המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר

Summary

מאמר זה מתאר שיטה להפיכת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת תלת-ממדית חיידקית, היכולה להקל על הדפסה של מאפייני בדוגמת מילוי. כל ההיבטים הנחוצים של הכנת הביופלקטר והביו-דיו מתוארים, כמו גם שיטות אימות להערכת היווצרות ביואילאמים.

Abstract

ביוילאמים הם אגרגטים של חיידקים מוטבע בתוך מטריצה המיוצר בתבנית spatially-בדוגמת. חיידקים בתוך ביוilm לפתח עמידות לאנטיביוטיקה משופרת, אשר מהווה סכנות בריאותיות פוטנציאליות, אבל יכול גם להועיל ליישומים סביבתיים כגון טיהור של מי שתייה. ההתפתחות הנוספת של הtherapeutics אנטי בקטריאלי ויישומים השראה ביוilm ידרוש התפתחות של שיטות הנדסה, מהנדסים ליצירת ביוגרפיות. לאחרונה, התפתחה שיטה מקורית של הכנת ביוilm באמצעות מדפסת תלת-ממדית ששונתה (3D) עם דיו חיידקי. מאמר זה מתאר את השלבים הנחוצים לבניית הביוקטר היעיל והחסכוני הזה המציע מספר יישומים בעיבוד חומרים המושרה על ידי bacterially. הפרוטוקול מתחיל עם מדפסת תלת-ממד מותאם מותאמת מסחרית שבה החליף את הבלטת ממד עם מתקן ביו דיו המחובר למערכת משאבת מזרק המאפשרת זרימה מתמשכת ורציפה של ביו-דיו. לפיתוח ביו-דיו המתאים להדפסת ביוilm, בקטריה מהונדסים של חיידק האנציכיה הושעו בתמיסה של alginate, כך שהם לגבש במגע עם משטח המכיל סידן. הכללת כימיה מודפסת בתוך מצע ההדפסה כוננים ביטוי של חלבונים ביוilm בתוך הביו-דיו המודפס. שיטה זו מאפשרת הדפסה תלת ממדית של תבניות מרחבית שונות המורכבות משכבות בדידים של ביואמים מודפסים. כגון מערכות מבוקרת מסוג זה יכול לשמש כמערכות מודל והוא יכול למצוא יישומים בתחומים מרובים שיש להם השפעה רחבה על החברה, כולל מניעת עמידות לאנטיביוטיקה או שתיית מים לטיהור, בין היתר.

Introduction

כיום קיים צורך הולך וגובר לפיתוח פתרונות ידידותיים לסביבה, לייצור חומרים בדוגמת spatially, בשל הרחבת מספר השווקים לחומרים מסוג¹. מאמר זה מציג באופן פשוט, שיטה חסכונית לייצור חומרים כאלה ולכן מציע ספקטרום גדול של יישומים עתידיים. השיטה המוצגת כאן מאפשרת תלת מימדי (3D) הדפסה של מבנים בדוגמת spatially באמצעות הביו-דיו המכיל חיידקים חיים. החיידק נשאר בר קיימא בתוך המבנים המודפסים במשך שבוע, ומאפשר לחיידק לבצע פעילויות מטבוליות טבעיות או מהונדסים. חיידקים מודפסים יכולים ובכך לייצר ולהפקיד את הרכיבים הרצויים בתוך המבנה המודפס, לדוגמה יצירת ביוilm מקושרות פונקציונלי².

שיטות מסורתיות לייצור חומרים מתקדמים כוללות הוצאות אנרגיה גבוהה (למשל, טמפרטורות גבוהות ו/או לחצים) והוא יכול לייצר כמויות גדולות של פסולת כימית, לעתים קרובות חומרים רעילים הדורשים הוצאות מקיפות^{3 ,4}. לעומת זאת, מינים חיידקיים רבים מסוגלים לייצר חומרים שניתן ליישום בקלות בתעשיות שונות. חומרים אלה כוללים פולימרים כגון פוליהידרוקסילאנוטים (PHA)⁵ או פולי (גליקולדה-co-lactide)⁶, בקטריות תאית⁷, חומרי בטון חיידקיים⁸, מרוכבים ביוציתים⁹, דבקים מבוססי עמילואיד¹⁰, או מתגי חשמל ביו מבוססי¹¹, בין היתר. יתר על כן, ייצור חיידקי של חומרים יקרי ערך מתרחש בדרך כלל בטמפרטורות הסביבה הקרובה ולחצים ובסביבות מימית, ללא צורך או לייצר תרכובות רעילות. בזמן הפקת חומרים עם חיידקים כבר הפגינו בספרות וכמה יישומים תעשייתיים כבר התפתחה^12,13, שיטה אמינה עבור הקפדה מרחבית של חומרים כאלה נשאר אתגר.

מאמר זה מדגים שיטה הישר קדימה להמרת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת בקטריאלי תלת-ממדית. הפרוטוקול מראה כיצד להכין את הביו-דיו המכיל ולקיים את החיידק החי, כמו גם כיצד להכין מצעים שעליהם ניתן לבצע את ההדפסה התלת-ממדית. שיטה זו מתאימה לשימוש עם מגוון זנים חיידקיים טבעיים ומהונדסים מסוגל לייצר חומרים. חיידקים אלה יכולים להיות מופץ מרחב בתוך מבנה מודפס 3d ועדיין להמשיך את פעילות חילוף החומרים שלהם, אשר תגרום התפלגות מרחבית של החומרים הרצוי המיוצר על ידי החיידק.

שיטת הדפסה זו מאפשרת ליצור מוספים של ביואמים, אגרגטים של חיידקים המוקפים במטריצה בעלת הפקה עצמית. ביואמים הם רשתות תלת-ממד הטרוגנית שבהן חלבונים, פולימרים, תאי בקטריאלי, חמצן וחומרים מזינים כולם מובנים ביותר¹⁴. בעוד בצורת ביוilm, החיידק מפגין עמידות לאנטיביוטיקה מוגברת וחוסן מבניים, מה שמקשה למגר ממשטחים כולל קטטרים ושתלים רפואיים. המפתח למאפייני ביוilm, וגם האתגר הגדול ביותר לחקר ביוilm, נראה כטרוגניות של ביוילאמים^15,16,17. ייצור ביואילאמים של מודל מבוקר בשליטה מיוחדת הוא עניין מיוחד כפי שאפשר להתרבות או לכוונן את הדפוסים המרחביים של רכיבי הבייוilm, ולסייע להבנת התצהיר היציב של הביואמים כמעט בכל משטח ב טבע.

מאמר זה מציג שיטה לייצור ביויואמים באמצעות הידרו-מודפסים תלת-ממדיים המכילים חיידקים מהונדסים של E. coli המייצרים חלבונים של ביוilm בנוכחות סליל, כמו גם שיטות אימות של היווצרות ביוilm² . מרכיבי מטריקס העיקריים של מטריצות של ביואמים אלה הם סיבי עמילואיד בסיבים¹⁸ המכילים חלבונים csga עצמית התאספו. כאשר מתוכננים חיידקים E. coli המושרה כדי לבטא חלבונים csga, הם יוצרים מודל יציב ביוilm המגן על התאים מפני שטף של משטח ההדפסה. כגון מודפס 3D המבנה יכול להיות נשלט על ידי שליטה והוא יכול לשמש כלי מחקר שימושי לחקירת מכניקה מבנה בקנה מידה רב של מבנים התפקוד או החומריות¹⁹. ביואמים אלה יסייעו להבנת עקרונות היווצרות הביוונים ותכונותיו המכאניות, המאפשרות מחקר נוסף למנגנונים של עמידות לאנטיביוטיקה בין יישומים אחרים.

Protocol

1. המרה של מדפסת תלת-ממדית מסחרית לביורימטר תלת-ממדי

1. הסר את הבלטת ממד ואת החימום של מדפסת תלת-ממדית מסחרית (טבלת חומרים) ממסגרת המדפסת, ונתק את החיווט השולט ברכיבים אלה מלוח המעגלים הראשי (איור 1a). מאחר שהחיישן השולט בטמפרטורה התפעולית של המדפסת צריך להיות פונקציונלי לקיים תקשורת עם תוכנת המדפסת, הסר מתוכנת ההדפסה את האלגוריתם העכב את ההדפסה עד שתגיע לטמפרטורה המבצעית.
2. לחבר טיפ פיפטה (200 μL) באמצעות אבובים סיליקון (קוטר פנימי של 1 מ"מ) ל-5 מזרק mL שנטען למשאבת מזרק. הקצה את עצת הפיפטה על הראש של מדפסת תלת-ממדית כתחליף לדגם1Bהמקורי.
3. אם נעשה שימוש ביותר מסוג אחד של דיו ביולוגי, יש לטעון מערכות אבובים נוספות וקצות פיפטה למדפסת.

2. הכנת מצע להדפסת תלת מימד

1. הוסף 4 מ ל של 5 M CaCl₂ פתרון ל 400 mL של 1% w/v אגר מומס לוריא ברטני ציר (LB) בינונית, בתוספת עם אנטיביוטיקה המתאים השראות (כאן 34 μg/mL כלוראמנקול ו 0.5% rhamnose).
2. לחלק 20 מ ל של הפתרון LB-אגר לתוך כל 150 mm x 15 מ"מ צלחת פטרי. יבש 30 דקות בטמפרטורת החדר עם המכסה חצי פתוח.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול באמצעות אחסון מצעים אלה ב -4 ° c עד מספר ימים.

3. הכנה לביו-דיו

1. להכין תמיסת נתרן קילוף פלסטיצידיות (3% w/v), וחום לנקודת רתיחה שלוש פעמים כדי לחטא את הפתרון. החנות ב-4 ° צ' עד לשימוש.
2. לגדול E. COLI MG1655 PRO ΔcsgA ompR234 (e. coli ΔcsgA) חיידקים נושאים פלמידים pSB1C3-ירוק פלורסנט (gfp) (הביטוי gfp)² או PSB1C3-gfp-csga (קונסטיטוטיב ביטוי gfp, Rhamnose-inducible csga ביטוי) לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 250 סל ד ב 50 mL של LB בינונית המכילה 34 μg/mL כלוראמנול ו 0.5% rhamnose.
3. צנטריפוגה את תרבות התא עבור 5 דקות ב 3,220 x g כדי גלולה החיידקים. . הסר את הסופרנטאנט
4. מחדש להשעות את הגלולה בקטריה 10 מ ל של LB בינונית ולהוסיף 10 מ ל של נתרן קילוף פלסטיצידיות (3% w/v).

4. תהליך הדפסה תלת-ממדי

1. התקן ופתח את תוכנת ההדפסה התלת-ממדית (טבלת חומרים) במחשב. חבר את המדפסת התלת-ממדית למחשב. הזז את ראש ההדפסה למיקומה הביתי על-ידי לחיצה על לחצן הבית עבור הצירים X, Y ו-Z.
2. עבור כל הדפסה, הצב מצע הדפסה מוכן על מיקום מסוים במיטת ההדפסה.
3. כיול הגובה של ראש ההדפסה בציר Z.
   1. הרם את ראש ההדפסה לגובה של 22 מ"מ תחת שליטה ידנית, כך שהוא לא יהיה מתנגש עם קצה של צלחת פטרי בעת המעבר למיקום הרצוי. הצב את ראש ההדפסה מעל הלוח והזז אותו למטה עד שתיאור הפיפטה ייצור קשר עם משטח ההדפסה. הקצה מיקום ציר Z זה כ-Z1 (הגובה של משטח ההדפסה).
   2. הרם את ראש ההדפסה והזז אותו מחוץ לאזור הלוח באמצעות שליטה ידנית בצירים של X, Y ו-Z. אם מרחק העבודה בין ראש ההדפסה לבין משטח הלוח מוגדר כ-Z2, הזן Z1 + Z2 לתוך תוכנית ההדפסה כערך Z במהלך ההדפסה.
4. תכנת את צורת ההדפסה בשיטת קואורדינטות מפותחת של נקודה-אחר-נקודה בהתאם לנתיב הרצוי.
   1. אם הנתיב הרצוי הוא קו ישר, הגדר רק את נקודות ההתחלה והסיום. כלילת נקודות נוספות על קווים מעוקלים תגרום לעקומות חלקות יותר. הזז את ראש ההדפסה באופן ידני לכל נקודה ברציפות, והקלט את הקואורדינטות של נקודות אלה לפי הסדר. הזן את כל הקואורדינטות הללו וכן את מהירות הזזת ראש ההדפסה עבור כל פלח מודפס בעורך קוד ה-G.
5. הן לפני והן אחרי ההדפסה, הרם את ראש ההדפסה למרחק גבוה יותר מקצה הלוח (20 מ"מ) ועבור ישירות אל מחוץ לאזור הלוח. שמור תוכנית זו כקובץ קוד G וטען ישירות לשימוש בהדפסות עוקבות, תוך מדידת מחדש של גובה ציר Z עבור כל מצע הדפסה חדש.
   הערה: ראו טבלה 1 לדוגמה קוד G להדפסת ריבוע.
6. טען את הקובץ המתוכנת בקוד G שתוכנן מראש. פתח את עורך קוד ה-G בתוכנה, והתוכנית בפקודות להדפסת הצורה הרצויה. בכל שורת פקודה, ניתן לשנות את מיקומו של ראש ההדפסה בציר X, Y ו/Z. הקלט את ערך Z במהלך כל שלבי ההדפסה כ-Z1 + Z2 (גובה משטח ההדפסה + מרחק עבודה).
   הערה: מהירות ההזזה מתכווננת גם היא; 9,000 mm/min הוא ערך מתאים לשיעורי הדפסה טיפוסיים.
7. טען את הדיו הביולוגי הנוזלי למזרק (ים), והבהר אותם במשאבת המזרק (ים) של הביורימטר התלת-ממדי.
8. הדפס את הדיו הביולוגי על מצע ההדפסה על -ידי לחיצה על לחצן ההדפסה.
9. במהלך ההדפסה, שלוט בתנועת ההדפסה במלואה על-ידי התוכנה. הפעל ידנית את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה יגיע למגע עם משטח הדפסה.
   הערה: הקואורדינציה של משאבת המזרק והמדפסת נקבעת באופן אמפירי בהתאם למהירות ההבלטה, המהירות שבה ראש ההדפסה עובר לנקודת ההדפסה הראשונה, ולמיקום ההתחלתי של ההדפסה. אם מיקום ההדפסה הראשונית הוא 20 מ"מ, עם מהירות ההדפסה של 9,000 מ"מ/min ומהירות ההבלטה של 0.1 mL/h, להתחיל את משאבת המזרק מיד לאחר התחלת ההדפסה. אם מהירות ההבלטה משתנה מ-0.1 mL/h ל-0.3 mL/h, לאחר מכן המתן 2-3 להפעלת משאבת המזרק לאחר התחלת ההדפסה.
10. עצור את משאבת המזרק ברגע שראש ההדפסה יגיע בנקודה האחרונה של הדפסה. לעצור את משאבת המזרק לפני שראש ההדפסה מרים בסוף תהליך ההדפסה, אחרת עודף ביולוגי יהיה לרדת על מצע ההדפסה ולהקטין את רזולוציית ההדפסה.
11. לבניית מבנים תלת ממדיים, לשלוט בכל התנועות של ראש ההדפסה בעורך קוד G. הקלד את גובה ההדפסה של השכבה הראשונה. הגדילו את ערך Z ב-G-code על-ידי 0.2 מילימטרים עבור השכבה השניה כדי להגדיל את גובה ההדפסה. לאחר מכן, הגדילו את ערך Z ב-0.1 מילימטרים כאשר עוברים לשכבה גבוהה יותר. אל תזיז את הצלחת במהלך תהליך ההדפסה.
12. כדי למדוד את הרוחב והגובה של ההידרוג'ל המודפס, השתמש בסרגל פלדה הממוקם מתחת או לצד המדגם.

5. הגדלת ובדיקת האפקטיביות של ייצור ביוilm על ידי E. coli

1. מודב את הדגימות המודפסות בטמפרטורת החדר במשך 3-6 ימים כדי לאפשר ייצור של רכיבי ביוilm (סיבי קורלי). צלמו את הצלחות בעזרת מצלמה או סורק פלורסנט.
2. כדי לפזר את מטריצת קילוף פלסטיצידיות, להוסיף 20 מ ל של 0.5 M נתרן ציטראט הפתרון (pH = 7 מותאם עם naoh) הדפסה מצעים, ו דגירה עבור 2 h עם 30 סל ד רועד בטמפרטורת החדר. להשליך את הנוזל ואת התמונה לוחיות שוב כדי להשוות עם תמונות של לוחיות לפני טיפול ציטראט.

תוצאות

הצעד הראשון להדפסה תלת-ממדית מוצלחת של ביויואמים הוא המרת מדפסת תלת-ממדית מסחרית לתוך ביוריקטר. המרה זו מושגת על ידי הסרת מכבש הדפוס והחימום של המדפסת, המיועדים להדפסה עם דיו פולימרי, והחלפת אלה עם רכיבים המתאימים להדפסת ביו-דיו המכיל חיידקים חיים (איור 1A)...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן עבור הדפסה תלת-ממדית של ביואיאמים מהונדסים מכיל שני שלבים קריטיים. ראשית הוא הכנת משטח ההדפסה אגר, שהוא הגורם הקריטי ביותר להפקת רזולוציית הדפסה ספציפית. חשוב לוודא שמשטח ההדפסה שטוח ושתיאור הפיפטה בראש ההדפסה ממוקם בגובה הנכון מהמשטח. אם המשטח אינו שטוח, מרחק העבודה י...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	CoLiDo	3D-P Kit
3D printing software	CoLiDo	Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar	Sigma-Aldrich	05040
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	3886.1
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Orbital shaker	VWR	89032-092	Model 3500
Petri dish	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Silicon tubing	VWR	DENE 3100103/25
Syringe pump	ProSense B.V.	NE-300
Sodium alginate	Sigma-Aldrich	W201502
Sodium citrate monobasic	Sigma-Aldrich	71498
Sodium hydrooxide	VWR	28244.295