생쥐의 쇄 골 정 맥 천자를 통한 혈액 채취

요약

여기서, 우리는 마우스의 쇄 골 정 맥 으로부터 혈액 샘플을 채취 하는 프로토콜을 제시 한다.

초록

마우스는 인간의 질병과 인간의 건강을 연구 하기 위한 가장 중요 한 포유류 모델입니다. 그러나, 쥐에서 혈액 샘플 수집은 연구 작업에서 도전적입니다. 꼬리 혈액 수집은 소량의 혈액 샘플이 필요할 때 인기 있는 방법입니다. 많은 양의 혈액이 필요 하지만이 혈액 수집 방법은 윤리적 문제가 있는 경우 궤도 동맥을 고려할 수 있습니다. 이전에는 쥐에서 쇄 골 정 맥 천자를 통해 혈액 샘플 수집의 타당성과 안전성을 입증 했으며, 여기에서이 방법이 쥐에 사용 될 수 있는지 여부를 조사 합니다. 이 방법은 생쥐의 혈액 채취에 안전 하 고 실용적 이라고 보고 합니다. 생쥐의 쇄 골 정 맥 천자를 통한 혈액 채취는 일상적인 연구 작업에서 편리한 방법이 될 수 있다.

서문

마우스에서 혈액 샘플 수집은 대부분의 연구 실험실에서 필수적입니다. 마우스에서 혈액 수집을 위한 종래의 접근법은 샘플의 100 µ L 미만이 필요한 경우 꼬리 절단이 필요하다. 그러나, 비 말단 시간 지점에서 혈액의 100 µ L 이상이 요구 되는 경우에, 레트로바이러스, 턱 밑 출혈 또는 정신 혈액 수집은 가장 일반적으로 고려 되는 기술²입니다. 어떤 경우에, 외과 적 절 개를 통한 경 정 맥 도관은 대안적인 방법³으로 채택 되었다.

그럼에도 불구 하 고, 상기 방법은 생쥐에 게 유해 합니다. 우리의 지식의 최고에, 레트로 궤도 방법은 합병증의 잠재적인 위험 때문에 널리 받아들여지지 않는다^4,5. 수술 관련 외상은 가시 영역 (⁶)에서 발생 뿐만 아니라, 깊이 궤도 내에서⁶. 게다가, 턱 아래 혈액 수집은 스트레스가⁸ 이 고 과도 한 출혈^2,9와 관련 될 수 있습니다. 우리의 이전 연구^10,11에 기초 하 여, 여기에 우리는 쥐에 있는 쇄 골 정 맥에서 혈액 수집을 위한 새로운 전략을 소개 합니다. 이 기술을 사용 하 여 안전, 타당성 및 얻은 혈액 부피를 제시 하 고 논의 합니다.

프로토콜

이 연구는 두 번째 시앙 야 병원 (중국 창사)에서 동물 연구를 위한 중앙 남 대학교 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 원고는 도착 (동물 연구: 생체 내 실험의 보고) 가이드라인¹²에 따라 제조 하였다.

1. 재료와 동물

1. 필요한 재료를 준비 하십시오: 75% 에탄올, 접착 테이프, 제 모기, 2ml 튜브, 1.0 주사기 (26G), 전자 저울, 헤 파 린 및 생리 식 염 수가 연결 되어 있습니다 ( 재료 표참조).
2. 동물: 6-8 주, 쿤밍 쥐 10 개를 준비 하 고, 무게 21.6g( 재료 표참조) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 따라 마우스를 유지¹³.

2. 마 취 및 동물 포지셔닝

1. 마 취 제의 필요한 복용량을 계산 하기 위해 마우스를 무게.
2. 전신 마 취를 유도 하기 위해 복 강 내 주사를 통해 나트륨 pentobarbital (60 mg/kg)을 주입 한다 (도 1). 노출 된 눈에 손상을 방지 하기 위해 절차의 시작 부분에 무 균 눈 윤 활 연 고를 적용 합니다.
   참고: 마우스는 페달 철수 반사, 꼬리 핀치, 또는 복 부 피부 핀치의 테스트에 모터 반응을 표시 하지 않는 경우 충분히 마 취 되는 것으로 간주 됩니다.
3. 마우스를 작업 테이블에 배치 하 고 테이블 가장자리에서 2-4 센티미터 떨어진 곳에서 정 맥 천자를 용이 하 게 합니다 (그림 2). 그림 2와 같이 편안한 자세로 사지를 고정 합니다. 전체 절차에는 삽 관 또는 기계 환기가 필요 하지 않습니다.
4. 면봉으로 infraclavicular 공간 주위에 제 모를 바릅니다.
5. 3 분 후, 제 모를 젖은 면봉으로 씻은 후 털과 눈에 보이는 먼지를 제거 하십시오.
6. Infraclavicular 공간을 75% 에탄올로 소독 한 다음 깨끗 한 거 즈로 말립니다.

3. 쇄 골 정 맥 천자 및 혈액 채취

1. 손가락으로 쇄 골 뼈의 위치와 우수한 흉 포를 식별 합니다.
2. 쇄 골 뼈의 중간에 가까운 펑크 사이트를 찾아 그것을 꼬리. 피부와 피하 조직을 고정 하기 위해 왼쪽 검지 손가락을 천자 부 위에 놓습니다 (그림 3).
3. 바늘을 위로 이동 하 고 뛰어난 흉 골을 향해 크랭크 합니다. 바늘이 피하 조직에 들어가면 오른손의 링 핑거를 뒤로 움직여 부 압을 형성 합니다 (그림 3).
   참고:이 단계 동안, 연산자 ´ s 오른손의 위치는 바늘이 수평 평면 보다 위쪽으로 이동 하기 위해 작업 테이블 보다 약간 낮은 해야 합니다. 동물이 테이블의 가장자리 근처에 배치 되는 이유입니다.
4. 주사기를 앞쪽으로 3-4 mm로 이동 하 되 주사기에 혈액이 배출 되지 않는 경우에는 멈 추 십시오. 그런 다음 주사기를 천천히 다시 그려 음수 압력을 유지 합니다. 대부분의 경우, 혈액은 다시 그릴 때 주사기에 들어갑니다.
5. 혈액이 주사기에 들어가면 주사기를 고정 하 고 필요한 양 (200 µ L)이 주사기에 수집 될 때까지 음압을 유지 합니다.
6. 혈액 수집 후, 찔린 바늘을 철회 하 고 출혈을 멈추게 하려면 1-2 분 동안 면봉으로 펑크 부위를 누르십시오. 그런 다음 마우스를 케이지에 반환 합니다.
   참고: 때때로, 하나는 그/그녀의 첫 번째 시도에서 혈액을 얻을 수 없습니다. 바늘의 방향을 횡 방향으로 조정 하 고 3.3-3.5 단계를 반복 합니다. 3 번의 시도가 혈액 샘플을 얻지 못하면 다른 쪽으로 전환 하십시오.
7. 혈액 샘플을 혈장 튜브에 옮겨 넣습니다.

4. 생쥐 회복

1. Pentobarbital 마 취가 적용 되는 동안 마우스가 다시 움직일 때까지 열 지원을 제공 하 여 회복 속도를 향상 시킵니다.

결과

이 과정을 10 번의 쿤밍 마우스에서 반복 하였다 (남성 n=5, 암컷 n=5, 중량 25.4 ± 2.0 g). 오른쪽에 9 개의 절차가 성공 했습니다. 한 케이스는 오른쪽에 있는 3 개의 시도에서 실패 하 고 혈액 수집은 왼쪽에 성공 했습니다. 시간 과정 (펑크에서 필요한 혈 중 량을 얻기까지)이 35-126 초 (평균 68.4 ± 26.4 s)에 해당 합니다. 혈액 채취 량은 약 200 µ L (평균 203 ± 11.6 µ L)으로 설정 하였다. 혈액 수집은 1 ~ 4 회 시도에 성공 했습니다. 혈액 샘플링은 두 마우스의 첫 번째 시도에 성공 하 고 한 번의 마우스에서 4 시도 후; 샘플링은 다른 마우스에서 2-3 시도를 했다. 모든 데이터는 표 1에 예시 하였다. 모든 동물은 혈액 채취 후 30 분 이내에 생존 하 고 회복 했습니다. 모든 관찰 된 매개 변수에 대 한 남녀 사이에 큰 차이가 없었다 (표 1).

그림 1 : 복 강 내 주사를 통한 전신 마 취 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 마우스의 부정사 위치. 참고: 여백 및 마우스 사이의 거리는 2-4 cm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 펑크 사이트와 운전자 손의 자세. 오른손의 링 핑거는 뒤로 이동 하 여 부 압을 형성 합니다. 왼손은 피부와 피하 조직을 고정 하기 위해 펑크 부 위에 횡 방향으로 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 쇄 골 조류 정 맥의 위치, 골 지 뼈 및 우수한 흉 선 포 사. 쇄 골의 정 맥에 있는 코스는 골 지 뼈 아래에 있으며 수 페리 어 포 사 아래에 있는 수 페리 어에 게 배출 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 시 술 중 용기 벽과 바늘 사이의 관계. (A) 쇄 골 정 맥의 벽은 바늘이 앞으로 이동함에 따라 서로 부착 되므로 혈액이 인출 될 수 없습니다. (B) 바늘을 뒤로 후퇴 시키면서, 벽은 서로 분리 되 고 피는 밖으로 인출 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

변수	합계 (n=10)	수 놈 (n=5)	암컷 (n=5)	P 값
본체 중량 (g)	25.3 ± 2.2	25.3 ± 3.0	25.4 ± 1.3	0.926
혈액 량 (μ l)	203.0 ± 11.6	208 ± 13.0	198 ± 8.4	0.187
시간 코스	68.4 ± 26.4	70.6 ± 35.1	66.2 ± 18.0	0.809
인출	2.3 ± 0.9	2.4 ± 1.1	2.2 ± 0.8	0.760
모든 관찰 된 매개 변수에 대 한 중요 한 성 차이가 없었다, 모든 P 값은 0.05 >.

표 1: 남녀 간의 관찰 된 매개 변수

토론

이 보고서는 쥐 (¹¹)에 있는 쇄 골 정 맥 천자를 통한 혈액 샘플링에 대 한 이전 연구의 확장을 나타낸다. 마우스가 가장 일반적으로 사용 되는 연구 동물 이기 때문에,이 기술은 또한 마우스에 적용 할 수 있는지 확인 하는 것이 가치가 있을 것 이다. 도전은 쇄 골 정 맥의 상대적으로 더 작은 직경에서 옵니다.

본 연구에서, 우리는 쥐에 있는 쇄 골 조류 천자가 혈액을 수집 하는 것이 가능 하 고 신뢰할 수 있는 방법 임을 발견 했습니다. 꼬리 정 맥 절단 또는 궤도 혈액 채취와 같은 종래의 방법과 비교 하 여, 본 방법의 윤리적 문제가 없다. 모든 동물은 혈액 추출의 약 200 µ L 후에 액체 보충 없이이 절차 후에 살아 나 고, 동물은 추가 실험 연구를 위해 이용 될 수 있었습니다. 이론적으로, 총 시료 부피 추출은 총 순환 혈 량의 10% 이상에 도달 하지 못하고 성인 동물의 총 부피는 55 내지 70의 몸 무게 이다. 이 연구에서 사용 된 쥐에 대 한 (21.6-28.3 g), 최대 부피 추출은 약 200 µ L 이어야 한다. 우리는 따라서 각 마우스에 대 한 200 µ L 주위 혈액 샘플링 금액을 설정. 혈압, 심 박수 및 기타 스트레스 매개 변수를 측정 할 수 없다는 것이이 보고서의 주요 제한 사항입니다.

충분 한 전신 마 취는 펑크의 성공을 보장 하는 또 다른 중요 한 문제입니다. 쥐는 바늘에 의해 혈관을 인 발 하는 리스크를 피하기 위하여 펑크 절차 도중 조용히 남아 있어야 합니다. 우리는 pentobarbital 나트륨에서 전신 마 취를 위한 60 밀리 그램/kg의 이상적인 마 취 깊이를 만족 시킬 수 있음을 발견 했습니다. 이 에이전트의 단점은 상대적으로 긴 복구 시간 (평균 약 30 분)입니다. 몇몇 기관에서, 아이 소 루 레인 흡입은 짧은 회복 시간을 위해 이용 되 고 대체 무감각 선택¹⁵로 고려 되어야 합니다.

쇄 골 정 맥의 위치는 도 4에 나타내 었 다. 정 맥의 얇은 벽과 저압 때문에, 쇄 골 정 맥의 전방 및 후방 벽은 바늘이 전진 하는 동안 바늘의 압력 하에 서로 부착 됩니다 (그림 5a). 플런저를 천천히 거꾸로 철회 하는 동안, 부착 된 벽은 자발적으로 분리 되 고, 바늘의 끝이 용기의 진정한 공동에 진입 할 수 있었고 혈액은 지속적인 부 압 하에서 주사기로 배출 될 수 있습니다 (그림 5b). 진공 혈액 수집 시스템의 사용¹⁶ 또한 혈액 수집을 선호 수 있습니다. 생쥐의 쇄 골 정 맥의 직경이 상대적으로 작기 때문에 숙련 된 운전자 에게도 고장이 발생할 수 있습니다. 초보자를 위해, 우리는 보고 된 쥐에 쇄 골 정 맥 천자를 권장¹¹. 쥐에서 여러 성공적인 펑크 시도 후, 쥐에서 쇄 골 정 맥 천자의 성공률은 크게 향상 될 수 있었다. 정확한 천공 위치는 쇄 골 뼈의 중간에 꼬리 있는지 확인. 위쪽으로 움직이는 바늘과 우수한 흉 골에 두개골은 성공적인 펑크를 보장 하는 다른 핵심 포인트입니다.

결론적으로, 쇄 골 정 맥 천자는 생쥐의 혈액 채취를 위한 안전 하 고 효과적인 방법입니다. 꼬리 정 맥 절단 및 복고풍 궤도 신경 총 혈액 수집 외에도이 방법은 실행 가능 하 고 안전 하며 마우스의 여러 시간 지점에서 관측 연구에 적합 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL syringe	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
75% ethanol	Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital of Central South University	made in Department of Pharmacy,The Second Xiangya Hospital of Central South Univesity
adhesive tape	3M Deutschland GmbH (Kamen, Germany)	1534-1
canvas gloves	for anesthesia
electronic scale	Dongguan Shengheng Electronics Co. Ltd (Dongguan, Guangdong Province, China)	KP-3000
epilating agent	France Yi Sha Cosmetics Co. Ltd (Guangzhou, Guangdong Province, China)	8281744
heparin (used concentration 10 U/mL, 2 mL, 12500 IU)	Nanjing Xinbai Pharmaceutical Co. Limited (Nanjing, Jiangsu Province, China)	H32025851
mice	Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd (Changsha, Hunan Province, China)	Kunming spcies
needle, 26G, 0.45 mm x 16 mm	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. Ltd (Weihai, Shandong Province, China)	20163151593
pentobarbital sodium (used solution 1%)	Merck	P-010-1ML
physiological saline, 100 mL	Hunan Kelun Pharmaceutical Co. Ltd (Yueyang, Hunan Province,China)	H43020454
stastical software	International Business Machines	SPSS Statistics 25
tube, 2 mL	Hubei Jinxing Technology & Development Co. Ltd (Wuhan Hubei Province, China)	MCT-150-C