多様なマウス脂肪デポの同定と解剖

要約

脂肪細胞は離散的な拠点に存在し、独自のマイクロ環境の中で多様な役割を果たしています。脂肪細胞の性格と機能の地域的な違いが明らかになるにつれて、デポの標準化された識別と隔離は、フィールドの進歩のために重要です。本明細書では、様々なマウス脂肪デポの切除に関する詳細なプロトコルを提示する。

要約

脂肪組織は、局所および世界的なニーズに応じてエネルギーの貯蔵と動員、熱を発生させる代謝の結合、全身恒常症を調節するアディポカインの分泌など、幅広い機能を持つ複雑な器官であり、免疫応答。新しい研究は、体全体の離散的なデポに位置する脂肪細胞の発達、分子、および機能プロファイルの重要な地域的な違いを識別しています。代謝疾患はしばしばデポ特異的効果を示すので、デポの異なる特性は医学的に関連しています。このプロトコルは、多様なマウス脂肪組織の再現性と正確な同定と切除のための詳細な解剖アトラスおよび解剖ガイドを研究者に提供します。離散脂肪デポの標準化された解剖は、様々な栄養および環境条件下での分子および代謝特性および局所および全身病理学的状態への寄与の詳細な比較を可能にする。

概要

脂肪組織は、局所および世界的なニーズに応じてエネルギーの貯蔵と放出、熱調節、およびエネルギーバランス、代謝および免疫応答を調節するアディポカインの分泌を含む全身恒常性において重要な役割を果^たす1,2.脂肪細胞は離散的なデポで体全体に分布し、場合によってはマイクロ環境3、4、5内で専門的な役割を果たします。歴史的に、脂肪組織の研究は、白色脂肪組織(WAT)を中心とし、エネルギー恒常化を維持する上での役割を果たしてきました。ほとんどの脂肪細胞は、皮下および内臓WATデポで体全体に分布しています.これらの拠点の特性は、代謝疾患に対する差動感受性にとって重要である。皮下脂肪細胞は、皮膚の下に位置し、保護代謝^効果5と関連している。内臓脂肪細胞は、生殖器、周膜、後食器、経皮および心膜デポ内に含まれているが、一般的に2型糖尿病および心血管疾患2を含む代謝障害に関連している。.褐色脂肪組織(BAT)も広範囲に研究されている。褐色および褐色様脂肪細胞は結合解除タンパク質1(UCP1)を発現し、適応熱形成およびグルコース恒常性6、7において重要な役割を果たす。古典的な褐色脂肪細胞は、間質BATデポ8に含まれている。褐色脂肪細胞のクラスターは、上頭蓋、赤外線/皮下、頸部、椎体および前庭デポ8、9を含む他の場所でも見られる。

主要なWATおよびBATデポでの位置に加えて、脂肪細胞は、彼らがそれぞれのマイクロ環境内で特殊な機能を実行することができ、体^全体の離散ニッチ4に存在します。例えば、骨髄脂肪組織(BMAT)は脂質貯留部として機能し、循環するアディポネクチンの主要な供給源であり、骨芽細胞、破骨細胞、および血毒細胞10、11と密接に相互作用する。皮膚脂肪細胞は、創傷治癒、免疫応答、体温調節、および毛包成長12、13を含む広範なプロセスに寄与する。また、心外性脂肪細胞は、冠状動脈^疾患14の発症および進行に局所的および全身的な影響を及ぼすいくつかのアディポカインおよびケモカインを産生しきらすことができる。筋肉間/内WATの拡大は、脂肪の増加、全身性インスリン抵抗性、および筋力および運動性の低下と正の相関を有^{している15。}さらに、ポプライト脂肪細胞は、^感染16の間にリンパ拡張のための脂質貯蔵所として機能する。異なる関節デポの具体的な役割は一般的に不明であるが、膝内のホッファデポ(赤外線)は現在、前膝痛および変形性関節^症17を含む病理に寄与すると考えられている。

脂肪細胞の性格と機能の地域的な違いは激しい研究の下にあるが、フィールドは現在、多様なマウスデポの同定と解剖のための標準化されたプロトコルの欠如によって制限されている。以前に公開された方法は、通常、1つまたは2つの特定の拠点の分離を記述しており、均一な切除18、19に必要な詳細レベルを欠いている。この原稿に記載されているプロトコルは、多くの異なるマウス脂肪デポの特定の解剖学的位置および分離ステップのための包括的なガイドを提供する。この原稿の主な焦点はWATデポであるが、間奏BATの切除についても詳しく説明する。このプロトコルを用いて除腹された脂肪組織は、植生研究、組織学、遺伝子発現解析を含む多種多様な実験エンドポイントに使用することができる。

この原稿の目的は、著名なマウス脂肪デポとあまり研究されていないマウス脂肪デポの両方を明確かつ正確に識別し、分離するための詳細なプロトコルを研究者に提供することです(図1)。このリソースは、多様なニッチ内の脂肪細胞の発達、分子、および機能特性のより完全な調査を容易にします。

図1:このプロトコルで解剖されたマウス脂肪デポの概略図図。この画像はBagchi et al., 20184.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

すべての動物の手順は、ミシガン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)の承認を得て行われます。

1. 安楽死

注:このビデオプロトコルの目的のために、4〜6ヶ月前のC57BL/6Jマウスが使用される。

1. マウスをイソルラン気化器室に入れ、イソルラン流量を5%以上に調整します。呼吸が止まってから1分後までイソファラン暴露を続ける。その後、気化器室からマウスを取り出し、承認された二次測定を使用して安楽死を確認します。
   注:承認された二次的措置は、機関や動物のプロトコルによって異なり、頸部脱臼または切断を含む場合があります。
2. 解剖鍋に安楽死マウスを置きます。70%エタノールを使用してマウスの背部および腹部の外面を殺菌する。解剖中に毛皮からの汚染を最小限に抑えるために、マウスの外面が十分に濡れていることを確認します。

2. 主要な皮下脂肪デポ(前皮皮下、ドルソルムバー、鼠径部、臀部)および経皮褐色脂肪組織の同定と分離

1. 前皮の識別と隔離ワット
   注:前皮下WATは肩甲骨の間に位置し、首のうなじから^マウス7の軸索に下降する。このデポは、代わりに、上皮8または介^在20 WATとして記述されており、間質BATデポの上に直接位置しています。
   1. 前皮下デポを分離するには、マウスを胃の上に置き、傾向のある位置に置きます。上肢と下肢を解剖ピンで解剖パンに固定します。
   2. 鉗子を使用して、首のうなじで背中の皮膚を持ち上げます。アイリスはさみを使用して、皮膚に小さな(1mm)カットを行います。
   3. 最初のカットに虹彩はさみの1枚のブレードを挿入し、首の昼寝から背中に沿って下降する皮膚を通して中線垂直切開(2〜3センチメートル)を作ります。
   4. 虹彩はさみを使用して2つの水平切開(各1cm)を作り、最初の垂直切開の上部と下部に、中間線から横方向に伸ばします。
   5. 鉗子を使用して慎重に皮膚を剥がし、前皮のデポを露出させる。
   6. 組織の自然な境界に従ってデポを取り除くために虹彩はさみを使用してください。
      注:この方法は、前皮下の WAT と補助的な BAT の両方を分離します。
   7. 解剖鍋に解剖デポを置き、虹彩はさみを使用して汚染されたBATを慎重に取り除きます。
2. 識別と分離cラッシーバット
   注:古典的なBATは前皮のWATのデポの下にある。
   1. BATを単離するには、虹彩はさみを使用して、デポの自然な境界に従って、前皮組織の下端に沿って水平に切断します。
   2. 次に、虹彩はさみを使用して、組織の自然な境界に従って、デポの横縁に沿って2つの垂直切開を行います。
   3. 鉗子を使用して、慎重にデポを裏返し、WAT内に埋め込まれた蝶形の中間BATを明らかにします。周囲の WAT から BAT を慎重に解剖します。
3. 識別と分離後皮皮ワット,
   1. マウスを背中に置き、上の位置に置きます。
   2. 解剖ピンで上肢と下肢を固定した後、鉗子を使用して胸骨の基部で皮膚を持ち上げ、皮膚に小さな(1mm)カットを行います。
   3. 最初のカットに虹彩はさみの1枚のブレードを挿入し、胸骨の基部から始まり、尾部の基部に下降する皮膚を通して中線切開(4〜5センチメートル)を作ります。腹部の皮膚は非常に薄く、下層の胸腔壁と密接に関連しているので、この切開を行う際には注意してください。
   4. 虹彩はさみを使用して2つの水平切開(各1センチメートル)を作り、最初の垂直切開の上部に、中間線から横方向に伸ばします。
   5. 鉗子を使用して、心膜腔と脚から皮膚を慎重に剥離し、皮膚に関連付けられたままであるべき後皮下WATを見つけます。伸びた皮膚を解剖ピンで固定し、WATの完全な切除を容易にします。
      注:後皮下WATは連続しているように見えますが、実際には3つの離散的なデポで構成されています:ドルソルムバー、鼠径部、および臀部1.ドルソルバルデポは腰椎から後肢の基盤まで延びる。三角形の鼠径部は鼠径部を横切って心室の後肢の基盤から伸び、顕著なリンパ節を含んでいる。臀部は鼠径部の底から劣らず伸び、脚の周りを尾部の底部に巻き付ける。

3. 内臓脂肪デポの同定と分離(性腺、心膜、後食器、経皮、心膜)

1. 識別と分離内臓WATデポ
   注:胸部および胸腔内に主に含まれているWATデポは、マウスをサフィンの位置に保つ。上肢と下肢を解剖ピンで解剖パンに固定します。
   1. 鉗子を使用して胸骨の底部の薄い胸膜腔壁を持ち上げ、虹彩はさみを使用して小さなカット(1ミリメートル)を作ります。
   2. 切り傷に虹彩はさみの1枚の刃を挿入し、胸膜腔の上部(胸骨の基部)から直腸に下降垂直切開(4〜5センチメートル)を作ります。
   3. 虹彩はさみで2つの水平切開(各1cm)を作り、垂直切開の上部と下部に、中間線から横方向に伸びる。
   4. 鉗子を使用して腹膜を剥がし、腹腔の内容物を露出させる。伸ばされたペリオネウムを解剖鍋にピン留めます。
2. 識別と分離gオナダルワット
   注:ゴナダルWATは、女性の子宮と卵巣(卵巣またはパラメトリー)と男性の精巣と精巣(精巣)を囲む。卵巣WATは卵巣、子宮および膀胱を取り囲む。肥満動物では、生殖腺および子宮内WATは連続しているように見え、この場合、子宮角と卵巣のデポを分離する。精巣WATは、精巣、精巣、および顕著な精巣血管に結合していることが見出される。
   1. 生殖腺(精巣または卵巣)を見つけ、鉗子を使用して関連する生殖腺WATを持ち上げます。
   2. アイリスはさみを使用して、生殖腺からWATを慎重に切除します。
3. 識別と分離pエリナルワット
   注:周腎WATは腎臓を両側に取り囲む。肥満動物では、このデポは子宮角と卵巣の上部に劣って伸びるように見える。外膜WATは、伝統的に内臓デポ21として分類されているが、いくつかのグループは、系統トレースと放射ラベルグルコース取り込み研究8、9^{に基づいて茶色のデポとしてそれを識別している、20.}組織学的には、白色と茶色の脂肪細胞の混合物で構成されています。
   1. 腎下出器を切除するには、腎臓を見つけ、鉗子を使用してそれを持ち上げ、それを中間線に引っ張って、腹膜と後腹膜のデポの間の明確な分裂を見ます。
   2. 腎臓に直接関連するWATを物品切り取りする。腎臓の上に位置する副腎がWATから取り除かれることを確認してください。
4. 識別と分離rエトロペリトネアルワット
   注:後腹膜WATは、後腹壁と脊髄の間の境界に沿って、平椎体の位置に位置しています。
   1. このデポを切除するには、鉗子を使用して腎臓を上に持ち上げ、中間線に向かって、腹膜と後腹膜のデポの間の境界を明確に見ます。
      注:肥満動物では、この境界線を特定することは困難な場合があります。
   2. 次に、虹彩はさみを使用して後部根壁から後米後WATを慎重に解剖する。
5. オメンタル WAT の識別と分離
   注:Omental WATは胃のより大きい湾曲に沿って位置する。オメンタル脂肪はヒトの重要な拠点であるが、一般に病的に肥満マウスにのみ存在する。
   1. 内臓WATを識別するには、鉗子を使用して胃を持ち上げます。虹彩はさみを使用して、胃の下縁に沿って関連する脂肪組織を除去します。Omental WAT と膵臓を混同しないでください。
6. 腸間膜の同定と分離ワット
   注:腸間膜WATは、周囲のウェブのような構造であり、小腸と大腸に関連付けられています。
   1. このデポを切除するには、胃と直腸の基部を切断して消化管の残りの部分から腸を取り除きます。鉗子を使用して内臓腔から腸を持ち上げ、それらを解明します。
   2. 十二指腸から始まり、結腸の終わりまで続く腸から腸間膜WATを慎重に解剖するために虹彩はさみを使用してください。腸間膜デポと密接に関連しているリンパ節を慎重に取り除きます。
7. 心膜WATの同定と隔離
   注:心膜WATは、心頭蓋外および心頭頂部膜の外面に位置し、しばしば^心臓14の劣った側面に沿って位置する。
   1. 胸腔にアクセスするには、マウスをサフィンの位置に保ちます。上肢と下肢を解剖ピンで解剖パンに固定します。
   2. 鉗子を使用して、xyphoidプロセス(胸骨の基部の軟骨)を持ち上げ、胸腔壁に小さな(1mm)カットを行います。
   3. 切り傷に虹彩はさみの1枚の刃を挿入し、胸骨の基部から横方向に伸びる2つの水平切開(各1cm)を作ります。これは、胸腔の横隔膜と劣った境界を露出します。
   4. 解剖はさみを使用して、胸腔の横の境界から鎖骨に優れて伸びる2つの上昇垂直切開(3〜4センチメートル)を作ります。
   5. 鉗子を使用して胸部の腹部の半分を持ち上げます。解剖はさみを使用して、鎖骨の劣った長さに沿って最終的なカット(2cm)を行い、胸部の空洞の内容物を取り除きます。
   6. 存在する場合は、心膜の外表面から心膜脂肪を慎重に解剖する。

4. その他の脂肪デポの同定と隔離

1. 心膜WATの同定と隔離
   注:心膜WATは心膜心内に含まれ、心筋の表面に直接関連する。
   1. 存在する場合、心内性脂肪細胞は、24時間の10%中性緩衝ホルマリンで注入された心臓の単離および固定後に組織学的に観察することができる。
2. 識別と分離pオプライトワット
   注:ポプライトWATは、後膝のポプライトフォッサに位置し、大きなリンパ節が含まれています。このデポは、通常、若い動物では見えません。
   1. ポプライトWATを分離するには、虹彩はさみを使用して、後肢の基部から足に皮膚を慎重に除去します。
   2. 解剖鍋に対して膝蓋骨を置き、足にピンで伸ばした脚を固定します。膝の後ろのポプライトフォッサが上向きであることを確認します。
   3. 虹彩はさみを使用して、胃筋の中間および横頭部の下の境界でカットを行います。鉗子を使用して筋肉を持ち上げ、三角形のポピュラーデポデポを明らかにします。
   4. 虹彩はさみを使用して、自然な組織の境界に沿ってデポを切除します。
3. 真皮WATの同定と隔離
   注:真皮WATは、網状真皮と膵臓カルノサス筋層の間に位置する脂肪細胞の薄い層である。
   1. 組織学的方法によって真皮脂肪細胞を同定するには、マウスを胃の上に置き、傾向のある位置に置く。解剖ピンで上肢と下肢を固定した後、70%のエタノールでマウスの外面をスプレーして皮膚を濡らします。
   2. メスを使用して、マウスの背面にある皮膚の正方形の部分から濡れた毛皮を取り除きます。
   3. 虹彩はさみを使用して、網状真皮、真皮WAT、膵カルヌス、およびいくつかの皮下WATを含む皮膚の剃毛部分を慎重に切除します。
   4. メスを使用して、切除された皮膚を薄い垂直ストリップにカットします。
   5. 薄い垂直ストリップを下向きに粘着性の皮下 WAT 層を配置します。
   6. 一方の端から始めて、ストリップをそれ自体に転がしてスパイラルを形成します。スパイラルの外側の粘着性皮下WAT層は、固定中にロールの形状を維持することを可能にします。
   7. 組織学的処理22の前に24時間、10%の中性緩衝ホルマリンを含む24ウェルプレートの井戸にスパイラルを置く。
4. 筋肉間WATの同定と隔離
   注:筋肉間WATは、筋肉の深い筋膜の下に位置する脂肪細胞として広く定義されています.この用語は、骨格筋の筋線維の間に散在する脂肪細胞を含み、筋肉内WATとも呼ばれ、筋肉束自体に位置する脂肪細胞が含まれる。野生型マウスは一般に、筋肉間脂肪細胞の数が多くない。しかし、特定の条件下では、組織学的方法によって筋肉間WATを同定することが可能である。いくつかの条件下では、筋肉間脂肪細胞は、横隔膜などの平滑筋にも見られる。
   1. 脛骨前部(TA)筋を分離するには、例えば、マウスを背中に置き、解剖ピンを使用して下肢を解剖パンに固定する。70%のエタノールで皮膚を濡らして、毛皮による汚染を最小限に抑えます。
   2. 虹彩はさみを使用して、脚から皮膚を慎重に取り除き、大腿骨シャフトの膝の上に位置する四頭筋群と脛骨の腹部表面の膝の下に位置するTAを露出させる。
      注:TAは脛間の近位端付近で厚く、遠位端付近でより傾向がある。
   3. 虹彩はさみを使用して筋肉の一部を切除し、組織学的^処理22の前に24時間の10%中性緩衝ホルマリンで固定する。
5. 関節内 WAT デポの識別と分離
   注:関節内WATデポは、同部内関節内にあります。
   1. 例えば、組織学的方法によって、BMATセクションで詳述されているように脚骨を収穫する。
   2. 大腿骨脛骨複合体を除去した後、虹彩はさみとガーゼパッドを使用して、できるだけ多くの筋肉と結合組織を除去します。脛骨関節を壊ささらさらわさわ
   3. 大腿骨脛骨複合体を、脱石および組織学的処理の前に24時間、10%中性緩衝ホルマリンで固定する(以下、ステップ4.6.8)。
6. 骨髄脂肪組織の同定と分離
   注:骨髄脂肪組織(BMAT)は骨の中に含まれ、血行細胞と散在する。解剖学的に、BMATは構成性(遠位脛骨および口骨椎骨)または調節される(中~近位脛骨、大腿骨および腰椎)10、11に分類することができる。RNAおよびタンパク質分析のための骨髄脂肪細胞のクリーンな単離は、マウスでは困難です。しかし、マウスの骨は組織学的分析のために容易に収穫、固定、デカルシファイドおよびパラフィン埋め込みすることができる。
   1. たとえば、脚の骨を収穫するには、まずマウスから脚を取り除きます。解剖はさみを使用して、大腿骨頭をそのままにして、アセタボフェモラル関節を切断します。
   2. 虹彩はさみを使用して、脚の筋肉を明らかにし、慎重に脚から皮膚を取り除きます。
   3. アイリスはさみとガーゼパッドを使用して、大腿骨と脛骨から主な筋肉を慎重に解剖します。
   4. 大腿骨が露出すると、骨盤と大腿骨の関節に骨の縁に従い、アセタボフェム関節から大腿骨頭部を慎重に放出する。ガーゼを使用して、大腿骨から残りの組織をきれいにします。
   5. 脛痛の境界を足首の関節に従ってください。脛の先端にある中間マレオラスを足首関節から慎重に放出します。
   6. 大腿骨脛骨複合体が単離されたら、虹彩はさみやガーゼを使用して、できるだけ多くの筋肉および結合組織を除去する。
   7. 脛骨の裂け根の1枚の刃を脛骨関節に挿入して脛骨から脛骨を分離し、中間および側側側靭帯および前十字靭帯および前十字靭帯と後十字靭帯を穏やかに切断する。脛骨がそのまま残っていることを確認するために、膝関節のカプセルを取り外さしないでください。ガーゼを使用して脛内から残りの組織をきれいにします。
   8. 室温で24時間の10%中性緩衝ホルマリンで骨を固定し、将来のニーズに応じて洗浄して保存します。
      1. マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)を使用して骨パラメータを解析するには、ソレンセンのリン酸バッファーpH 7.4²³に骨を保存します。
      2. BMAT定量および組織学的分析では、14%EDTA、pH 7.4、10~14日間骨をデカール化します。
      3. デカルシングに続いて、BMAT²⁴を定量化するために四酸化骨染色およびμCT分析を使用する。それ以外の場合は、組織^学23のためのプロセスおよびパラフィン埋め込み骨。

結果

様々なマウス脂肪デポの同定および分離の成功は、上記のプロトコルを用いて達成することができる。皮下(A、E-F)、茶色(B)、内臓(C、D、G-J)、およびポプライト(K)デポの総解剖学的位置を図2に示す。

図2:マウス脂肪デポの総解剖学?...

ディスカッション

離散性脂肪細胞クラスターの多様な分子および機能特性の重要性がますます認識されるにつれて、現場の研究者は、さらなる分析のために脂肪デポを均一に識別し、物品分法を用いることが重要です。現在までに、標準化されたローカリゼーションと広範囲のマウス脂肪デポの分離のためのプロトコルはほとんど存在しません。以前に公開された方法は、主に1つまたは2つの拠点に焦点を当?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Fisher Scientific	22-110-869
24-well plates, untreated	Sigma-Aldrich	CLS3738
70% ethanol (dilute from 95%)	Fisher Scientific	04-355-226
Dissecting forceps with curved tips	VWR	89259-946
Dissecting pan	Carolina Biological Supply Company	629004
Dissecting scissors (sharp/blunt tip)	VWR	82027-588
Gauze sponges	Vitality Medical	2634	Curity 4 x 4 inch gauze sponge, 12 ply
Handi-Pins for dissection	Carolina Biological Supply Company	629132
Iris scissors (straight)	VWR	470018-890
Isoflurane	VetOne	501017
Scalpel	VWR	100499-578	Feather scalpel handle with blade, disposable