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摘要

我们提出了一种相当简单和敏感的方法,用于准确定量小鼠肝脏中的胆管密度。该方法有助于确定遗传和环境修饰剂的影响,以及潜在疗法在胆汁疾病小鼠模型中的有效性。

摘要

老鼠被广泛用作研究胆汁疾病的模型。为了评估胆汁系统的发展和功能,使用了各种技术,包括血清化学、组织学分析和特定标记物的免疫染色。虽然这些技术可以提供有关胆汁系统的重要信息,但它们通常不能显示整个肝脏胆管 (BD) 发育缺陷的完整情况。部分原因在于小鼠肝脏能够强大的能力排出胆汁,即使在胆汁发育有显著损害的动物中也是如此。在这里,我们提出了一个简单的方法,以计算与每个门户静脉 (PV) 相关的 D 的平均数量,这些部分涵盖突变/转基因小鼠的所有叶。在这种方法中,肝脏以立体的方式安装和分割,以方便各种基因型和实验条件之间的比较。BD通过细胞角素染色胆汁的光学显微镜进行识别,然后除以肝脏部分的PV总数。例如,我们展示了这种方法如何能够清楚地区分野生型小鼠和Alagille综合征的小鼠模型。这里介绍的方法不能替代可视化胆汁树三维结构的技术。然而,它提供了一种简单而直接的方法,定量评估BD的发展和小鼠的导管反应形成程度。

引言

胆汁树是哺乳动物肝脏的关键部分,允许胆汁从肝细胞进入肠道。内肝胆管(BDs)是由胆囊形成,通过Notch和TGF+信号1,2与双电位肝细胞区分。正确规范和承诺胆汁及其组装成成熟的BD对肝胆内树的发展至关重要。随着肝脏在发育过程中或器官再生时生长,胆汁系统需要沿着肝脏发展,以确保适当的胆汁排水。此外,一些综合和非合成性疾病导致肝内3的缺乏。此外,一些急性和慢性肝病引起所谓的肝脏导管反应,这些反应被定义为存在大量细胞,这些细胞表示胆道标记,但不一定来自胆道细胞或形式专利BD4.在多系统紊乱阿拉吉勒综合征(ALGS),单体不全的诺奇配体锯齿1(JAG1)导致不良的BD形成和胆汁症5,6。我们的实验室最近证明,以前生成的Jag1杂物小鼠线7是ALGS 8中BD贫乏的动物模型。在这个ALGS的小鼠模型中,胆小板仍然存在。然而,他们未能承诺纳入成熟的专利BD8。因此,在BD缺乏模型中分析肝脏需要的不仅仅是胆汁的明显存在或缺乏。准确评估成熟性BD在肝脏中存在的程度非常重要。

在解剖病理学中,有公认的定量方法来评估BD是否存在9。例如,对人类患者ALGS的研究通常通过分析每个肝脏活检至少10个门户血管9,10来量化BD到门户静脉(PV)比率。分析形状和整体存在或缺乏专利的BD,结合血清化学,可以提供关于小鼠11,12,13的BD发展的宝贵信息。然而,小鼠可能失去大量的BD,只有血清胆红素水平8略有增加。因此,一种定量方法,评估每个PV存在的BD数量,可以提供更直接的测量在小鼠的BD不足程度。在最近的一份报告中,我们量化了所有肝瓣中每PV的BD数,并报告Jag1+/+动物8的BD与PV比显著下降。在分析过程中,我们注意到,尽管炎症反应和管道反应的程度有显著差异,但BD与PV比并没有表现出太大的变异性8。此外,对BD与PV比的量化使我们能够证明,在Jag1+/+动物中去除一个糖基转移酶基因Poglut1副本可以显著改善其BD不足8。在Jag1+/+背景下,血管平滑肌细胞中Poglut1的有条件损失会导致 BD 数量逐渐增加,这是适度的 (20-30%)在P7,但在成人8变得突出。再次,这项技术允许我们证明,即使在P7,这些动物的BD密度的增加是统计显著。值得注意的是,通过树脂铸造分析,也验证了4个月大时这种基因型的BD密度增加。8这些观察和其他报告测量了不同ALGS小鼠模型14、15的BD密度,这促使我们把这种方法纳入我们的整体策略,以分析各种突变体中的胆汁缺陷和转基因小鼠。

在这里,我们详细介绍了一个简单的技术,可用于检查小鼠肝脏疾病模型中的BD缺乏程度(图1)。在此方法中,与胆小球菌标记物 (CK) 8 和 CK19 (下到广谱 CK, wsCK) 共同染色用于可视化小鼠肝脏中的 BD 和未合并的胆汁。对α平滑肌活动蛋白(αSMA)的抗体被添加到染色中,以标记血管。系统分析涵盖所有肝叶的一节中的BD与PV比,确保对每种基因型分析大量的PV。由于我们的方法依赖于在二维图像中量化 BD 和 PV,因此它不适合研究给定突变对胆汁树的 3D 结构的影响或小胆管的完整性。然而,它为调查人员提供了一个简单而客观的策略,以评估小鼠的胆汁发育情况。

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研究方案

所有动物被安置在贝勒医学院的屏障动物设施,根据机构动物护理和使用委员会的指导方针和批准的动物协议。

1. 小鼠肝脏组织收集

  1. 为肝脏收获准备小鼠
    1. 使用胶然化小鼠安乐死。
    2. 执行小鼠的宫颈脱位,以确保死亡。
    3. 在肋骨笼下方约一英寸处进行横向切口。
    4. 露出肝脏的整个腹腔表面。
  2. 小鼠肝脏的收集
    1. 小心,用小剪刀,切开连接肝脏和腹部其他器官的韧带。
    2. 切穿普通BD,将肝脏从肠道中分离出来。
    3. 通过抓住胆囊小心地取出肝脏,并立即放入50 mL管中,填充至四分之三甲醛(PFA)。

2. 在石蜡中固定和嵌入肝脏

  1. 固定
    1. 将肝脏组织固定在 4%PFA 中 48 小时,温度为 4°C。
    2. 在4°C下用70%EtOH清洗组织1小时。
    3. 用95%EtOH洗涤组织两次,每次在4°C下洗涤1小时。
    4. 用100%EtOH洗涤组织两次,每次在4°C下洗涤1小时。
  2. 结算
    1. 在室温下,用清除剂(材料表)清洗肝组织三次,每次30分钟。
      注:第三次洗涤后,肝脏应感到僵硬。
  3. 嵌入石蜡
    1. 将组织盒放入石蜡中的组织模具中,进行3次涂片,每次30分钟。蜡应预热至 60°C。
    2. 将石蜡填充组织模具至四分之三高度,并保持在 60°C 的加热块上。
    3. 将肝脏放在模具中,腹腔面朝上。
    4. 小心地将模具从加热块中取出。
    5. 将盒顶放在模具上,用热液体石蜡顶放。
    6. 让模具和块冷却至室温过夜。
      注:组织块现在可以储存在室温下。

3. 分块肝组织

  1. 为切片准备块
    1. 将模具放在冰上 5 分钟,然后从模具中取出块。
    2. 用实验室纸巾在冰块和冰块之间放置冰块。
    3. 不切片时,将块保持在冰上,以获得最佳的组织切片效果。
  2. 分割肝块
    1. 使用微质元,首先从肝脏表面的背端分割开始。截面应为 5 μm。
    2. 检查解剖显微镜下的表层部分,以确保各部分没有被截层或折叠。
    3. 取一部分肝脏,包括牛叶。
      注:对于某些块,您将在同一组织切片上有左、中、右和牛叶。
    4. 对于同一幻灯片上不存在所有四个叶的块,继续切片,直到同一张幻灯片上出现左、中叶和右叶。

4. 用于 wsCK 和 _SMA 的免疫性基化学

  1. 免疫性化学的幻灯片处理
    1. 选择每个基因型的一张幻灯片进行分析。
    2. 在二甲苯中洗涤幻灯片 15 分钟,100% EtOH,95% EtOH,最后 70% EtOH(每个溶液 3 x 5 分钟)。
    3. 在去离子 H2O 中清洗幻灯片 5 分钟。
    4. 将幻灯片浸入抗原检索溶液中(基于Tris的高pH值)。
    5. 在压力锅中,在压力锅中加热 3 分钟,10 psi。
    6. 让幻灯片冷却至室温(约 35 分钟)。
  2. 阻塞组织部分
    1. 使用巴氏笔,勾勒幻灯片上的部分。
    2. 应用磷酸盐缓冲盐水(PBS)= 0.1%补间覆盖部分两次,每次5分钟。
    3. 通过在 PBS 中 1:50 混合正常山羊血清 (NGS) 进行阻塞缓冲液 = 0.3% Triton。为了有足够的缓冲液用于阻断和初级抗体的应用,每节100μL就足够了。
    4. 每节应用100μL的阻滞溶液。
    5. 在 4°C 下孵育堵塞溶液覆盖的幻灯片 1 小时。
  3. wsCK 和 _SMA 的染色
    1. 稀释抗CK8和抗CK19抗体16(发育研究杂交瘤库,TROMA-I和TROMA-III,分别)1:20在阻断缓冲液中染色的wsCK。在同一缓冲液中稀释抗βSMA抗体17(材料表)至1:200。
    2. 将含有所有三种抗体的稀释抗体溶液的100 μL涂抹到每个部分。
    3. 在4°C处孵育抗体溶液覆盖的幻灯片过夜。
    4. 用 PBS = 0.1% Triton 清洗幻灯片三次,每次 5 分钟。
    5. 稀释二级抗体(抗鼠-Alexa488和抗小鼠Cy5)1:200在PBS = 0.3%Triton。
    6. 将含有两种次级抗体的次级抗体的100μL涂在幻灯片上。
    7. 在室温下孵育1小时。
  4. DAPI 核染色和安装
    1. 洗幻灯片三次,每张5分钟。
    2. 在每个部分应用 100 μL DAPI (1:3000) 10 分钟。
    3. 将防褪色安装介质(材料表)涂抹到幻灯片上,并在组织部分顶部放置玻璃盖玻片。将幻灯片放在 4°C 过夜。第二天密封幻灯片。
    4. 将幻灯片存储在 4°C,并在安装后的 1 周内存储图像。

5. D的成像和定量

  1. 成像肝部分
    1. 在成像之前,在实验室成员的帮助下,自己看不到样本的基因型。确保所有成像文件没有基因型或其他特定的识别信息,除了动物/样本编号。
    2. 使用荧光显微镜,以每截面的 1 倍变焦拍摄 20 倍图像,并确保对肝脏的每个 PV 进行成像。包括左叶、中叶、右叶和牛叶。
      注:我们通常发现每个动物60-90个入口,这取决于肝脏的大小。
    3. 要识别 PV,请查看 _SMA 加 wsCK 染色。*SMA 阳性但缺少 wsCK 染色的结构不是门户结构。
  2. 身份证的识别和计数
    1. 创建包含以下列的电子表格:动物/样本编号、图像编号、PV 数和 BD 数。
    2. 遍历每个图像,识别并记录每个图像的 PV 数。
    3. 通过围绕可定义的流明存在的胆小子 (wsCK+) 来识别每个图像中的专利 BD。结构应该是不同的,并与其他wsCK®细胞的间质分离。
    4. 计算每个专利 BD 并放置在与图像编号相同的列中。
    5. 对 PV 拍摄的每个图像执行此操作。
    6. 计算肝脏样本中所有 PV 和所有 BD 的总和。
    7. 计算肝脏样本的 BD 与 PV 比率。

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结果

我们之前记录了Jag1+/+动物的胆汁缺陷,这是ALGS8的小鼠模型。为了确定BD与PV比,我们对P30小鼠肝脏进行切片,并将其与血管标记αSMA一起用于CK8和CK19(wsCK)。共染色。然后,我们拍摄了每个肝叶中的所有 PV。如图2A所示,我们将 PV 定义为具有相邻 wsCK 染色(箭头)的 _SMA 染色容器。没有 wsCK 的 _SMA 染色结构是中央静脉,不应包含在分析中(...

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讨论

小鼠BD发育与修复分析是研究胆囊性疾病发病机制和机理的重要工具。此外,新疗法的发展部分取决于建立可重复的,最好是可量化的表型。小鼠模型中的电流表示通常涉及血清化学、肝脏信息学和细胞类型特定标记物的免疫染色。虽然这些技术产生了关于胆管系统的结构和功能的宝贵信息,但它们不能直接测量给定基因操作对发育系统数量的影响。在解剖病理学中,通过分析活检第9...

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披露声明

提交人没有利益冲突。

致谢

作者感谢美国国家卫生研究院(R01 GM084135和R01 DK109982)的支持,来自德克萨斯州医疗中心消化疾病中心的试点/可行性奖,由NIH P30 DK56338颁发,阿拉吉勒综合征加速器奖来自医学基金会

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Isothesia (Isoflurane)Henry Schein11695-6776-2
DesiccatorBel-Art16-800-552
10% PFAElectron Microscopy Sciences15712
50 mL tubeThermoScientific339653
70% EthanolDecon Laboratories2401
95% EthanolDecon Laboratories2801
100% EthanolDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4Lclearing agent
Omnisette Tissue CassetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002Parrafin
Tissue MoldFisher Scientific62528-32
MicrotomeMicromHM 325
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
XyleneFisher ScientificC8H10
Tris-Based Antigen RetrievalVector LaboratoriesH-3301
Pressure CookerInstant PotLux Mini
Mini Pap PenLife Technologies8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)J.T. BakerX251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
Normal Goat SerumJackson Immunoresearch005-000-121
anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IAntibody Registry ID AB531826
anti-CK19Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IIIAntibody Registry ID AB2133570
anti-αSMASigma AldrichA2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488ThermoFisherA21208
anti-mouse-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 mm2 micro cover glassVWR Life Sciences48393 059
Fluorescence MicroscopeLeicaDMI6000 B
KimwipesKimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000Antifade Mounting Medium

参考文献

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