工程生物膜的三维造型

摘要

本文介绍了一种将低成本商用3D 打印机转换为细菌3D 打印机的方法, 该打印机可促进图案生物膜的打印。介绍了制备生物打印机和生物油墨的所有必要方面, 以及评估生物膜形成的验证方法。

摘要

生物膜是细菌的集合体, 嵌入在自产生的空间模式的细胞外基质中。生物膜内的细菌会产生增强的抗生素耐药性, 这对健康构成潜在的危害, 但也可能有利于环境应用, 如饮用水的净化。抗菌疗法和生物膜启发应用的进一步发展将需要开发可重复的、可工程化的生物膜制造方法。近年来, 一种利用改进型三维 (3D) 打印机制备细菌油墨的生物膜的新方法。本文介绍了构建这种高效、低成本的3D 生物打印机所需的步骤, 它在细菌诱导材料加工中提供多种应用。该协议从一个经过调整的商用3D 打印机开始, 在这种打印机中, 挤出机已被连接到注射器泵系统的生物墨水分配器所取代, 从而实现了可控的、连续的生物墨水流动。为了开发一种适用于生物膜印刷的生物油墨, 工程中的大肠杆菌被悬浮在海藻酸盐溶液中, 使其与含钙表面发生凝固。在印刷基板中加入诱导剂化学品会推动生物膜蛋白在印刷生物油墨中的表达。该方法可对由印刷生物膜的离散层组成的各种空间图案进行3D 打印。这种空间控制的生物膜可以作为模型系统, 并可以在对社会产生广泛影响的多个领域找到应用, 包括抗生素耐药性预防或饮用水净化等。

引言

由于空间图案材料的市场不断增加, 目前越来越需要开发环保、可持续的空间图案^材料生产解决方案1。本文介绍了一种简单、经济的生产此类材料的方法, 因此提供了大量的未来应用。这里介绍的方法允许使用含有活细菌的生物油墨对空间图案结构进行三维 (3D) 打印。细菌在印刷结构中保持一周以上的活力, 使细菌能够进行自然或工程的代谢活动。因此, 印刷细菌可以在印刷结构中产生和沉积所需的成分, 例如创建一个功能交联生物膜²。

生产先进材料的传统方法涉及高能源支出 (如高温和高压), 并可能产生大量化学废物, 往往是需要成本广泛使用的有毒物质 3 ^,4。相比之下, 多种细菌物种能够生产出容易适用于各种行业的材料。这些材料包括聚合物, 如聚羟基烷酸盐 (pha)⁵或聚 (乙二醇-异丙基)⁽pgla) 6, 细菌纤维素⁷, 细菌混凝土材料⁸, 仿生复合材料⁹,淀粉基胶粘剂¹⁰台, 或生物基^{电气开关 11}, 等等。此外, 有价值材料的细菌生产通常在接近环境温度和压力的环境中, 在水环境中进行, 不需要或不产生有毒化合物。虽然用细菌生产材料已在文献中得到证明, 一些工业应用已经出现了^12、13,但这种材料的空间模式的可靠方法仍然是一项挑战。

本文演示了一种将低成本商用3d 打印机转换为3D 细菌打印机的直接方法。该协议展示了如何制备含有和维持活细菌的生物油墨, 以及如何制备可以进行3D 打印的基板。这种方法适用于能够产生材料的各种天然和工程细菌株。这些细菌可以在三维打印结构中进行空间分布, 并继续其代谢活动, 这将导致细菌产生的所需材料的空间分布。

这种印刷方法使生物膜的添加剂制造, 细菌的聚集被一个自我产生的细胞外基质包围。生物膜是异质的3D 网络, 其中蛋白质、聚合物、细菌细胞、氧气和营养物质都是空间结构^{的 14}。而以生物膜的形式, 细菌表现出更强的抗生素耐药性和结构鲁棒性, 使其难以从包括医疗导管和植入物在内的表面中根除。生物膜特性的关键, 也是生物膜研究面临的最大挑战, 似乎是生物膜^15、16、17的异质性。空间控制模型生物膜的生产特别令人感兴趣, 因为它将允许复制或调整生物膜组件的空间模式, 有助于了解生物膜在几乎任何表面上的稳定沉积。自然。

本文介绍了一种使用3d 打印的含有工程大肠杆菌的水凝胶生产生物膜的方法, 这些水凝胶在感应器存在的情况下产生生物膜蛋白, 以及生物膜形成的验证方法².这些生物膜的细胞外基质成分是含有自组装 CsgA 蛋白的 curli 淀粉样纤维 18.当工程中的大肠杆菌被诱导表达 csga 蛋白时, 它们形成一个稳定的生物膜模型, 保护细胞免受从印刷表面被冲走的影响。这种三维印刷生物膜可以在空间上进行控制, 可以作为研究多尺度生物膜结构-功能力学或材料组学的有用研究工具¹⁹。这些定制的生物膜将有助于了解生物膜形成的原理及其机械性能, 从而能够进一步研究抗生素耐药的机制等应用。

研究方案

1. 将商用3D 打印机转换为3D 生物打印机

1. 从打印机机架上取下商用3d 打印机 (材料表) 的挤出机和加热器, 然后从主电路板上拔下控制这些元件的接线 (图 1 a)。由于控制打印机工作温度的传感器需要能够与打印机软件进行通信, 因此请从打印软件中删除延迟打印直到达到工作温度的算法。
2. 通过硅管 (内径为1毫米) 将移液器尖端 (200μl 尖端) 连接到装入注射器泵的5毫升注射器上。将移液器尖端安装到3D 打印机挤出机头上, 以替代原始挤出机 (图 1 b)。
3. 如果将使用多种类型的生物墨水, 请将额外的管道系统和移液器尖端安装到打印机上。

2. 3D 打印的基板准备

1. 将 5m Ccl 2 溶液的 4 ml 加入到溶于 Luria-Bertani 肉汤 (lb) 培养基中的 1% wv agar 的 400 ml 中, 辅以适当的抗生素和诱导剂 (这里为34μgml 氯霉素和0.5% 鼠李糖)。
2. 将 LB-agar 溶液的20毫升分配到每个150毫米 X15 毫米 Petri 培养皿中。在室温下干燥 30分钟, 盖子半开。
   注: 通过将这些打印基板存储在4°c 中最多几天, 可以在此处暂停该协议。

3. 生物油墨的制备

1. 制备海藻酸钠溶液 (3% w v), 并将其加热到沸点三次, 对溶液进行灭菌。存放在 4°C, 直到使用。
2. 培养大肠杆菌 MG1655 Pro Csga ompr234 (e. 携带 psb1c3-绿色荧光蛋白 (gfp) 的细菌2或 psb1c3-gfp-csga (本构 gfp 表达, 鼠氨酸诱导 csga表达) 隔夜在 37°c, 在250转每分钟晃动在50毫升的 LB 介质含有34μgml 氯霉素和0.5% 鼠李糖。
3. 以 3220 x克的速度将细胞培养离心 5分钟, 使细菌进入颗粒。取出上清液。
4. 在 LB 培养基10毫升中重新悬浮细菌颗粒, 加入10毫升海藻酸钠 (3% wv)。

4. 3D 打印过程

1. 在计算机上安装并打开3D 打印软件 (材料表)。将3D 打印机连接到计算机。通过单击 X、Y 和 Z 轴的主按钮, 将打印头移动到其主位置。
2. 对于每个打印, 将准备好的打印基板放置在打印床上的特定位置。
3. 校准 z 轴上打印头的高度。
   1. 在手动控制下将打印头提升到22毫米的高度, 以便在移动到所需位置时不会与培养皿的边缘碰撞。将打印头放在印版的顶部, 并将其向下移动, 直到移液器尖端接触打印表面。将此 z 轴位置分配为 Z1 (打印表面的高度)。
   2. 通过在 X、Y 和 Z 轴的手动控制, 抬起打印头, 并将其移出板区域以外。如果打印头和印版表面之间的工作距离定义为 Z2, 请在打印过程中将 Z1 + Z2 作为 z 值输入打印程序。
4. 根据所需的轨迹, 采用自行开发的逐点坐标确定方法对打印形状进行编程。
   1. 如果所需的轨迹是一条直线, 则只定义起点和终点。在曲线上包含额外的点将导致更平滑的曲线。按顺序将打印头手动移动到每个点, 并按顺序记录这些点的坐标。在 g 代码编辑器中输入所有这些坐标以及每个打印段的打印头移动速度。
5. 打印前后, 将打印头提升到高于印版边缘 (20 毫米) 的距离, 然后直接移出印版区域。将此程序另存为 g 代码文件, 并直接加载以用于后续打印, 同时重新测量每个新打印基板的 Z 轴高度。
   注: 有关打印正方形的 g 代码示例, 请参见表 1 。
6. 加载预编程的 g 代码文件。在软件中打开 g 代码编辑器, 并在命令中编程以打印所需的形状。在每个命令行中, 打印头的位置可以在 X、Y 和 z 轴中更改。在所有打印步骤中输入 Z 值作为 Z1 + Z2 (打印表面高度 + 工作距离)。
   注: 移动速度也是可调的;9, 000 mm/min 是典型打印速率的合适值。
7. 将液体生物墨水装入注射器, 并将其安装在3D 生物打印机的注射器泵中。
8. 单击 "打印" 按钮, 将生物油墨打印到打印基板上。
9. 在打印过程中, 完全由软件控制打印头移动。在打印头与打印表面接触之前, 手动启动注射器泵。
   注: 注射器泵和打印机的协调性是根据挤出速度、打印头移动到第一个打印点的速度以及打印头的初始位置而根据经验确定的。如果初始打印头位置为 20 mm, 打印头速度为 9, 000 mm/min, 挤出速度为 0.1 mlh, 则在打印开始后立即启动注射器泵。如果挤出速度从 0.1 mlh 变为 0.3 mlh, 则在开始打印后等待2-3秒启动注射器泵。
10. 打印头到达打印头的最后一个打印点后, 立即停止注射器泵。在打印过程结束时, 在打印头抬起之前停止注射器泵, 否则多余的生物油墨会落在打印基板上, 降低打印分辨率。
11. 对于3D 结构的构造, 请在 g 代码编辑器中控制打印头的所有移动。键入第一层的打印高度。将 g 码中的 z 值增加0.2 毫米, 以增加第二层的打印高度。此后, 移动到更高的层时, 将 z 值增加0.1 毫米。在打印过程中不要移动印版。
12. 要测量印刷水凝胶的宽度和高度, 请使用放置在样品下方或旁边的钢尺。

5.大肠杆菌生物膜生产效果的生长和测试

1. 在室温下对印刷样品进行3-6天的孵化, 以生产生物膜组件 (卷曲纤维)。使用相机或荧光扫描仪对印版进行成像。
2. 要溶解海藻酸盐基质, 在印刷基板中加入 0.5 m 柠檬酸钠溶液 (pH = 7, 经 NaOH 调整) 的20毫升, 在室温下孵育 2小时, 每分钟30转。再次丢弃液体并将其图像, 以便与柠檬酸处理前的板材图像进行比较。

结果

成功的3D 生物膜打印的第一步是将商用3D 打印机转换为生物打印机。这种转换是通过拆卸打印机的挤出机和加热器 (设计用于使用聚合物油墨进行打印), 并将其替换为适合于印刷含有活菌的生物油墨的组件来实现的 (图 1 a)。挤出机被连接到注射器泵的管道系统上的移液器尖端 (或吸头, 如果在印刷过程中将使用多个生物油墨) 所取代 (?...

讨论

这里介绍的工程生物膜3D 打印协议有两个关键步骤。首先是琼脂印刷表面的制备, 这是产生特定印刷分辨率的最关键因素。重要的是要确保打印表面是平的, 并且打印头上的移液器尖端位于表面的正确高度。如果表面不平整, 则在打印过程中工作距离会发生变化。如果工作距离小于 0.1 mm, Ccl₂溶液可能进入移液器尖端内, 导致水凝胶形成, 导致移液器尖端堵塞。如果工作距离超过 0.3 mm, 则无法...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295