研究巨噬菌体免疫特性和生物学。虽然这些模型非常有用,并且允许深入了解难以操作的单元格类型,但它们有局限性。许多细胞表面标记在小鼠和人类之间不同,因此人类AM的免疫表型并不完全被理解。然而,由于每种动物的细胞数量较低,该模型系统需要将几只小鼠汇集在一起进行检测。此外,必须汇集标本,排除了对遗传倾向和性别的考虑。最近,由于限制因子SAMHD-1³¹的不同表达,性别在HIV-1对巨噬细胞的传染性中起着一定的作用。非人类灵长类动物(NHP)是最接近人类的模型,有助于研究模拟免疫缺陷病毒(SIV)感染及其对免疫系统的影响,从而深入了解组织派驻巨噬细胞与单细胞衍生巨噬细胞。在河河猴中,也表明肺巨噬菌体从BAL中分离出一种具有复制能力的病毒;病毒生长测定(VOA)用于分析SIV在组织驻留^细胞32中的行为。这一发现具有重要的研究价值,但在应用之前,仍必须在人类身上进行验证,而且使用NHPs的高成本排除了大量样本群的使用。此外,人类AM将可用于许多其他应用,如体外病毒/微生物感染检测,以及研究其他病原体,如结核病/艾滋病毒合并感染。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm Sterile Cell Strainer	Fisher Scientific	22363548	Nylon mesh filters with 70 µm pores to remove impurities from BAL sample before sorting
ACH-2 Cells	NIH	349	HIV-1 latent T cell clone with one integrated proviral copy which do not express CD4
BD FACSAria	BD Biosciences	N/A	Cell sorter (configured to detect 16 colours simultaneously)
BD LSRFortessa X-20	BD Biosciences	N/A	Flow cytometer (configured to detect 14 colours simultaneously)
Bronchoscope	Olympus	BF-1TH190	EEIII HD therapeutic bronchoscope; channel width 2.8 mm; outer diameter 6.0 mm
Cell Disassociation Solution	Sigma	C5914	Non-enzymatic formulation for gently dislodging adherent cell types from plastic or glass surfaces.
CD169  BB515	BD Biosciences	565353	Sialic acid-binding molecule antibody used for flow cytometry
CD14  BV786	BD Biosciences	563698	Endotoxin receptor antibody used for flow cytometry
CD206  PE	BD Biosciences	555954	Mannose receptor antibody used for flow cytometry
CD3  Alexa700	BD Biosciences	557943	T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD4  PE-Cy5	BD Biosciences	555348	T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CD45  PE Cy-7	BD Biosciences	557748	Receptor-linked protein tyrosine phosphatase antibody used for flow cytometry
CD8  BV605	BD Biosciences	564116	T cell co-receptor antibody used for flow cytometry
CompBead Plus	BD	560497	Anti-mouse  Ig, κ  and negative control polystyrene microparticles used to optimize fluorescence compensation in flow cytometry
DNase I	Invitrogen	18068015	Digests single- and double-stranded DNA to oligodexyribonuleotides containing a 5' phosphate to remove contamination from RNA
dNTP Set 100 mM	Invitrogen	10297-018	Consists of four deoxynucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) for use in PCR
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Apolar, protic solvent used to make media for cryopreserving live cells
EDTA	Invitrogen	AM9912	Used to stop Dnase I enzyme activity
FBS	Wisent Bioproducts	080-150	Premium fetal bovine serum to supplement media
FcR Blocking Reagent, Human	Miltenyi	130-059-901	Binds to Fc receptor on the cell surface to prevent non-specific binding of flow antibodies
FlowJo v10	FlowJo LLC	N/A	Flow cytometry analysis software used for all analyses
HLA-DR  BV650	BD Biosciences	564231	MHC class II cell surface receptor antibody used for flow cytometry
HyClone HEPES solution	Fisher Scientific	SH3023701	Buffer providing maintenance of physiological pH
Live/Dead  APC-H7	Invitrogen	L34975	Viability marker used for flow cytometry
Lymphocyte Separation Medium (LSM)	Wisent Bioproducts	350-000-CL	Polysucrose for isolation of PBMC from whole blood
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001	Freezing container ensuring rate of cooling very close to -1 °C/min, the optimal rate for cell preservation
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-41	Anti-mouse, rat and hamster antibodies for compensation of PBMC samples
PBS 1x	Wisent Bioproducts	311-010-CL	Phosphate buffered saline for cell washing and staining
PCR Tubes Corbett Rotor-Gene	Axygen	PCR-0104-C	4-strip PCR tubes with 0.1 mL capacity for use with Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMix	Quantabio	95112	2x concentrated ready-to-use reaction cocktail for PCR amplification of DNA templates
QiaAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	Kit for isolation of genomic, mitochondrial, bacterial, parasite or viral DNA. Includes QIAamp Mini Spin Columns, QIAGEN Proteinase K, Reagents, Buffers, Collection Tubes
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Kit for purification of up to 100 µg total RNA from cells, tissues, and yeast. Includes RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes, RNase-free Reagents and Buffers
Rotor-Gene Q	Qiagen	9001550	Real-time PCR cycler
RPMI 1640 1x	Wisent Bioproducts	350-000-CL	Cell culture media
Sterile Water	Wisent Bioproducts	809-115-CL	DNase, RNase & protease free
Superscript™ III One-Step RT-PCR System	Invitrogen	12574018	RT-PCR kit which performs both cDNA synthesis and PCR amplification in a single tube. Includes SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (containing 0.4 mM of each dNTP, 3.2 mM MgSO4), magnesium sulfate
Taq DNA Polymerase	Invitrogen	18038-042	Thermostable enzyme that synthesizes DNA from single-stranded templates in the presence of dNTPs and a primer. Includes Taq DNA Polymerase, 10x PCR buffer, magnesium chloride
Transcription Factor Buffer Set	BD Biosciences	562725	Buffers for intracellular staining for flow cytometry. Includes fixation/permeabilization buffer, diluent buffer, perm/wash buffer
Trypan Blue	Sigma	T8154	Viability dye to count cells using haemacytometer