El patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un Bioprinter hágalo usted mismo

Resumen

Este artículo describe un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora 3D bacteriana que puede facilitar la impresión de biofilms estampados. Se describen todos los aspectos necesarios de la preparación del bioprintro y la bio-tinta, así como los métodos de verificación para evaluar la formación de biofilms.

Resumen

Los biofilms son agregados de bacterias incrustadas en una matriz extracelular de patrón espacialmente autoproducida. Las bacterias dentro de un biofilm desarrollan una mayor resistencia a los antibióticos, lo que plantea posibles peligros para la salud, pero también puede ser beneficioso para aplicaciones ambientales como la purificación del agua potable. El desarrollo ulterior de terapias antibacterianas y aplicaciones inspiradas en biofilm requerirá el desarrollo de métodos reproducibles e ingenierables para la creación de biopelículas. Recientemente, se ha desarrollado un novedoso método de preparación de biofilm utilizando una impresora tridimensional (3D) modificada con una tinta bacteriana. Este artículo describe los pasos necesarios para construir este biofrintro 3D eficiente y de bajo costo que ofrece múltiples aplicaciones en el procesamiento de materiales inducidos por bacterialmente. El protocolo comienza con una impresora 3D comercial adaptada en la que la extrusora ha sido reemplazada por un dispensador de bio-tinta conectado a un sistema de bomba de jeringa que permite un flujo controlable y continuo de bio-tinta. Para desarrollar una tinta biológica adecuada para la impresión de biofilm, las bacterias de Escherichia coli diseñadas se suspendieron en una solución de alginato, de modo que se solidifican en contacto con una superficie que contiene calcio. La inclusión de un producto químico inductor dentro del sustrato de impresión impulsa la expresión de las proteínas de biofilm dentro de la tinta bio impresa. Este método permite la impresión 3D de varios patrones espaciales compuestos por capas discretas de biofilms impresos. Estos biofilms controlados espacialmente pueden servir como sistemas modelo y pueden encontrar aplicaciones en múltiples campos que tienen un gran impacto en la sociedad, incluyendo la prevención de resistencia a los antibióticos o la purificación del agua potable, entre otros.

Introducción

Actualmente existe una creciente necesidad de desarrollar soluciones sostenibles y respetuosas con el medio ambiente para la producción de materiales con patrones espacialmente, debido al creciente número de mercados para dichos materiales¹. Este artículo presenta un método sencillo y económico para la producción de estos materiales y, por lo tanto, ofrece un amplio espectro de aplicaciones futuras. El método que se presenta aquí permite la impresión tridimensional (3D) de estructuras con patrones espacialmente utilizando un bio-Ink que contiene bacterias vivas. Las bacterias permanecen viables dentro de las estructuras impresas durante más de una semana, lo que permite a las bacterias realizar actividades metabólicas naturales o diseñadas. Por lo tanto, las bacterias impresas pueden producir y depositar los componentes deseados dentro de la estructura impresa, por ejemplo, creando un biofilm cruzado funcional².

Los métodos tradicionales para la producción de materiales avanzados implican gastos de alta energía (por ejemplo, altas temperaturas y/o presiones) y pueden producir grandes cantidades de desechos químicos, a menudo sustancias tóxicas que requieren una utilización de gran costo^{3 ,4}. En contraste, múltiples especies bacterianas son capaces de producir materiales que pueden ser fácilmente aplicables en diversas industrias. Estos materiales incluyen polímeros tales como polihidroxialcananatos (PHA)⁵ o poli (glicolide-Co-lactida) (PGLA)⁶, celulosa bacteriana⁷, materiales de hormigón bacteriano⁸, compuestos biomiméticos⁹, adhesivos a base de amiloides¹⁰, o interruptores eléctricos de base biológica¹¹, entre otros. Por otra parte, la producción bacteriana de materiales valiosos normalmente tiene lugar a temperaturas y presiones casi ambientales y en ambientes acuosos, sin necesidad de producir compuestos tóxicos. Mientras que la producción de materiales con bacterias se ha demostrado en la literatura y algunas aplicaciones industriales ya han surgido^12,13, un método confiable para el patrón espacial de estos materiales sigue siendo un desafío.

Este artículo muestra un método sencillo de convertir una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora bacteriana 3D. El protocolo muestra cómo preparar una bio-tinta que contiene y sostener las bacterias vivas, así como la forma de preparar sustratos sobre los que se puede realizar la impresión 3D. Este método es apropiado para usar con una variedad de cepas bacterianas naturales y diseñadas capaces de producir materiales. Estas bacterias pueden distribuirse espacialmente dentro de una estructura impresa en 3D y continuar con su actividad metabólica, lo que resultará en una distribución espacial de los materiales deseados producidos por las bacterias.

Este método de impresión permite la fabricación aditiva de biofilms, agregados de bacterias rodeadas por una matriz extracelular autoproducida. Las biofilms son redes 3D heterogéneas en las que las proteínas, los polímeros, las células bacterianas, el oxígeno y los nutrientes se estructuran espacialmente¹⁴. Mientras que en la forma de un biofilm, las bacterias exhiben una mayor resistencia a los antibióticos y robustez estructural, haciéndolos difíciles de erradicar de las superficies incluyendo catéteres médicos e implantes. La clave de las propiedades de biofilm, y también el mayor desafío a la investigación de biofilm, parece ser la heterogeneidad de biofilms^15,16,17. La producción de biofilms de modelo controlados espacialmente es de especial interés, ya que permitiría reproducir o ajustar los patrones espaciales de los componentes de biofilm, ayudando a la comprensión de la deposición estable de biofilms en prácticamente cualquier superficie en naturaleza.

Este artículo presenta un método para la producción de biofilms utilizando hidrogeles impresos en 3D que contienen bacterias de E. coli diseñadas que producen proteínas de biofilm en presencia de un inductor, así como métodos de verificación de la formación de biofilm² . Los principales componentes de la matriz extracelular de estos biofilms son las fibras de curli amiloide¹⁸ que contienen proteínas csga autoensambladas. Cuando las bacterias de E. coli diseñadas se inducen a expresar proteínas csga, forman un biofilm modelo estable que protege las células contra ser lavado fuera de la superficie de impresión. Este biofilm impreso en 3D puede controlarse espacialmente y puede servir como una herramienta de investigación útil para la investigación de la estructura de biofilm multiescala-mecánica de función o materiómica¹⁹. Estos biofilms personalizados ayudarán a la comprensión de los principios de la formación de biofilm y sus propiedades mecánicas, permitiendo una mayor investigación sobre los mecanismos de resistencia a los antibióticos entre otras aplicaciones.

Protocolo

1. conversión de una impresora 3D comercial en un bioprintro 3D

1. Extraiga el extrusor y el calentador de una impresora 3D comercial (tabla de materiales) del bastidor de la impresora y desenchufe el cableado que controla estos elementos de la placa de circuito principal (figura 1A). Dado que el sensor que controla la temperatura operativa de la impresora debe ser funcional para comunicarse con el software de la impresora, quite del software de impresión el algoritmo que retrasa la impresión hasta que se alcance la temperatura operativa.
2. Conectar una punta de pipetas (200 μL de punta) mediante tubería de silicio (diámetro interior de 1 mm) a una jeringa de 5 mL cargada en una bomba de jeringa. Monte la punta de la Piera en el cabezal de la extrusora de la impresora 3D como reemplazo para el extrusor original (figura 1B).
3. Si se va a utilizar más de un tipo de bio-tinta, Monte los sistemas de tuberías adicionales y las puntas de pipetas a la impresora.

2. preparación del sustrato para la impresión 3D

1. Añadir 4 mL de 5 M de solución CaCl₂ a 400 ml de agar 1% p/v disuelto en medio de caldo Luria-BERTANI (lb), complementado con antibióticos e inductores apropiados (aquí 34 μg/ml de cloranfenicol y 0,5% de Rhamnose).
2. Dispense 20 mL de la solución LB-agar en cada plato de Petri de 150 mm x 15 mm. Secar 30 min a temperatura ambiente con la tapa semiabierta.
   Nota: el protocolo se puede pausar aquí almacenando estos sustratos de impresión a 4 ° c durante varios días.

3. preparación de la bio-tinta

1. Prepare una solución de alginato sódico (3% p/v) y caliente el punto de ebullición tres veces para esterilizar la solución. Conservar a 4 ° c hasta que se utilice.
2. Crecer E. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bacterias que transportan plásmidos pSB1C3-proteína fluorescente verde (GFP) (expresión GFP constitutiva)² o PSB1C3-GFP-csga (expresión GFP constitutiva, Rhamnose-inducible csga expresión) durante la noche a 37 ° c con agitación a 250 rpm en 50 mL de medio LB que contiene 34 μg/mL de cloranfenicol y 0,5% de Rhamnose.
3. Centrifugar el cultivo celular durante 5 min a 3.220 x g para pellets de las bacterias. Retire el sobrenadante.
4. Vuelva a suspender el pellet de bacterias en 10 mL de medio LB y añada 10 mL de alginato sódico (3% p/v).

4. proceso de impresión 3D

1. Instale y abra el software de impresión 3D (tabla de materiales) en un ordenador. Conecte la impresora 3D al ordenador. Mueva el cabezal de impresión a su posición de inicio haciendo clic en el botón de inicio para los ejes X, y y Z.
2. Para cada impresión, coloque un sustrato de impresión preparado en una ubicación particular en la cama de impresión.
3. Calibrar la altura del cabezal de impresión en el eje Z.
   1. Levante el cabezal de impresión a una altura de 22 mm bajo control manual, de modo que no colisionará con el borde de la placa de Petri cuando se mueva a la posición deseada. Coloque el cabezal de impresión en la parte superior de la placa y muévase hacia abajo hasta que la punta de la Piera se contacto con la superficie de impresión. Asigne esta posición del eje Z como Z1 (la altura de la superficie de impresión).
   2. Levante el cabezal de impresión y muévase fuera del área de la placa mediante control manual en los ejes X, y y Z. Si la distancia de trabajo entre el cabezal de impresión y la superficie de la placa se define como Z2, introduzca Z1 + Z2 en el programa de impresión como valor Z durante la impresión.
4. Programa la forma de impresión mediante un método de coordenadas punto a punto autodesarrollado según la trayectoria deseada.
   1. Si la trayectoria deseada es una línea recta, defina sólo los puntos inicial y final. Incluir puntos adicionales en las líneas curvas resultará en curvas más suaves. Mueva el cabezal de impresión manualmente a cada punto secuencialmente y registre las coordenadas de estos puntos en orden. Introduzca todas estas coordenadas, así como la velocidad de movimiento del cabezal de impresión para cada segmento impreso en el editor de G-Code.
5. Tanto antes como después de imprimir, levante el cabezal de impresión a una distancia superior al borde de la placa (20 mm) y muévase directamente fuera de la región de la placa. Guarde este programa como un archivo de código G y cargue directamente para su uso en impresiones posteriores, mientras se vuelve a medir la altura del eje Z para cada nuevo sustrato de impresión.
   Nota: Consulte la tabla 1 para ver un ejemplo de código G para imprimir un cuadrado.
6. Cargue el archivo de código G preprogramado. Abra el editor de G-Code en el software y programa en los comandos para imprimir la forma deseada. En cada línea de comando, la posición del cabezal de impresión puede cambiarse en los ejes X, y y/o Z. Introduzca el valor Z durante todos los pasos de impresión como Z1 + Z2 (altura de la superficie de impresión + distancia de trabajo).
   Nota: la velocidad de movimiento también es ajustable; 9.000 mm/min es un valor adecuado para las tasas de impresión típicas.
7. Cargue la bio-tinta líquida en la jeringa (s) y móntela en la (s) bomba (es) de la jeringa del bioprintro 3D.
8. Imprima la tinta biológica en el sustrato de impresión haciendo clic en el botón Imprimir .
9. Durante la impresión, controle el movimiento del cabezal completamente por el software. Inicie manualmente la bomba de la jeringa antes de que el cabezal de impresión entre en contacto con la superficie.
   Nota: la coordinación de la bomba de jeringa y de la impresora se determina empíricamente en función de la velocidad de extrusión, la velocidad a la que el cabezal de impresión se desplaza hasta el primer punto y la posición inicial del cabezal. Si la posición inicial del cabezal de impresión es de 20 mm, con una velocidad de cabezal de impresión de 9.000 mm/min y una velocidad de extrusión de 0,1 mL/h, inicie la bomba de jeringa inmediatamente después de iniciar la impresión. Si se cambia la velocidad de extrusión de 0,1 mL/h a 0,3 mL/h, espere 2 − 3 s para iniciar la bomba de jeringa una vez iniciada la impresión.
10. Detenga la bomba de la jeringa tan pronto como el cabezal llegue al último punto de impresión. Detenga la bomba de la jeringa antes de que el cabezal se levante al final del proceso de impresión, de lo contrario, el exceso de tinta biológica caerá sobre el sustrato de impresión y reducirá la resolución de impresión.
11. Para la construcción de estructuras 3D, controle todos los movimientos del cabezal de impresión en el editor de G-Code. Escriba la altura de impresión de la primera capa. Aumente el valor Z en el código G en 0,2 milímetros para que la segunda capa aumente la altura de impresión. A partir de entonces, aumente el valor Z en 0,1 milímetros cuando se mueva a una capa superior. No mueva la placa durante el proceso de impresión.
12. Para medir la anchura y la altura del hidrogel impreso, utilice una regla de acero colocada debajo o junto a la muestra.

5. aumentar y probar la efectividad de la producción de biofilm por E. coli

1. Incubar las muestras impresas a temperatura ambiente durante 3 − 6 días para permitir la producción de componentes de biofilm (fibras de curli). Imagen de las placas utilizando una cámara o un escáner fluorescente.
2. Para disolver la matriz de alginato, añadir 20 mL de solución de citrato sódico de 0,5 M (pH = 7 ajustado con NaOH) a los sustratos de impresión e incubar durante 2 h con 30 RPM temblando a temperatura ambiente. Desechar el líquido y la imagen de las placas de nuevo para comparar con las imágenes de las placas antes del tratamiento con citrato.

Resultados

El primer paso para la impresión 3D exitosa de biofilms es convertir una impresora 3D comercial en un bioprintro. Esta conversión se logra quitando el extrusor y el calentador de la impresora, diseñado para la impresión con una tinta polimérica, y reemplazándolos con componentes apropiados para la impresión de bio-tinta que contiene bacterias vivas (figura 1A). El extrusor se sustituye por una punta de pipetas (o puntas, si se utilizarán varios bio-ti...

Discusión

El protocolo presentado aquí para la impresión 3D de biofilms de ingeniería tiene dos pasos críticos. En primer lugar, la preparación de la superficie de impresión de agar, que es el factor más crítico para producir una resolución de impresión específica. Es importante asegurarse de que la superficie de impresión sea plana y de que la punta de la Piera del cabezal esté colocada a la altura correcta de la superficie. Si la superficie no es plana, la distancia de trabajo cambiará durante el proceso de impresi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295