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摘要

在这里, 我们提出了一个从小鼠锁骨下静脉采集血液样本的方案。

摘要

老鼠是研究人类疾病和人类健康的最重要的哺乳动物模型。然而, 在研究工作中, 从小鼠身上采集血液样本具有挑战性。当需要少量的血液样本时, 尾巴采血是一种流行的方法。如果需要大量的血液, 可以考虑轨道动脉, 但这种采血方法有伦理问题。以前, 我们通过大鼠锁骨下静脉穿刺法证明了采集血样的可行性和安全性, 并在此研究了该方法是否可用于小鼠。我们报告说, 这种方法对小鼠采血是安全和实用的。在日常研究工作中, 通过锁骨下静脉穿刺采血是一种简便的方法。

引言

在大多数研究实验室中, 从小鼠身上采集血液样本是必不可少的。小鼠采血的传统方法是在需要小于100μl 的样本时进行尾切1。然而, 如果在非末端时间点需要超过100μl 的血液, 眼眶后、下腔出血或胸下血液收集是最常用的技术2。在某些情况下, 采用颈静脉导管插入通过手术切口作为另一种方法3。

然而, 上述方法对小鼠有害。据我们所知, 由于潜在的并发症风险4,5,后眼眶法没有被广泛接受。操作相关的创伤不仅发生在可见区域6、7, 而且也发生在轨道深处6。此外, 下颌下采血压力为 8 , 可能与出血过多2,9有关。在我们之前的研究10,11的基础上, 我们介绍了一种新的策略, 从锁骨下静脉收集小鼠。介绍并讨论了该技术的安全性、可行性和获得的血量。

研究方案

本研究获得湘雅第二医院 (中国长沙) 中南大学动物研究伦理委员会批准。该手稿是根据 ARRIVE (动物研究: 活体实验报告) 指南 12编写的。

1. 材料和动物

  1. 准备所需材料: 75% 乙醇、胶带、脱毛剂、2毫升管、1.0 mL 注射器与针头连接 (26G)、电子秤、肝素和盐水 (见材料表)。
  2. 动物: 准备10只昆明小鼠, 6-8 大, 体重21.6-28.3 克 (见材料表)。根据《实验动物护理和使用指南》对小鼠进行维护。

2. 麻醉和动物定位

  1. 称重鼠标以计算所需的麻醉剂用量。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠 (60 mg/kg) 诱导全身麻醉 14 (图 1).在手术开始时使用无菌眼液中的润滑软膏, 以防止对暴露的眼睛造成损害。
    注: 当没有运动反应的踏板退出反射, 尾巴捏, 或腹部皮肤捏, 被认为是充分麻醉。
  3. 将鼠标放在手术台上的仰角位置, 离工作台边缘2-4 厘米, 以方便静脉穿刺 (图 2)。将四肢固定在舒适的位置, 如图 2所示。整个过程不需要插管或机械通气。
  4. 用棉签在锁骨下空间周围涂上脱毛剂。
  5. 三分钟后, 用湿棉签清洗脱毛剂, 去除皮毛和任何可见的污垢。
  6. 用75% 乙醇消毒锁骨下空间, 然后用干净的纱布干燥。

3. 锁骨下静脉穿刺和采血

  1. 用手指识别锁骨骨和高级胸骨窝的位置。
  2. 找到靠近锁骨骨中间的穿刺部位, 并将其尾端到上。将左手食指侧向穿刺部位, 固定皮肤和皮下组织 (图 3)。
  3. 向上移动针头, 并向高级胸骨窝颅骨。针头进入皮下组织后, 将右手无名指向后移动, 形成负压 (图 3)。
    注: 在此步骤中, 操作人员的右手的位置应略低于操作表, 以使针头向上移动, 并优于水平面。这就是为什么动物被放置在桌子边缘附近的原因。
  4. 将注射器向前移动3-4 毫米, 但如果没有血液流失到注射器中, 则停止。然后慢慢地收回注射器, 并保持负压。在大多数情况下, 血液在回吸时都会进入注射器。
  5. 血液进入注射器后, 请固定注射器并保持负压, 直到在注射器中收集所需体积 (200μl) 的血液。
  6. 采血后, 取出穿刺针, 用棉签轻轻按压穿刺部位1-2分钟以止血。然后, 让老鼠回到笼子里。
    注: 偶尔, 一个人不能得到血液在他/她的第一次尝试。侧向调整针头的方向, 重复步骤 3.3-3.5。如果3次尝试未能获得血液样本, 切换到另一侧。
  7. 将血液样本转移到肝素化管中。

4. 小鼠恢复

  1. 在五巴比妥麻醉生效的同时, 通过提供热支持来恢复速度, 直到小鼠再次移动。

结果

我们在10只昆明小鼠身上重复了这个过程 (雄性 n = 5, 雌性 n = 5, 体重25.4±2.0 克)。有九个程序在右侧成功。一个案件在3次尝试之内失败了在右边和血液收集成功在左边。时间过程 (从穿刺到获得所需的血量) 在 30-126秒 (平均684±26.4 秒) 之间。采血量设置为200Μl 左右 (平均 203±11.6μl)。血液收集在1到4次尝试之内成功了。血液采样成功在第一次尝试在两只小鼠和在一次小鼠的4次尝试以后;取样在其他小鼠身上进行了2-3 次尝试。所有数据见表 1。所有动物在血液取样后30分钟内存活和恢复。在所有观察到的参数中, 性别之间没有明显差异 (表 1)。

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图 1: 腹腔内注射全身麻醉请点击这里查看此图的较大版本.

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图 2: 鼠标的仰角位置.请注意, 边缘和鼠标之间的距离为2-4 厘米. 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 3: 操作人员手的穿刺部位和姿势.请注意, 右手无名指向后移动, 形成负压。左手被放置在穿刺部位的侧面, 以固定皮肤和皮下组织。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 4: 锁骨下静脉、锁骨骨和胸骨上窝的位置.锁骨下静脉在锁骨下的锁骨下 , 在上胸骨窝入上腔静脉。请点击这里查看此图的较大版本.

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图 5: 手术过程中容器壁与针头的关系.(A) 当针头向前移动时, 锁骨下静脉的壁相互附着, 因此不能抽血。(B) 在向后拔针的同时 , 墙壁彼此分开 , 血液可以。请点击这里查看此图的较大版本.

变量共计 (10)男性 (n捕捞 5)女 (n=5)P 值
体重 (g)25.3±2。225.3±3。025.4±1。30.926
血量 (μL)203.0±11。6208±13。01988±8。40.187
时间路线684±26。470.6±35。1662.±18。00.809
提款2.3±0。92.4±1。12.2±0。80.760
所有观测参数、所有 P 值和 gt;0.05 均无显著性别差异。

表 1: 观察到的性别参数

讨论

本报告是以往通过大鼠11层下静脉穿刺进行血液取样研究的延伸.由于老鼠是最常用的研究动物, 看看这种技术是否也能应用于老鼠, 这将是很有价值的。挑战来自于锁骨下静脉的直径相对较小。

在目前的研究中, 我们发现小鼠锁骨下穿刺是一种可行、可靠的采血方式。与传统的方法, 如尾静脉切割或眼眶血液收集相比, 目前的方法不存在伦理问题。所有动物在这个过程后生存了没有液体补充剂大约200μl 的血液提取, 并且动物可用于进一步的实验研究。从理论上讲, 每次总样本量提取不能超过循环血总量的 1 0%, 成年动物的总体积为 5 5 至 7 0 mlkg 体重5。对于本研究中使用的小鼠 (21.6-28.3 克), 最大体积提取量应在200μl 左右。因此, 我们将每只老鼠的血液采样量设置在200μl 左右。无法测量血压、心率和其他压力参数是本报告的主要局限性。

充足的全身麻醉是保证穿刺成功的另一个重要问题。小鼠在穿刺过程中应保持安静, 以避免被针头伤害血管的风险。我们发现, 五巴比妥钠在 60 mgkg 的全身麻醉可以满足理想的麻醉深度。此代理的缺点是恢复时间相对较长 (平均约 30分钟)。在一些研究所, 吸入异氟醚的恢复时间很短, 应考虑作为替代麻醉选择15。

锁骨下静脉的位置如图 4所示。由于静脉的薄壁和低压, 在针头向前移动时, 锁骨下静脉的前壁和后壁会在针头的压力下相互附着 (图 5A)。当慢慢向后取出柱塞时 , 连接的壁将自发分离 , 针尖可以进入血管的真正腔 , 血液可以在持续的负压入注射器 (图 5B) 。使用真空血液收集系统16也可能有利于血液采集。由于小鼠锁骨下静脉的直径相对较小, 即使是有经验的操作人员也可能出现故障。对于新手, 我们建议在大鼠中穿刺锁骨下静脉, 如报告11。在大鼠多次成功穿刺后, 小鼠锁骨下静脉穿刺成功率可显著提高。确保确切的穿刺位置只是锁骨骨中间的尾端。针头向上移动, 颅骨向上移动到上胸骨窝是保证成功穿刺的其他关键点。

总之, 锁骨下静脉穿刺是一种安全有效的小鼠采血方法。该方法除尾静脉切割和后眼眶丛吸血外, 还具有可行性、安全性, 适用于小鼠在多个时间点的观测研究。

披露声明

未声明。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金81670269、81500355号和81670269赠款的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.0 mL syringeShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China)20163151593
75% ethanolDepartment of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South Universitymade in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity
adhesive tape3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany)1534-1
canvas glovesfor anesthesia
electronic scaleDongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China)KP-3000
epilating agentFrance Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China)8281744
heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU)Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China)H32025851
miceHunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China) Kunming spcies
needle, 26G, 0.45 mm x 16 mmShandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China)20163151593
pentobarbital sodium (used solution 1%)MerckP-010-1ML
physiological saline, 100 mLHunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China)H43020454
stastical softwareInternational Business MachinesSPSS Statistics 25
tube, 2 mLHubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China)MCT-150-C

参考文献

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