Dreidimensionales Pattern von Ingenieurbiofilmen mit einem Do-it-yourself-Bioprinter

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, einen kostengünstigen kommerziellen 3D-Drucker in einen bakteriellen 3D-Drucker zu verwandeln, der das Drucken von gemusterten Biofilmen erleichtern kann. Es werden alle notwendigen Aspekte der Zubereitung von Bioprinter und Bio-Tinte beschrieben, sowie Verifizierungsmethoden zur Beurteilung der Biofilme.

Zusammenfassung

Biofilme sind Aggregate von Bakterien, die in eine selbst produzierte, räumlich gemusterte extrazelluläre Matrix eingebettet sind. Bakterien innerhalb eines Biofilms entwickeln eine verbesserte Antibiotikaresistenz, die potenzielle gesundheitliche Gefahren birgt, aber auch für Umweltanwendungen wie die Reinigung von Trinkwasser von Vorteil sein kann. Die Weiterentwicklung von antibakteriellen Therapeutika und biofilm-inspirierten Anwendungen erfordert die Entwicklung reproduzierbarer, technischer Methoden zur Biofilmbildung. In jüngster Zeit wurde eine neuartige Methode zur Biofilm-Aufbereitung mit einem modifizierten dreidimensionalen (3D) Drucker mit einer bakteriellen Tinte entwickelt. Dieser Artikel beschreibt die Schritte, die notwendig sind, um diesen effizienten, kostengünstigen 3D-Bioprinter zu bauen, der mehrere Anwendungen in der bakterieninduzierten Materialverarbeitung bietet. Das Protokoll beginnt mit einem angepassten kommerziellen 3D-Drucker, bei dem der Extruder durch einen Bio-Tinte-Spender ersetzt wurde, der an ein Spritzenpumpensystem angeschlossen ist und einen kontrollierbaren, kontinuierlichen Fluss von Bio-Tinte ermöglicht. Um eine für den Biofilmdruck geeignete Bio-Tinte zu entwickeln, wurden in einer Lösung aus Alginat konstruierte Escherichia coli-Bakterien aufgehängt, so dass sie sich in Kontakt mit einer kalziumhaltigen Oberfläche verfestigen. Die Aufnahme einer Induktionschemie in das Drucksubstrat treibt die Ausprägung von Biofilm-Proteinen in die gedruckte Bio-Tinte. Diese Methode ermöglicht den 3D-Druck verschiedener räumlicher Muster, die aus diskreten Schichten von gedruckten Biofilmen bestehen. Solche räumlich gesteuerten Biofilme können als Modellsysteme dienen und Anwendungen in mehreren Bereichen finden, die weitreichende Auswirkungen auf die Gesellschaft haben, unter anderem auf die Antibiotikaresistenz oder die Trinkwasserreinigung.

Einleitung

Aufgrund der wachsenden Zahl von Märkten für solche Materialien wird derzeit zunehmend umweltfreundliche und nachhaltige Lösungen für die Herstellung von räumlich gemusterten Materialien^entwickelt. Dieser Artikel stellt eine einfache, kostengünstige Methode zur Herstellung solcher Materialien vor und bietet somit ein breites Spektrum an zukünftigen Anwendungen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht das dreidimensionale (3D) Drucken von räumlich gemusterten Strukturen mit einer Bio-Tinte, die lebende Bakterien enthält. Bakterien bleiben innerhalb der gedruckten Strukturen über eine Woche lebensfähig, so dass die Bakterien natürliche oder technische Stoffwechselaktivitäten ausführen können. Druckbakterien können so gewünschte Bauteile innerhalb der gedruckten Struktur herstellen und ablagern, zum Beispiel einen funktionellen, vernetzten Biofilm².

Traditionelle Methoden zur Herstellung von fortschrittlichen Materialien sind mit hohen Energiekosten (z.B. hohe Temperaturen und/oder Drücke) verbunden und können große Mengen an chemischen Abfällen produzieren, oft giftige Stoffe, die eine kostenintensive Nutzung erfordern 3 ^,4. Im Gegensatz dazu sind mehrere Bakterienarten in der Lage, Materialien herzustellen, die in verschiedenen Branchen leicht einsetzbar sind. Zu diesen Materialien gehören Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) 5 oder Poly (Glycolide-Co-lactide) (PGLA)⁶, bakterielle Zellulose⁷, bakterielle Betonmaterialien⁸, biomimetische Verbundstoffe9, Amyloid-basierte Klebstoffe¹⁰, oder biobasierte elektrische Schalter¹¹, unter anderem. Darüber hinaus erfolgt die bakterielle Produktion wertvoller Materialien in der Regel bei nahezu Umgebungstemperaturen und Drücken und in wässrigen Umgebungen, ohne dass toxische Verbindungen benötigt oder produziert werden. Während die Herstellung von Materialien mit Bakterien in der Literatur nachgewiesen wurde und einige industrielle Anwendungen bereits^12,13entstanden sind, bleibt eine zuverlässige Methode zur räumlichen Musternährung solcher Materialien eine Herausforderung.

Dieser Artikel zeigt eine geradlinige Methode, einen kostengünstigen kommerziellen 3D-Drucker in einen 3D-Bakteriater-Drucker umzuwandeln. Das Protokoll zeigt, wie eine Bio-Tinte, die die lebenden Bakterien enthält und erhält, hergestellt werden kann, sowie wie Substrate hergestellt werden können, auf die der 3D-Druck durchgeführt werden kann. Diese Methode ist geeignet, um mit einer Vielzahl von natürlichen und technischen Bakterienstämmen in der Lage, Materialien zu produzieren. Diese Bakterien können räumlich in einer 3D-gedruckten Struktur verteilt werden und setzen ihre Stoffwechselaktivität fort, was zu einer räumlichen Verteilung der gewünschten Materialien der Bakterien führt.

Diese Druckmethode ermöglicht die additive Herstellung von Biofilmen, Aggregaten von Bakterien, die von einer selbst produzierten extrazellulären Matrix umgeben sind. Biofilme sind heterogene 3D-Netzwerke, in denen Proteine, Polymere, Bakterienzellen, Sauerstoff und Nährstoffe alle räumlich strukturiert^sind. Während Bakterien in Form eines Biofilms eine erhöhte Antibiotikaresistenz und strukturelle Robustheit aufweisen, was es schwierig macht, sie von Oberflächen wie medizinischen Kathetern und Implantaten auszulöschen. Der Schlüssel zu Biofilm-Eigenschaften und auch die größte Herausforderung für die Biofilm-Forschung scheint die Heterogenität von Biofilmen^15,16,17zu sein. Die Herstellung von räumlich gesteuerten Modellbiofilmen ist von besonderem Interesse, da sie es ermöglichen würde, die räumlichen Muster von Biofilm-Komponenten zu reproduzieren oder zu stimmen, was das Verständnis für die stabile Ablagerung von Biofilmen auf nahezu jeder Oberfläche in der natur.

Dieser Artikel stellt ein Verfahren zur Herstellung von Biofilmen vor, bei denen 3D-gedruckte Hydrogele mit technischen E . coli-Bakterien , die Biofilm-Proteine in Anwesenheit eines Indukters produzieren, sowie Methoden zur Überprüfung der Biofilmbildung verwendet werden. . Die wichtigsten extrazellulären Matrixkomponenten dieser Biofilme sind curli Amyloid-Fasern 18, die selbst zusammengesetzte CsgA-Proteine enthalten. Wenn die E . coli-Bakterien zum Ausdruck von CsgA-Proteinen verleitet werden, bilden sie einen stabilen Modellbiofilm, der die Zellen vor dem Abwaschen der Druckfläche schützt. Ein solcher 3D-gedruckter Biofilm kann räumlich gesteuert werden und als nützliches Forschungsinstrument zur Untersuchung von mehrstufigen Biofilm-Strukturfunktionsmechanik oder Materiomik¹⁹dienen. Diese maßgeschneiderten Biofilme werden das Verständnis der Prinzipien der Biofilmbildung und ihrer mechanischen Eigenschaften fördern und unter anderem die Mechanismen der Antibiotikaresistenz weiter erforschen.

Protokoll

1. Umwandlung eines kommerziellen 3D-Druckers in einen 3D-Bioprinter

1. Entfernen Sie den Extruder und die Heizung eines kommerziellen 3D-Druckers (Materialtabelle) aus dem Druckerrahmen und ziehen Sie die Verkabelung, die diese Elemente aus der Hauptleiterplatte (Abbildung 1A) steuert. Da der Sensor, der die Betriebstemperatur des Druckers steuert, funktionell sein muss, um mit der Druckersoftware zu kommunizieren, entfernen Sie aus der Drucksoftware den Algorithmus, der den Druck verzögert, bis die Betriebstemperatur erreicht ist.
2. Verbinden Sie eine Pipette-Spitze (200 μL-Spitze) über Siliziumrohre (Innendurchmesser 1 mm) mit einer 5 mL-Spritze, die in eine Spritzenpumpe geladen wird. Als Ersatz für den Original-Extruder (Abbildung 1B) wird die Pipette-Spitze auf den3D-Drucker-Extruderkopf geklebt.
3. Wenn mehr als eine Art von Bio-Tinte verwendet wird, montieren Sie zusätzliche Schlauchsysteme (n) und Pipette-Spitze (n) in den Drucker.

2. Substratvorbereitung für den 3D-Druck

1. Fügen Sie 4 mL von 5 M CaCl 2-Lösung zu 400 mL von 1% w/agar in Luria-Bertani Brüte (LB) Medium aufgelöst, ergänzt mit entsprechenden Antibiotika und Induktoren (hier 34 μg/mL Chloramphenicol und 0,5% Rhamnose).
2. In je 150 mm x 15 mm Petrischale 20 ml der LB-Agar-Lösung ablegen. Trockene 30 min bei Raumtemperatur mit dem Deckel halb offen.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden, indem diese Drucksubstrate bis zu mehreren Tagen bei 4 ° C gelagert werden.

3. Bio-Tinte-Vorbereitung

1. Bereiten Sie eine Natriumalginatlösung (3% w/v) vor und erhitzen Sie dreimal auf den Siedepunkt, um die Lösung zu sterilisieren. Bei 4 ° C lagern, bis sie verwendet werden.
2. Wachsen Sie E. coli MG1655 PRO c-sgA ompR234 ( E. Coli) Bakterien,die Plasmide pSB1C3-grünes Leuchtstoffprotein (GFP)⁽ konstitutiver GFP-Ausdruck) 2 oder pSB1C3-GFP-CsgA (konstitutive GFSP-Expression, rhamnose-induzierbare CsgA) tragen Ausdruck) über Nacht bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 U/min in 50 ml LB-Medium mit 34 μg/mL Chloramphenicol und 0,5% Rhamnose.
3. Zentrifugen Sie die Zellkultur für 5 min bei 3.220 x g, um die Bakterien zu pleiten. Den Supernatant entfernen.
4. Das Bakterienpellet in 10 mL LB-Medium neu aussetzen und 10 ml Natriumalginat (3% w/v) hinzufügen.

4.3D-Druckverfahren

1. Installieren und öffnen Sie die 3D-Drucksoftware (Materialtabelle) auf einem Computer. Schließen Sie den 3D-Drucker an den Computer an. Bewegen Sie den Printhead in seine Heimatposition, indem Sie auf den Home-Button für die Achsen X, Y und Z klicken.
2. Für jeden Druck ein präpariertes Drucksubstrat auf eine bestimmte Stelle auf dem Druckbett legen.
3. Kalibrieren Sie die Höhe des Druckers in der Z-Achse.
   1. Heben Sie den Druckkopf unter manueller Kontrolle auf eine Höhe von 22 mm, damit er beim Umzug in die gewünschte Position nicht mit der Kante der Petrischale kollidiert. Positionieren Sie den Druckkopf oben auf der Platte und bewegen Sie ihn nach unten, bis die Pipette-Spitze die Druckfläche berührt. Weisen Sie diese Z-Achsen-Position als Z1 (Höhe der Druckfläche) an.
   2. Heben Sie den Druckkopf an und bewegen Sie ihn durch manuelle Steuerung in den Achsen X, Y und Z außerhalb des Plattenbereichs. Wenn der Arbeitsabstand zwischen dem Druckkopf und der Plattenoberfläche als Z2 definiert ist, geben Sie Z1 + Z2 als Z-Wert beim Drucken in das Druckprogramm ein.
4. Programmieren Sie die Druckform nach der gewünschten Flugbahn durch eine selbst entwickelte punktgenaue Koordinationsmethode.
   1. Wenn die gewünschte Flugbahn eine gerade Linie ist, definieren Sie nur die Start-und Endpunkte. Die Aufnahme zusätzlicher Punkte auf den geschwungenen Linien führt zu glatteren Kurven. Bewegen Sie den Druckkopf nacheinander manuell zu jedem Punkt und zeichnen Sie die Koordinaten dieser Punkte in der Reihenfolge auf. Geben Sie alle diese Koordinaten sowie die Druckergeschwindigkeit für jedes gedruckte Segment in den G-Code-Editor ein.
5. Heben Sie den Druckkopf vor und nach dem Druck auf eine Distanz, die höher ist als die Plattenkante (20 mm), und bewegen Sie sich direkt aus der Plattenregion. Speichern Sie dieses Programm als G-Code-Datei und laden Sie direkt für den Einsatz in nachfolgenden Drucken, während Sie die Z-Achsenhöhe für jedes neue Drucksubstrat neu messen.
   Hinweis: Siehe Tabelle 1 für einen Beispiel G-Code zum Drucken eines Quadrats.
6. Laden Sie die vorprogrammierte G-Code-Datei. Öffnen Sie den G-Code-Editor in der Software und programmieren Sie in den Befehlen zum Drucken der gewünschten Form. An jeder Kommandozeile kann die Position des Druckers in der Achse X, Y, and/oder Z geändert werden. Geben Sie den Z-Wert während aller Druckschritte als Z1 + Z2 ein (Höhe der Druckfläche + Arbeitsabstand).
   Hinweis: Auch die Fahrgeschwindigkeit ist einstellbar; 9.000 mm/.
7. Laden Sie die flüssige Bio-Tinte in Spritze (n) und montieren Sie sie in die Spritzenpumpe des 3D-Bioprinters.
8. Drucken Sie die Bio-Tinte auf das Drucksubstrat aus , indem Sie auf den Druckknopf klicken.
9. Während des Drucks steuern Sie die Druckbewegung vollständig durch die Software. Starten Sie die Spritzenpumpe manuell, bevor der Druckkopf mit der Druckfläche in Berührung kommt.
   Hinweis: Die Koordination der Spritzenpumpe und des Druckers wird empirisch bestimmt, abhängig von der Extrusionsgeschwindigkeit, der Geschwindigkeit, mit der sich der Druckkopf zum ersten Druckpunkt bewegt, und der Ausgangsposition des Druckers. Wenn die anfängliche Druckerposition 20 mm beträgt, mit einer Druckgeschwindigkeit von 9.000 mm und einer Extrusionsgeschwindigkeit von 0,1 mL/h, starten Sie die Spritzenpumpe unmittelbar nach dem Druckstart. Wenn die Extrusionsgeschwindigkeit von 0,1 mL/h auf 0,3 mL/h geändert wird, dann warten Sie 2 − 3 s, um die Spritzenpumpe nach dem Druckstart zu starten.
10. Stoppen Sie die Spritzenpumpe, sobald der Druckkopf an der letzten Druckstelle ankommt. Verbinden Sie die Spritzenpumpe, bevor sich der Druckkopf am Ende des Druckprozesses hebt, sonst wird überschüssige Bio-Tinte auf das Drucksubstrat fallen und die Druckauflösung reduzieren.
11. Für den Aufbau von 3D-Strukturen, steuern Sie alle Bewegungen des Druckers im G-Code-Editor. Geben Sie die Druckhöhe der ersten Schicht ein. Erhöhen Sie den Z-Wert im G-Code um 0,2 Millimeter, damit die zweite Schicht die Druckhöhe erhöht. Danach den Z-Wert um 0,1 Millimeter erhöhen, wenn man sich auf eine höhere Schicht bewegt. Bewegen Sie die Platte während des Druckprozesses nicht.
12. Um die Breite und Höhe des bedruckten Hydrogels zu messen, verwenden Sie ein Stahlregal, das unter oder neben der Probe platziert wird.

5. Wachstum und Erprobung der Wirksamkeit der Biofilmproduktion durch E. coli

1. Inkubieren Sie die bedruckten Proben bei Raumtemperatur für 3 − 6 Tage, um die Herstellung von Biofilm-Komponenten (Curli-Fasern) zu ermöglichen. Bildmachen Sie die Platten mit einer Kamera oder einem Leuchtstoffscanner.
2. Um die Alginatmatrix aufzulösen, fügen Sie 20 mL von 0,5 M Natriumcitrat-Lösung (pH = 7, die mit NaOH eingestellt ist) zu den Drucksubstraten hinzu und inkubieren Sie für 2 Stunden mit 30 U/min Schütteln bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie die Flüssigkeit und Bild der Platten wieder, um mit den Bildern der Platten vor der Zitatbehandlung zu vergleichen.

Ergebnisse

Der erste Schritt für den erfolgreichen 3D-Druck von Biofilmen ist die Umwandlung eines kommerziellen 3D-Druckers in einen Bioprinter. Diese Umstellung erfolgt durch das Entfernen des Extruders und der Heizung des Druckers, der für den Druck mit einer polymeren Tinte ausgelegt ist, und durch Komponenten, die für den Druck von Biofarb-Tinte mit lebenden Bakterien geeignet sind (Abbildung 1A). Der Extruder wird durch eine Pipette-Spitze (oder Spitzen, wenn m...

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll für den 3D-Druck von technischen Biofilmen hat zwei kritische Schritte. Der erste ist die Vorbereitung der Agar-Druckfläche, die der kritischste Faktor für die Erzeugung einer bestimmten Druckauflösung ist. Wichtig ist, dass die Druckfläche flach ist und die Pipette-Spitze auf dem Druckkopf in der richtigen Höhe von der Oberfläche aus positioniert wird. Ist die Oberfläche nicht flach, ändert sich der Arbeitsabstand während des Druckprozesses. Wenn der Arbeitsabstand weniger als 0...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295