Recolección de sangre a través de punción venosa Subclaviana en ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para tomar muestras de sangre de la vena subclaviana de los ratones.

Resumen

El ratón es el modelo de mamíferos más importante para el estudio de las enfermedades humanas y la salud humana. Sin embargo, la recolección de muestras de sangre de ratones es desafiante en trabajos de investigación. La recolección de sangre de cola es un método popular cuando se necesita una pequeña cantidad de muestras de sangre. La arteria orbital podría considerarse si se necesita una gran cantidad de sangre, pero este método de recolección de sangre tiene problemas éticos. Anteriormente, demostramos la viabilidad y seguridad de la recolección de muestras de sangre a través de la punción de las venas subclavias en ratas, y aquí investigamos si este método podría ser utilizado en ratones. Informamos que este método es seguro y práctico para la recolección de sangre en ratones. La recolección de sangre a través de la punción venosa subclaviana en ratones puede ser un método conveniente en trabajos de investigación diarios.

Introducción

La recolección de muestras de sangre de ratones es esencial en la mayoría de laboratorios de investigación. Los enfoques convencionales para la recolección de sangre en ratones son el corte de cola cuando se necesita menos de 100 μL de muestra¹. Sin embargo, si se requieren más de 100 μl de sangre en un punto de tiempo no terminal, el sangrado retroorbital, submandibular o la recolección de sangre submentonianos son las técnicas más comúnmente consideradas². En algunas ocasiones, el cateterismo de la vena yugular a través de una incisión quirúrgica se adoptó como un método alternativo³.

Sin embargo, los métodos anteriores son perjudiciales para los ratones. Al mejor de nuestro conocimiento, el método retroorbital no es ampliamente aceptado debido al riesgo potencial de complicaciones^4,5. El trauma relacionado con la operación no solo ocurre en la zona visible^6,7, sino también en la órbita⁶. Además, la recolección de sangre submandibular es estresante⁸ y puede estar asociada con un sangrado excesivo de^2,9. Basándonos en nuestra investigación anterior^10,11, aquí presentamos una nueva estrategia para la recolección de sangre de la vena subclana en ratones. Se presentan y discuten la seguridad, la viabilidad y el volumen sanguíneo obtenido con esta técnica.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad Central del sur para la investigación animal del segundo hospital Xiangya (Changsha, China). El manuscrito fue preparado de acuerdo con las pautas de llegada (investigación animal: reporte de experimentos in vivo)¹².

1. materiales y animales

1. Prepare los materiales requeridos: etanol al 75%, cinta adhesiva, agente de depilación, tubo de 2 mL, jeringa de 1,0 mL conectada con aguja (26G), báscula electrónica, heparina y solución salina (ver tabla de materiales).
2. Animales: preparar 10 ratones Kunming, 6-8 semanas de edad y un peso de 21,6-28,3 g (ver tabla de materiales). Mantener los ratones de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio¹³.

2. anestesia y posicionamiento de los animales

1. Pesar el ratón para calcular la dosis requerida de agente anestésico.
2. Inyectar pentobarbital sódico (60 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal para inducir anestesia general¹⁴ (figura 1). Aplicar una pomada de lubricación ocular estéril al inicio del procedimiento para evitar daños a los ojos expuestos.
   Nota: se considera que los ratones están suficientemente anestesiados cuando no muestran ninguna respuesta motora a las pruebas del reflejo de abstinencia del pedal, el pellizco de la cola o la pizca de piel abdominal.
3. Coloque el ratón en la mesa de operaciones en posición supina y a 2-4 cm de distancia del borde de la mesa para facilitar la punción venosa (figura 2). Fije las extremidades en una posición cómoda como se muestra en la figura 2. No se necesita intubación ni ventilación mecánica en todo el procedimiento.
4. Aplicar un agente de depilación alrededor del espacio infraclavicular con un hisopo de algodón.
5. Tres minutos después, lave el agente de depilación con un bastoncillo de algodón húmedo para quitar el pelaje y cualquier suciedad visible.
6. Esterilizar el espacio infraclavicular con etanol al 75% y luego secar con gasa limpia.

3. punción venosa subclaviana y recolección de sangre

1. Identifique la ubicación del hueso de la clavícula y la fosa esternal superior con un dedo.
2. Localice el sitio de punción cerca del centro del hueso de la clavícula y caudal hacia él. Coloque el dedo índice izquierdo lateral en el sitio de punción para fijar la piel y el tejido subcutáneo (figura 3).
3. Mueva la aguja hacia arriba y craneal hacia la fosa esternal superior. Una vez que la aguja entra en el tejido subcutáneo, mueva el dedo anular de la mano derecha hacia atrás para formar una presión negativa (figura 3).
   Nota: durante este paso, la posición de la mano derecha del operador debe ser ligeramente inferior a la de la mesa de operaciones para hacer que la aguja se mueva hacia arriba y superior al plano horizontal. Es por eso que el animal se coloca cerca del borde de la mesa.
4. Mueva la jeringa hacia adelante 3-4 mm, pero Deténgase si no hay drenaje de sangre en la jeringa. Luego, lentamente, saque la jeringa y mantenga la presión negativa en ella. En la mayoría de las ocasiones, la sangre ingresaría a la jeringa al volver a dibujar.
5. Una vez que la sangre entra en la jeringa, fije la jeringa y mantenga la presión negativa hasta que el volumen requerido (200 μL) de sangre se recolecte en la jeringa.
6. Después de la recolección de sangre, retire la aguja de punción y presione el sitio de punción con un bastoncillo de algodón ligeramente durante 1-2 minutos para detener el sangrado. Luego, devuelva ratones a la jaula.
   Nota: ocasionalmente, uno no pudo obtener la sangre en su primer intento. Ajuste la dirección de la aguja lateralmente y repita los pasos 3.3-3.5. Si 3 intentos fallan en obtener la muestra de sangre, cambie al otro lado.
7. Transfiera la muestra de sangre a un tubo heparinizado.

4. recuperación de ratones

1. Mientras la anestesia pentobarbital esté en vigor, acelere la recuperación proporcionando apoyo térmico hasta que el ratón vuelva a moverse.

Resultados

Repetimos este procedimiento en 10 ratones Kunming (macho n = 5, hembra n = 5, peso 25,4 ± 2,0 g). Nueve procedimientos tuvieron éxito en el lado derecho. Un caso falló dentro de 3 intentos en el lado derecho y la recolección de sangre tuvo éxito en el lado izquierdo. El curso de tiempo (desde la punción hasta la obtención del volumen sanguíneo requerido) osciló entre 35-126 segundos (promedio 68,4 ± 26,4 s). El volumen de recolección de sangre se estableció en alrededor de 200 μL (promedio de 203 ± 11,6 μL). La recolección de sangre tuvo éxito en 1 a 4 intentos. El muestreo de sangre tuvo éxito en el primer intento en dos ratones y después de 4 intentos en un ratón; el muestreo tomó 2-3 intentos en los otros ratones. Todos los datos se ilustraron en la tabla 1. Todos los animales sobrevivieron y se recuperaron dentro de 30 minutos después del muestreo de sangre. No hubo diferencia significativa entre los sexos para todos los parámetros observados (tabla 1).

Figura 1 : Anestesia general mediante inyección intraperitoneal Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : La posición supina del ratón. Observe que la distancia entre el margen y el ratón es de 2-4 cm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : El sitio de punción y la postura de las manos del operador. Tenga en cuenta que el dedo anular de la mano derecha se desplaza hacia atrás para formar una presión negativa. La mano izquierda se coloca lateral al sitio de punción para fijar la piel y los tejidos subcutáneos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : La ubicación de la vena subclaviana, el hueso de la clavícula y la fosa esternal superior. La vena subclaviana se encuentra bajo el hueso de la clavícula y desemboca en la vena cava superior bajo la fosa esternal superior. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : La relación entre la pared del recipiente y la aguja durante el procedimiento. (A) las paredes de la vena subclaviana se unen entre sí a medida que la aguja avanza, por lo que no se puede extraer sangre. (B) mientras retira la aguja hacia atrás, las paredes se separan entre sí y la sangre podría extraerse. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Variable	Total (n = 10)	Macho (n = 5)	Hembra (n = 5)	Valor P
Peso corporal (g)	25,3 ± 2,2	25,3 ± 3,0	25,4 ± 1,3	0,926
Volumen sanguíneo (μL)	203,0 ± 11,6	208 ± 13,0	198 ± 8,4	0,187
Curso de tiempo (s)	68,4 ± 26,4	70,6 ± 35,1	66,2 ± 18,0	0,809
Retiros	2,3 ± 0,9	2,4 ± 1,1	2,2 ± 0,8	0,760
No hubo diferencias de sexo significativas para todos los parámetros observados, todo el valor P > 0.05.

Tabla 1: parámetros observados entre sexos

Discusión

Este informe representa una extensión de investigaciones previas sobre el muestreo de sangre a través de la punción de la vena subclana en ratas¹¹. Como el ratón es el animal de investigación más comúnmente utilizado, sería valioso para ver si esta técnica también se puede aplicar a los ratones. El desafío proviene del diámetro relativamente más pequeño de la vena subclaviana.

En la presente investigación, descubrimos que la punción subclaviana en ratones es una forma factible y confiable de recolectar sangre. En comparación con los métodos convencionales como el corte de la vena de cola o la recolección de sangre orbital, no hay problemas éticos del método actual. Todos los animales sobrevivieron después de este procedimiento sin suplementos líquidos después de alrededor de 200 μL de extracción de sangre, y los animales podrían ser utilizados para otros estudios experimentales. Teóricamente, la extracción total de la muestra no pudo llegar a más del 10% del volumen total circulante de la sangre cada vez y el volumen total de un animal adulto es de 55 a 70 mL/kg de peso corporal⁵. Para los ratones utilizados en esta investigación (21,6-28.3 g), la extracción de volumen máximo debe ser de alrededor de 200 μL. Por lo tanto, hemos fijado la cantidad de muestreo de sangre alrededor de 200 μL para cada ratón. La incapacidad para medir la presión arterial, la frecuencia cardíaca y otros parámetros de estrés son las principales limitaciones de este informe.

La anestesia general suficiente es otro problema importante para garantizar el éxito de la punción. Los ratones deben permanecer en silencio durante el procedimiento de punción para evitar el riesgo de lesionar el recipiente por la aguja. Descubrimos que el pentobarbital sódico a 60 mg/kg para la anestesia general podría satisfacer la profundidad ideal de la anestesia. Una desventaja de este agente es el tiempo de recuperación relativamente largo (promediando unos 30 minutos). En algunos institutos, la inhalación de isoflurano se utiliza para el tiempo de recuperación corto y debe tenerse en cuenta como una opción de anestesia alternativa¹⁵.

La ubicación de la vena subclaviana se muestra en la figura 4. Debido a la pared delgada y a la baja presión en la vena, la pared anterior y posterior de la vena subclática se acoplaría entre sí bajo la presión de una aguja mientras la aguja avanza (figura 5A). Mientras retira el émbolo lentamente hacia atrás, las paredes adjuntas se separarán espontáneamente, y la punta de la aguja podría entrar en la cavidad verdadera del recipiente y la sangre podría drenar en la jeringa bajo presión negativa sostenida (figura 5b). El uso de un sistema de recolección de sangre al vacío¹⁶ también podría favorecer la recolección de sangre. Debido al diámetro relativamente pequeño de la vena subclana de los ratones, puede haber fallas incluso para un operador experimentado. Para un principiante, recomendamos la punción venosa subclaviana en ratas según lo reportado¹¹. Después de varios intentos de perforación exitosos en ratas, la tasa de éxito de la punción de la vena subclaviana en ratones podría mejorarse significativamente. Asegúrese de que la ubicación exacta de la punción es sólo caudal a la mitad del hueso de la clavícula. La aguja que se mueve hacia arriba y craneal a la fosa esternal superior son otros puntos clave para garantizar una punción exitosa.

En conclusión, la punción venosa subclana es un método seguro y eficaz para la recolección de sangre en ratones. Además del corte de la vena de la cola y la recolección de sangre del plexo retro-orbital, este método es factible, seguro y adecuado para investigaciones observacionales en varios momentos en ratones.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
75% ethanol	Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University	made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity
adhesive tape	3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany)	1534-1
canvas gloves	for anesthesia
electronic scale	Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China)	KP-3000
epilating agent	France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China)	8281744
heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU)	Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China)	H32025851
mice	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China)	Kunming spcies
needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
pentobarbital sodium (used solution 1%)	Merck	P-010-1ML
physiological saline, 100 mL	Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China)	H43020454
stastical software	International Business Machines	SPSS Statistics 25
tube, 2 mL	Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China)	MCT-150-C