マウスの鎖骨下静脈穿刺による血液採取

要約

ここでは、マウスの鎖骨下静脈から血液サンプルを採取するプロトコールを示す。

要約

マウスは人間の病気と人間の健康を研究するための最も重要な哺乳類モデルです。しかし、マウスからの血液サンプル採取は、研究作業において困難である。尾血のコレクションは少量の血のサンプルが必要とされるとき普及した方法である。大量の血液が必要な場合には、軌道動脈を考慮することができますが、この採血方法には倫理的問題があります。以前は、ラットの鎖骨下静脈穿刺による血液検体採取の実現性と安全性を実証し、マウスでこの方法が使用できるかどうかを調べた。我々は、この方法は、マウスの採血のための安全かつ実用的であることを報告する。マウスの鎖骨下静脈穿刺による採血は、日常の研究作業において簡便な方法となり得る。

概要

マウスからの血液サンプル採取は、ほとんどの研究室において不可欠である。マウスにおける採血のための従来のアプローチは、試料の100μ l 未満が必要な場合のテール切断である¹.しかし、非終端の時点で100μ l 以上の血液が必要とされる場合、眼窩後方、顎下出血または submental 採血は、最も一般的に考えられる技法²である。いくつかの機会において、外科的切開を通して頸静脈のカテーテル法が、代替方法³として採用された。

それにもかかわらず、上記の方法は、マウスに有害である。私たちの知識の最大のために、眼窩後方法は、合併症の潜在的なリスクのために広く受け入れられていません^4,5.操作関連の外傷は、可視領域^6、7だけでなく、軌道⁶内でも深く起こる。また、顎下血液採取はストレス⁸であり、過剰な出血^2,9に関連している可能性があります。我々の先行研究^10,11に基づいて、ここではマウスの鎖骨下静脈からの血液採取のための新しい戦略を紹介する。この技術を用いて安全性、実現性、および得られた血液量を提示し、議論する。

プロトコル

この研究は、第 2 Xiangya 病院 (中国長沙市) からの動物研究のための中央南大学倫理委員会によって承認されました。その原稿は到着に応じて準備された (動物研究: 生体内実験の報告) ガイドライン¹².

1. 素材と動物

1. 必要な材料を準備:75% エタノール、粘着テープ、epilating 剤、2ml チューブ、1.0 は、針 (26G)、電子スケール、ヘパリンおよび生理食塩水に接続されたシリンジ (材料の表を参照してください)。
2. 動物:10 昆明マウスを準備し、6-8 週齢、重さ 21.6 ~ 28.3 g (資料表参照)。実験動物¹³のケアおよび使用のためのガイドに従ってマウスを維持する。

2. 麻酔と動物のポジショニング

1. 麻酔薬の必要な投与量を計算するために、マウスを計量します。
2. 全身麻酔¹⁴を誘導するために腹腔内注射を通じて、ペントバルビタール (60 mg/kg) のナトリウムを注入する (図 1)。露出した目への損傷を防ぐためにプロシージャの開始で生殖不能の目の潤滑の軟膏を加えなさい。
   注: マウスは、ペダル離脱反射、尾ピンチ、または腹部の皮膚ピンチのテストに対してモータ応答を示さない場合に十分に麻酔されると考えられる。
3. マウスを仰向けの姿勢で操作テーブルに置き、静脈の穿刺を促進するためにテーブルの端から 2-4 cm 離れなさい (図 2)。図 2に示すように、四肢を快適な位置に固定します。挿管装置か機械換気は全体のプロシージャで必要とされない。
4. 綿棒で infraclavicular スペースの周りに epilating 剤を塗布します。
5. 3分後、湿った綿棒で epilating 剤を洗って、毛皮と目に見える汚れを取り除きます。
6. 75% のエタノールで infraclavicular 空間を滅菌し、清潔なガーゼで乾燥させます。

3. 鎖骨下静脈穿刺と採血

1. 指で鎖骨骨と優れた胸骨窩の位置を特定します。
2. 鎖骨の真ん中に近い穿刺部位を見つけます。左の人差し指を穿刺部位に置き、皮膚および皮下組織を固定する (図 3)。
3. 針を上方に移動し、優れた胸骨窩に向かって cranially ます。針が皮下組織に入ると、右手の薬指を後方に動かして陰圧を形成する (図 3)。
   注: このステップでは、オペレータの右手の位置は、針を水平面より上方に移動させるために、操作テーブルよりもわずかに低くする必要があります。動物がテーブルの端の近くに配置されている理由です。
4. シリンジを前方に 3-4 mm 移動しますが、シリンジに血液が流れない場合は停止します。その後、ゆっくりとシリンジを引き戻し、その中に負圧を保持します。ほとんどの場合、血液は、戻って描画するときにシリンジに入ります。
5. 血液がシリンジに入ると、シリンジを固定し、必要な量 (200 μ l) の血液がシリンジに集められるまで、負の圧力を維持します。
6. 採血後、穿刺針を取り出し、1-2 分間わずかに綿棒で穿刺部位を押して出血を止める。その後、マウスをケージに戻す。
   注: 時には、1つは彼/彼女の最初の試みで血液を得ることができませんでした。横方向に針を調整し、ステップ 3.3-3.5 を繰り返します。3回の試行で血液サンプルが得られない場合は、反対側に切り替えます。
7. 血液サンプルをヘパリン処理チューブに移します。

4. マウスの回復

1. ペントバルビタール麻酔は有効ですが、マウスが再び動くまで熱サポートを提供することで、迅速な回復を実現します。

結果

我々は、10昆明マウス (雄 n = 5、メス n = 5、重量25.4 ± 2.0 g) でこの手順を繰り返した。右側には9つのプロシージャが成功しました。1つのケースが右側で3回の試行で失敗し、左側に採血が成功しました。時間経過 (穿刺から必要な血液量を得るまで) は35-126 秒 (平均68.4 ±26.4 秒) の範囲であった。採血量は、約200μ l (平均203±11.6 μ l) に設定した。採血は 1 ~ 4 回以内に成功した。血液サンプリングは、2匹のマウスでの最初の試みと1匹での4回の試みの後に成功した。サンプリングは、他のマウスで2-3 の試みを要した。すべてのデータを表 1に示した。すべての動物は生き残ったし、血液サンプリング後30分以内に回復しました。すべての観察されたパラメータについて、男女間に有意差はなかった (表 1)。

図 1: 腹腔内注射による全身麻酔この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: マウスの仰向けの位置。注: 余白とマウスの距離は 2-4 cm です。こちらをクリックして、この図の大規模なバージョンをご覧ください。

図 3: 操縦者の手の穿刺の場所そして姿勢。右手の薬指が逆方向に移動して、負の圧力を形成することに注意してください。左手は、皮膚および皮下組織を固定するために穿刺部位の横に配置される。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: 鎖骨下静脈の位置、鎖骨骨および優れた胸骨窩鎖骨の下にある鎖骨下静脈のコースは、優れた胸骨窩の下の優れた大静脈に流れ出ます。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: 手順中の血管壁と針の関係(A) 鎖骨下静脈の壁は、針が前に進むにつれて互いに付着するので、血液を取り出すことができませんでした。(B) 針を後方に引き出しながら、壁を互いに分離し、血液を取り出すことができた。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

変数	合計 (n = 10)	男性 (n = 5)	メス (n = 5)	P 値
体重 (g)	25.3 ±2.2	25.3 ±3.0	25.4 ±1.3	0.926
血液量 (μ l)	203.0 ±11.6	208±13.0	198±8.4	0.187
タイムコース (s)	68.4 ±26.4	70.6 ±35.1	66.2 ±18.0	0.809
引き出し	2.3 ±0.9	2.4 ±1.1	2.2 ±0.8	0.760
すべての観察されたパラメータに有意な性差はなく、全ての P 値 > 0.05 であった。

表 1: 男女間の観察されたパラメータ

ディスカッション

この報告は、ラット¹¹における鎖骨下静脈穿刺を介した血液採取に関する以前の研究の延長を表している。マウスは、最も一般的に使用される研究動物であるように、この技術はまた、マウスに適用することができるかどうかを確認することは有益であろう。課題は、鎖骨下静脈の比較的小さい直径に由来する。

本研究では、マウスの鎖骨下穿刺が血液を採取するための実現可能で信頼できる方法であることを発見した。尾静脈切断や軌道採血などの従来の方法と比較して、本方法の倫理的問題はない。すべての動物は、約200μ l の血液抽出後に液体サプリメントなしでこの手順の後に生き残った、そして動物はさらなる実験的研究のために使用することができた。理論的には、合計サンプル量の抽出は、毎回の総循環血液量の 10% 以上に達することができず、成人動物の総体積は55〜 70 mL/kg 体重⁵である。この研究で使用されるマウス (21.6-28.3 g) については、最大量の抽出は約200μ l でなければなりません。このようにして、各マウスの血液サンプリング量を200μ l 前後に設定した。血圧、心拍数、その他のストレスパラメータを測定できないことは、このレポートの主な制限事項です。

十分な全身麻酔は、穿刺の成功を保証するもう一つの重要な問題である。マウスは、針によって血管を傷つけるリスクを避けるために、穿刺手順の間は静かなままでなければならない。我々は、全身麻酔に 60 mg/kg でペントバルビタールナトリウムが麻酔の理想的な深さを満たすことができることを発見しました。このエージェントの欠点は、比較的長い回復時間 (平均約30分) です。一部の研究所では、イソフルラン吸入が短い回復時間のために使用され、代替麻酔選択¹⁵として考慮されるべきである。

鎖骨下静脈の位置を図 4に示す。細い壁と静脈の低圧のために、鎖骨下静脈の前と後壁は、針が前方に移動している間に針の圧力の下で互いに付着するであろう (図 5a)。プランジャーをゆっくりと後方に引き出す一方で、アタッチされた壁は自発的に分離し、針の先端が血管の真の空洞に入り、血液がシリンジに持続的な負圧の下で流出する可能性があります (図 5b)。真空採血システム¹⁶の使用はまた、血液採取を支持してもよい。マウス鎖骨下静脈の比較的小さい直径のために、経験豊富なオペレータに対しても障害が生じることがある。初心者のために、報告された¹¹としてラットに鎖骨下静脈穿刺を推奨する。ラットにおいていくつかの成功した穿刺の試みの後、マウスにおける鎖骨下静脈穿刺の成功率は、有意に増強され得る。正確な穿刺位置が鎖骨骨の中央のちょうど尾部であることを確認してください。上方および頭蓋を優れた胸骨窩に移動する針は、穿刺の成功を保証するための他の重要なポイントである。

結論として、鎖骨下静脈穿刺は、マウスにおける血液採取のための安全で効果的な方法である。尾静脈の切断およびレトロ軌道神経叢の血のコレクションのほかに、この方法は可能、安全、およびマウスの複数の時点の観察的な研究のために適している。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
75% ethanol	Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University	made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity
adhesive tape	3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany)	1534-1
canvas gloves	for anesthesia
electronic scale	Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China)	KP-3000
epilating agent	France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China)	8281744
heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU)	Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China)	H32025851
mice	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China)	Kunming spcies
needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
pentobarbital sodium (used solution 1%)	Merck	P-010-1ML
physiological saline, 100 mL	Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China)	H43020454
stastical software	International Business Machines	SPSS Statistics 25
tube, 2 mL	Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China)	MCT-150-C