各种鼠标脂肪库的识别和解剖

摘要

蛋白细胞存在于离散的仓库中,在其独特的微环境中具有不同的角色。由于发现在脂肪细胞特性和功能方面的区域差异,对仓库的标准化识别和隔离对于该领域的发展至关重要。在这里,我们提出了一个详细的协议,为各种小鼠脂肪库的切除。

摘要

脂肪组织是具有广泛功能的复杂器官,包括根据当地和全球需求储存和调动能量,将代谢分离以产生热量,以及分泌脂肪以调节全身平衡和免疫反应。新兴研究正在识别位于整个身体离散库的脂肪细胞发育、分子和功能特征的重要区域差异。仓库的不同属性在医学上是相关的,因为代谢疾病通常表现出油库特定的影响。该协议将为研究者提供详细的解剖图集和解剖指南,以便对各种小鼠脂肪组织进行可重复和准确的识别和切除。离散脂肪库的标准化解剖将允许详细比较其分子和代谢特性,以及在各种营养和环境条件下对局部和系统病理状态的贡献。

引言

脂肪组织在全身平衡中起着关键作用,包括根据当地和全球需求储存和释放能量,热调节和分泌阿迪波金来调节能量平衡、新陈代谢和免疫反应^1,2.脂肪细胞分布在整个身体离散的仓库中,在某些情况下在其微环境中担任专门角色 3、^4、5。从历史上看,脂肪组织的研究集中在白色脂肪组织(WAT)及其在维持能量平衡中的作用。大多数脂肪细胞分布在整个身体在皮下和内脏WAT仓库。这些仓库的特性对于代谢疾病的差异易感性非常重要。皮下脂肪细胞,位于皮肤下面,与保护性代谢^作用5相关。内脏肾上腺细胞,围绕重要器官,并包含在性腺、肾上腺、腹食、腹骨和腹环细胞内,通常与代谢紊乱有关,包括2型糖尿病和^{心血管疾病2}.棕色脂肪组织(BAT)也得到了广泛的研究。棕色和棕色的脂肪细胞表达脱钩蛋白1(UCP1),在自适应热发生和葡萄糖平衡6,7中发挥重要作用。经典棕色的脂肪细胞包含在间体BAT仓库8。棕色腹腔细胞的簇也发现在其他位置,包括腹腔,腹腔,腹腔/腹腔,宫颈,腹腔和腹腔前科8,9。

除了它们在主要WAT和BAT仓库中的位置外,在身体4的离散利基中,还有脂肪细胞,它们可能在各自的微环境中执行特殊功能。例如,骨髓脂肪组织(BMAT)作为脂质储存体,是循环腺炎的主要来源,并与成骨细胞、成骨细胞和造血细胞10、11密切相互作用。皮肤脂肪细胞有助于广泛的过程,包括伤口愈合,免疫反应,热调节,和毛囊生长12,13。此外,表皮性腺细胞可能产生几种腺基质和化学因子,对冠状动脉^疾病14的发展和进展产生局部和系统的影响。肌肉间/肌肉间WAT的扩展与增加的脂肪性、全身性胰岛素抵抗、肌肉力量和行动能力下降呈正相关。此外,在^感染16期间,popliteal脂肪细胞作为淋巴扩张的脂质储存库。虽然不同关节库的具体作用一般不为人所知,但膝关节内的霍法仓库(红外线)现在被认为会导致疾病,包括前膝关节疼痛和骨^{关节炎17。}

虽然区域差异在脂肪性质和功能正在紧张地研究,但目前由于缺乏用于识别和解剖不同小鼠库的标准化协议,该领域受到限制。以前公布的方法通常描述一个或两个特定仓库的隔离,并且缺乏统一切除18、19所需的详细程度。本手稿中描述的协议为许多不同的小鼠脂肪库的特定解剖位置和隔离步骤提供了全面的指南。虽然WAT仓库是本手稿的主要焦点,但间膜BAT的切除也作了详细的描述。使用该协议切除的脂肪组织可用于各种实验端点,包括外植研究、组织学和基因表达分析。

本手稿的目的是为调查人员提供详细的协议,以清晰、准确地识别和隔离突出和较少研究的老鼠脂肪库(图1)。这一资源将有助于更全面地研究不同利基内脂肪细胞的发育、分子和功能特征。

图1:本协议对鼠标脂肪库的原理描述。这张图片改编自Bagchi等人,2018^年4。请点击此处查看此图的较大版本。

研究方案

所有动物程序均经密歇根大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。

1. 安乐死

注:在本视频协议中,使用 4 到 6 个月大的 C57BL/6J 小鼠。

1. 将鼠标放入一个异常蒸汽化器室中,并将异常气流速率调整到 5% 或更大。继续接触离尼,直到呼吸停止一分钟后。然后,将鼠标从蒸发器室中取出,并使用经批准的辅助措施确认安乐死。
   注:批准的辅助措施因机构和动物协议而异,可能包括宫颈脱位或斩首。
2. 将安乐死鼠标放在解剖盘上。使用 70% 乙醇对小鼠的背和腹外表面进行消毒。确保鼠标的外表面足够湿,以尽量减少解剖过程中毛皮的污染。

2. 主要皮下脂肪粘膜的识别和隔离(前皮下、多索伦巴、内脏、谷胱甘肽)和间皮棕色脂肪组织

1. 识别和隔离前皮下沃特
   注:前皮下WAT位于肩骨之间,从颈的鼻环下降到^小鼠7的斧片。该仓库被描述为上颌⁸或隔膜²⁰ WAT,直接位于跨球 BAT 仓库的顶部。
   1. 要分离前皮下库,将鼠标放在其腹部的易发位置。用解剖销将上肢和下肢固定到解剖盘上。
   2. 使用钳子抬起颈部的背皮。使用虹膜剪刀在皮肤上做一个小的(1毫米)的切口。
   3. 将虹膜剪刀的一把刀片插入初始切口中,通过皮肤进行中线垂直切口(2⁄3 厘米),从颈部的颈椎开始,沿脊柱下降到中背部。
   4. 使用虹膜剪刀进行两个水平切口(每个 1 厘米),从中间线横向延伸,在初始垂直切口的顶部和底部。
   5. 使用钳子小心地剥去皮肤,并暴露前皮下仓库。
   6. 使用虹膜剪刀根据组织的自然边界移除仓库。
      注:该方法分离前皮下WAT和间体BAT。
   7. 将解剖仓库放在解剖锅上,并使用虹膜剪刀小心地清除污染 BAT。
2. 识别和隔离c拉西卡利巴特
   注:古典 BAT 位于前皮下 WAT 仓库下方。
   1. 要分离 BAT,请使用虹膜剪刀沿前皮下组织的底部边缘水平切割,沿仓库的自然边界。
   2. 然后,使用虹膜剪刀沿仓库的横向边缘,沿着组织的自然边界进行两个垂直切口。
   3. 使用钳子小心地翻转仓库,并揭示嵌入在WAT中的蝴蝶形隔膜BAT。小心地从周围的WAT解剖BAT。
3. 识别和隔离后皮下皮沃特,
   1. 将鼠标放在鼠标的背面,使其处于一个苏西位置。
   2. 用解剖销固定上肢和下肢后,使用钳子抬起胸骨底部的皮肤,并在皮肤上进行小(1 mm)的切割。
   3. 将虹膜剪刀的一把刀片插入初始切割中,通过皮肤进行中线切口(4⁄5 厘米),从胸骨底部开始,然后下降到尾部底部。进行此切口时要小心,因为腹腔皮肤非常薄,并且与底层腹腔壁密切相关。
   4. 使用虹膜剪刀制作两个水平切口(每个 1 厘米),从中线横向延伸,位于初始垂直切口的顶部。
   5. 使用钳子小心地从围肠腔和腿部剥去皮肤,以找到皮下WAT的后皮下WAT,这应该与皮肤保持关联。用解剖针固定伸出的皮肤,以减轻WAT的完全切除。
      注:虽然后皮下WAT似乎是连续的,但实际上它由三个离散的仓库组成:地皮,内脏,和谷胱甘肽1。腰椎从腰椎延伸到后肢底部。三角形的内脏库从后肢底部穿过腹股沟,并包含一个突出的淋巴结。谷胱甘肽从腹股沟底部延伸,并环绕腿到尾部底部。

3. 内脏脂肪库的识别和隔离(戈纳纳尔、肾上腺、再生、奥门塔尔、腹锥虫)

1. 识别和隔离内脏 WAT 仓库
   注:WAT仓库,大部分包含在胸腔和围肠腔内,使鼠标保持一个苏足的位置。用解剖销将上肢和下肢固定到解剖盘上。
   1. 使用钳子抬起胸骨底部的薄围腔壁,并使用虹膜剪刀进行小切口(1 mm)。
   2. 将虹膜剪刀的一片刀片插入切口中,从围肠腔(胸腔底部)顶部到直肠进行垂直切口(4⁄5 厘米)。
   3. 用虹膜剪刀制作两个水平切口(每个 1 厘米),从中线横向延伸,在垂直切口的顶部和底部。
   4. 使用钳子剥去腹膜,并暴露腹腔内容物。将伸出的围气布固定到解剖锅上。
2. 识别和隔离g g奥纳达尔沃特
   注:Gonadal WAT 围绕女性子宫和卵巢(卵巢或辅助体)和男性的表皮和睾体(表皮)。卵巢WAT环绕卵巢、子宫和膀胱。在肥胖的动物中,性腺和肾上腺WAT看起来是连续的——在这种情况下,将子宫角和卵巢的库分开。发现表皮WAT与表皮、睾体和突出的表皮血管结合。
   1. 找到性腺(睾体或卵巢),并使用钳子抬起相关的性腺WAT。
   2. 使用虹膜剪刀小心地从手膜切除WAT。
3. 识别和隔离p埃里雷纳尔沃特
   注:肾上腺WAT包围肾脏双边。在肥胖的动物中,这个仓库可能低劣地延伸到子宫角和卵巢的顶部。虽然肾上腺WAT传统上被归类为内脏库21,几个小组已经确定它是一个棕色仓库的基础上,血统跟踪和放射性标记葡萄糖吸收研究8,920. 从组织学上讲,它由白色和棕色的脂肪细胞的混合物组成.
   1. 要切除肾上腺库,找到肾脏,并使用钳子将其抬起并拉中线,以查看肾上腺和后视点之间的明显划分。
   2. 切除与肾脏直接相关的 WAT。确保肾上腺,位于肾脏上方,从WAT被移除。
4. 识别和隔离r埃特罗佩里托内纳尔沃特
   注:再生WAT位于后腹壁和脊髓之间的边界处。
   1. 要切除这个仓库,使用钳子将肾脏抬起来,朝中线,以清楚地看到肾上腺和再生油库之间的边界。
      注:在肥胖动物中,识别这种边界可能具有挑战性。
   2. 然后,使用虹膜剪刀仔细解剖后腹壁的后背性WAT。
5. 识别和隔离奥林图沃特
   注:Omental WAT 位于胃的较大曲率上。虽然阴脂肪是人类的重要储存,但它通常只存在于病态肥胖的小鼠中。
   1. 要识别内脏内脏WAT,使用钳子抬起胃。使用虹膜剪刀沿着胃的劣质边界去除相关的脂肪组织。不要混淆视点WAT与胰腺。
6. 识别和隔离美位沃特
   注:Mesenteric WAT 是一种网络状结构,围绕小肠和大肠而相关。
   1. 要切除此仓库,请从消化道的其余部分切除胃部和直肠底部的肠道。使用钳子将肠子从内脏腔中抬出并解开。
   2. 使用虹膜剪刀仔细解剖从肠道远端的肠子WAT,从十二指肠开始,一直持续到结肠末端。小心地去除与水塞站密切相关的淋巴结。
7. 识别和隔离心包WAT
   注:心包WAT位于内脏心周外和心形心膜的外表面,通常沿着心脏^的劣质部分14。
   1. 要进入胸腔,请保持鼠标处于上侧位置。用解剖销将上肢和下肢固定到解剖盘上。
   2. 使用钳子提升胸膜过程(胸骨底部的软骨),并在胸腔壁上进行小切口(1 mm)。
   3. 将虹膜剪刀的一片刀片插入切口中,使两个水平切口(每个 1 厘米)从胸骨底部横向延伸。这将暴露胸腔的隔膜和劣质边界。
   4. 使用解剖剪刀通过肋骨进行两个上升垂直切口(3⁄4 厘米),从胸腔的横向边界向锁骨延伸。
   5. 使用钳子抬起肋骨的腹腔半。使用解剖剪刀沿锁骨的低长度进行最终切割(2 厘米),以去除肋骨并暴露胸腔内容物。
   6. 如果存在,请仔细解剖心包外表面的宫外脂肪。

4. 其他脂肪库的识别和隔离

1. 识别和隔离表观 WAT
   注:心形WAT包含在内脏心周宫内,与心肌表面直接相关。
   1. 如果存在,在10%中性缓冲形式内,在10%中性缓冲形式内,可经组织学上观察到表皮性腺细胞。
2. 识别和隔离p奥利特塔尔沃特
   注:Popliteal WAT 位于后膝的 popliteal fosa 中,包含一个大淋巴结。这个仓库在幼年动物中通常看不到。
   1. 要分离爆裂物 WAT,请使用虹膜剪刀小心地将皮肤从后肢底部取出至足部。
   2. 将骨片放在解剖锅上,用脚上的针固定伸出的腿。确保膝盖后部的波萨朝上。
   3. 使用虹膜剪刀在胃肠肌的中枢和侧头的下部边界进行切割。使用钳子抬起肌肉,并露出三角形的罂粟库。
   4. 使用虹膜剪刀沿自然组织边界切除仓库。
3. 识别和隔离皮肤 WAT
   注:皮肤WAT是位于视网膜真皮和气管肌层之间的一层薄薄的脂肪细胞。
   1. 要通过组织学方法识别皮肤脂肪细胞,请将鼠标放在其胃上,使其处于易发位置。用解剖销固定上肢和下肢后,用70%乙醇喷洒小鼠的外表面以湿润皮肤。
   2. 使用手术刀从鼠标背面皮肤的方形部分去除润湿的毛皮。
   3. 使用虹膜剪刀仔细切除皮肤的被切割部分,其中包括视网膜真皮、皮肤WAT、气管肌酸和一些皮下WAT。
   4. 使用手术刀将切除的皮肤切成细的垂直条。
   5. 将细垂直条置于粘性皮下 WAT 层朝下的位置。
   6. 从一端开始,将条带卷到自己身上,形成螺旋形。螺旋外侧的粘性皮下WAT层将允许辊在固定过程中保持其形状。
   7. 在组织学^处理22之前,将螺旋置于含有10%中性缓冲形式24小时的24孔板的孔中。
4. 识别和隔离肌肉间 WAT
   注:肌肉间WAT被广义地定义为位于肌肉深层筋膜下的脂肪细胞。此术语包括穿插在骨骼肌肌肉纤维(也称为肌肉内 WAT)和位于肌肉束内的脂肪细胞之间的脂肪细胞。野生型小鼠一般没有大量的肌肉间脂肪细胞。然而,在某些条件下,有可能通过组织学方法识别肌肉间WAT。在某些情况下,肌肉间脂肪细胞也可以在光滑的肌肉中找到,如隔膜。
   1. 例如,要分离前部 (TA) 肌肉,请将鼠标放在其背部的上部位置,并使用解剖销将下肢固定到解剖盘上。用70%乙醇润湿皮肤,以尽量减少毛皮污染。
   2. 使用虹膜剪刀小心地从腿部去除皮肤,并暴露位于股骨轴膝盖上方的四头肌肌肉群,以及位于阴心表面膝盖下方的 TA。
      注:TA 在头骨的近端附近较厚,在远端附近更具有肌腱。
   3. 使用虹膜剪刀切除一块肌肉,并固定在10%中性缓冲形式24小时之前组织学^处理22。
5. 识别和隔离关节内 WAT 仓库
   注:关节内 WAT 站点位于双关节内。
   1. 例如,为了识别红外线WAT,例如,通过组织学方法,收获腿骨,详见BMAT部分。
   2. 去除股骨复合物后,使用虹膜剪刀和纱布垫去除尽可能多的肌肉和结缔组织。不要打破双体道德关节。
   3. 在去化及组织学处理前,将股骨-骨质复合物固定在10%中性缓冲形式内24小时(如下所述,步骤4.6.8)。
6. 识别和隔离骨髓脂肪组织
   注:骨髓脂肪组织(BMAT)包含在骨骼中,与造血细胞穿插。从解剖学上讲,BMAT可分为构成性(远端椎骨和胆椎)或调节(中近性椎间盘、股骨和腰椎)10、11。在小鼠中,为RNA和蛋白质分析对骨髓腺细胞进行清洁分离是一项挑战。然而,小鼠骨骼可以很容易地收获,固定,去化和石蜡嵌入组织学分析。
   1. 例如,要收获腿骨,首先从鼠标中取出腿。使用解剖剪刀切割乙酰氨基乙酰氨基乙酰氨基乙酰氨基酚关节,保持股骨头部完好无损。
   2. 使用虹膜剪刀小心地从腿上去除皮肤,露出腿部肌肉。
   3. 使用虹膜剪刀和纱布垫仔细解剖股骨和头骨的主要肌肉。
   4. 当股骨暴露时,沿着骨头的边缘到骨盆和股骨的关节,并小心地从乙酰氨基苯还口关节释放股骨头。使用纱布清洁股骨上剩余的组织。
   5. 沿着铁皮的边框到脚踝关节。小心地从脚踝关节中释放位于蒂比亚顶端的中角马柳。
   6. 一旦股骨-骨质复合物被分离,使用虹膜剪刀和/或纱布尽可能多地去除肌肉和结缔组织。
   7. 将虹膜剪刀的一把刀片插入头骨关节,然后轻轻穿过内侧和侧侧附属韧带以及前十字韧带和后十字韧带,将骨节从股骨中分离出来。不要取出膝关节的胶囊,以确保头骨完好无损。使用纱布清洁任何剩余的组织从头骨。
   8. 在室温下将骨骼固定在10%中性缓冲形式内24小时,然后根据未来需要清洗和储存。
      1. 要使用微计算断层扫描 (μCT) 分析骨骼参数,请将骨骼储存在索伦森的磷酸盐缓冲液中,pH 7.4²³。
      2. 对于BMAT定量和组织学分析,在14%EDTA,pH 7.4中去钙化骨骼,为期10-14天。
      3. 在去钙化后,使用四氧化二氮染色和αCT分析来量化BMAT^24。否则,过程和石蜡嵌入骨骼为公司^学23。

结果

使用上述协议,可以成功识别和隔离各种小鼠脂肪库。皮下(A、E-F)、棕色(B)、内脏(C、D、G-J)和浮皮(K)库的解剖位置如图2所示。

图2:小鼠脂肪库的解剖位置。(A) 前皮下解剖学, (B) 棕色, (C) 表皮...

讨论

随着离散化细胞簇的分子和功能特征的重要性日益得到人们所认识到,该领域的调查人员必须统一识别和切除脂肪库,以便进行进一步分析。迄今为止,对于标准化定位和隔离各种小鼠脂肪库的协议很少。以前公布的方法主要集中于一两个仓库,缺乏由不同的调查员统一识别和切除所需的细节18,19。本手稿对脂肪生物学领域是一种新颖而重要的贡献,因为它为?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Fisher Scientific	22-110-869
24-well plates, untreated	Sigma-Aldrich	CLS3738
70% ethanol (dilute from 95%)	Fisher Scientific	04-355-226
Dissecting forceps with curved tips	VWR	89259-946
Dissecting pan	Carolina Biological Supply Company	629004
Dissecting scissors (sharp/blunt tip)	VWR	82027-588
Gauze sponges	Vitality Medical	2634	Curity 4 x 4 inch gauze sponge, 12 ply
Handi-Pins for dissection	Carolina Biological Supply Company	629132
Iris scissors (straight)	VWR	470018-890
Isoflurane	VetOne	501017
Scalpel	VWR	100499-578	Feather scalpel handle with blade, disposable