JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l'efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.

Abstract

Il topo è ampiamente usato come organismo modello per studiare le malattie biliari. Per valutare lo sviluppo e la funzione del sistema biliare, vengono utilizzate varie tecniche, tra cui la chimica del siero, l'analisi istologica e l'immunostaining per marcatori specifici. Anche se queste tecniche possono fornire importanti informazioni sul sistema biliare, spesso non presentano un quadro completo dei difetti dello sviluppo del dotto biliare (BD) in tutto il fegato. Ciò è in parte dovuto alla robusta capacità del fegato di topo di drenare la bile anche negli animali con compromissione significativa nello sviluppo biliare. Qui presentiamo un metodo semplice per calcolare il numero medio di BD associati a ogni vena del portale (PV) in sezioni che coprono tutti i lobi di topi mutanti/transgenici. In questo metodo, i fegati sono montati e sezionato in modo stereotipato per facilitare il confronto tra vari genotipi e condizioni sperimentali. I BD sono identificati tramite microscopia leggera dei cholangiociti macchiati di citokeratina, e quindi contati e divisi per il numero totale di FOTO presenti nella sezione epatica. Ad esempio, mostriamo come questo metodo possa distinguere chiaramente tra topi selvatici e un modello murino della sindrome di Alagille. Il metodo qui presentato non può sostituire le tecniche che visualizzano la struttura tridimensionale dell'albero biliare. Tuttavia, offre un modo semplice e diretto per valutare quantitativamente lo sviluppo della BD e il grado di formazione della reazione dudulare nei topi.

Introduzione

L'albero biliare è una parte critica del fegato dei mammiferi, permettendo il passaggio della bile dagli epatociti nell'intestino. I dotti biliari intraepatici (BD) sono formati da cholangiociti, che si differenziano dagli epatoblasti bipotenziali attraverso la segnalazione di Notch e TGF Una corretta specificazione e impegno dei cholangiocyti e del loro assemblaggio in BD maturi sono fondamentali per lo sviluppo dell'albero biliare intraepatico. Come il fegato cresce durante lo sviluppo o sulla rigenerazione dell'organo, il sistema biliare ha bisogno di sviluppare lungo il fegato per garantire il corretto drenaggio della bile. Inoltre, un certo numero di malattie sindromiche e non sindromiche si traducono nella scarsità di BD intraepatici3 . Inoltre, una serie di malattie acute e croniche del fegato danno origine alle cosiddette reazioni dudulle nel fegato, che sono definite come la presenza di un numero significativo di cellule che esprimono marcatori biliari ma non derivano necessariamente da cellule biliari o forme brevetto BD4. Nel disturbo multisistema la sindrome di Alagille (ALGS), aploinsufficienza del ligando di Notch(JAG1) provoca scarsa formazione di BD e colestasi5,6. Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che una lineadi mouse Jag1 eterozygous generata in precedenza è un modello animale di paucedia BD in ALGS8. In questo modello di topo di ALGS, i cholangiocytes sono ancora presenti. Tuttavia, non riescono a impegnarsi nell'incorporazione in maturi, brevetti BD8. Pertanto, l'analisi del fegato in un modello di paucity BD richiede più della presenza apparente o assenza di colgaliociti. È importante valutare con precisione il grado di presenza di BD maturi nel fegato.

Nella patologia anatomica, ci sono metodi quantitativi accettati per valutare se la paucity BD esiste9. Ad esempio, gli studi su ALGS su pazienti umani spesso quantificano il rapporto BD-vina porta (PV) analizzando almeno 10 vasi portali per biopsia epatica9,10. L'analisi della forma e la presenza complessiva o l'assenza di BD brevettati, combinati con la chimica del siero, possono fornire preziose informazioni sullo sviluppo di BD nei topi11,12,13. Tuttavia, i topi possono perdere un numero significativo di BD con solo un modesto aumento del livello biliarina del siero8. Di conseguenza, un metodo quantitativo che valuta il numero di BD presenti per fotovoltaico può fornire una misura più diretta del grado di scarsità di BD nei topi. In un recente rapporto, abbiamo quantificato il numero di BD per FOTO in tutti i lobi epatici e segnalato una significativa diminuzione del rapporto BD-PV in Jag1/– animali8. Nel corso della nostra analisi, abbiamo notato che, nonostante la variazione significativa nel grado di risposta infiammatoria e reazioni dudulare, il rapporto BD-PV non mostra molta variabilità8. Inoltre, la quantificazione del rapporto BD-PV ci ha permesso di dimostrare che la rimozione di una copia del gene glicosiltransferasi Poglut1 in Jag1- / gli animali possono migliorare significativamente la loro scarsità di BD8. In uno sfondo di Jag1/ , la perdita condizionale di Poglut1 nelle cellule muscolari limpiche vascolari si traduce in un aumento progressivo del numero di BD, che è modesto (20-30%) a P7 ma diventa prominente negli adulti8. Anche in questo caso, questa tecnica ci ha permesso di dimostrare che anche a P7, l'aumento della densità di BD in questi animali è statisticamente significativo. Da notare che l'aumento della densità di BD in questo genotipo a quattro mesi di età è stato convalidato anche attraverso l'analisi del getto di resina. 8 Queste osservazioni e altre relazioni che misuravano la densità di BD in diversi modelli murini ALGS14,15 ci hanno spinto a incorporare questo metodo nella nostra strategia complessiva per analizzare i difetti biliari in vari modelli mutanti e topi transgenici.

In questo caso, viene descritta in dettaglio una tecnica semplice che può essere utilizzata per esaminare il grado di scarsità di BD nei modelli murini di malattia epatica (Figura 1). In questo metodo, la co-colorazione con marcatori di colosso ciclica (CK) 8 e CK19 (in seguito ad ampio spettro CK, wsCK) viene utilizzata per visualizzare BD e cholangiocyte non incorporati nel fegato del topo. Un anticorpo contro l'actina muscolare alfa-liscio (SMA) viene aggiunto alla colorazione per etichettare i vasi. L'analisi sistematica del rapporto BD-PV in una sezione che copre tutti i lobi epatici assicura che un gran numero di fotocamere venga analizzato per ogni genotipo. Poiché il nostro metodo si basa sulla quantificazione di BD e PV in immagini 2D, non è adatto per studiare gli effetti di una determinata mutazione sulla struttura 3D dell'albero biliare o sull'integrità dei piccoli condotti biliari. Tuttavia, fornisce una strategia semplice e oggettiva per gli investigatori per valutare lo sviluppo biliare nel mouse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati alloggiati in una struttura per animali barriera presso il Baylor College of Medicine per le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e con protocolli animali approvati.

1. Collezione di tessuto epatico del topo

  1. Preparazione del topo per la raccolta del fegato
    1. Eutanasia il topo usando l'isoflurane.
    2. Eseguire lussazione cervicale del topo per garantire la morte.
    3. Fare un'incisione trasversale circa un pollice sotto la gabbia toracica.
    4. Esporre l'intera superficie ventrale del fegato.
  2. Raccolta del fegato di topo
    1. Con attenzione, con piccole forbici, tagliare i legamenti che collegano il fegato ad altri organi nell'addome.
    2. Tagliare il BD comune per staccare il fegato dall'intestino.
    3. Rimuovere con attenzione il fegato tenendo la cistifellea e immediatamente mettere in un tubo da 50 mL riempito a tre quarti dal 4% di paraformaldeide (PFA).

2. Fissare e incorporare il fegato in Paraffina

  1. fissazione f
    1. Fissare il tessuto epatico per 48 h in 4% PFA a 4 gradi centigradi.
    2. Lavare il tessuto con il 70% di EtOH per 1 h a 4 gradi centigradi.
    3. Lavare il tessuto due volte con il 95% EtOH per 1 h ciascuno a 4 gradi centigradi.
    4. Lavare il tessuto due volte con 100% EtOH per 1 h ciascuno a 4 gradi centigradi.
  2. libero
    1. Lavare il tessuto epatico con l'agente di compensazione (Tabella dei materiali) tre volte per 30 min ciascuno a temperatura ambiente.
      NOT: Il fegato dovrebbe sentirsi rigido dopo il terzo lavaggio.
  3. Incorporamento in paraffina
    1. Mettere la cassetta dei tessuti in uno stampo di tessuto in cera di paraffina per 3 lavamenti, 30 min ciascuno. La cera deve essere preriscaldata a 60 gradi centigradi.
    2. Riempire lo stampo di tessuto con cera di paraffina fino a tre quarti di altezza e tenere su un blocco di riscaldamento a 60 gradi centigradi.
    3. Posizionare il fegato nello stampo con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
    4. Rimuovere con attenzione lo stampo dal blocco di riscaldamento.
    5. Posizionare la parte superiore della cassetta sullo stampo e ricaricare con paraffina liquida calda.
    6. Lasciare raffreddare lo stampo e il blocco a temperatura ambiente durante la notte.
      NOT: I blocchi di tessuto possono ora essere conservati a temperatura ambiente.

3. Sezionamento del tessuto epatico

  1. Preparazione del blocco per il sezionamento
    1. Posizionare lo stampo sul ghiaccio per 5 min prima di rimuovere il blocco dallo stampo.
    2. Posizionare il blocco sul ghiaccio con una carta velina di laboratorio presente tra blocco e ghiaccio.
    3. Mantenere il blocco sul ghiaccio quando non sezionare per i migliori risultati di affettatura dei tessuti.
  2. Sezionamento dei blocchi di fegato
    1. Utilizzando un microtoma, iniziare sezionando attraverso il lato superficiale, dorsale del fegato. Le sezioni devono essere di 5 m.
    2. Controllare le sezioni superficiali al microscopio di dissezione per assicurarsi che le sezioni non siano tostate o piegate.
    3. Prendete una sezione del fegato che include il lobo caudato.
      NOT: Per alcuni blocchi, avrai i lobi sinistro, mediale, destro e caudato sulla stessa fetta di tessuto.
    4. Per quei blocchi in cui tutti e quattro i lobi non sono presenti sulla stessa diapositiva, continuare a tagliare fino a quando il sinistro, i lobi mediali e destro sono presenti sulla stessa diapositiva.

4. Immunoistochimica per wsCK e SMA

  1. Elaborazione di vetrini per immunoistochimica
    1. Selezionare una diapositiva per genotipo da analizzare.
    2. Lavare il vetrino per 15 min a Xylene, 100% EtOH, 95% EtOH e infine 70% EtOH (3 x 5 min in ogni soluzione).
    3. Lavare il vetrino per 5 min in deionizzato H2O.
    4. Immergere il vetrino nella soluzione di recupero dell'antigene (tris-based, high pH).
    5. Calore sotto pressione in una pentola a pressione per 3 minuti a 10 psi.
    6. Lasciare raffreddare il vetrino a temperatura ambiente (circa 35 min).
  2. Blocco delle sezioni tissutali
    1. Utilizzando una Pap Pen, delineare le sezioni sulla diapositiva.
    2. Applicare la salina tamponata da fosfati (PBS) - 0,1% Tween per coprire la sezione due volte, 5 min ciascuno.
    3. Fare il buffer di blocco mescolando normal Goat Serum (NGS) a 1:50 in PBS - 0.3% Triton. Per avere un buffer sufficiente sia per il blocco che per l'applicazione anticorpale primaria, è sufficiente 100 l per sezione.
    4. Applicare 100 l di soluzione di blocco per sezione.
    5. Incubare i vetrini coperti con la soluzione di blocco a 4 gradi centigradi per 1 ora.
  3. Colorazione per wsCK e SMA
    1. Diluire gli anticorpi anti-CK8 e anti-CK1916 (Developmental Studies Hybridoma Bank, TROMA-I e TROMA-III, rispettivamente) 1:20 nel buffer di blocco per macchiare per wsCK. Diluire l'anticorpo anti-SMA17 (Tabella dei materiali) a 1:200 nello stesso buffer.
    2. Applicare 100 l della soluzione anticorpale diluita contenente tutti e tre gli anticorpi per ogni sezione.
    3. Incubare i vetrini coperti con la soluzione anticorpale a 4 gradi centigradi durante la notte.
    4. Lavare i vetrini con PBS - 0.1% Triton tre volte, 5 min ciascuno.
    5. Anticorpi secondari diluiti (anti-ratto-Alexa488 e anti-topo-Cy5) 1:200 in PBS - 0.3% Triton.
    6. Applicare 100 l della soluzione anticorpale secondaria contenente entrambi gli anticorpi secondari ai vetrini.
    7. Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
  4. Colorazione e montaggio nucleare DAPI
    1. Lavare i vetrini tre volte, 5 min ciascuno.
    2. Applicare 100 l di DAPI (1:3000) a ciascuna sezione per 10 min.
    3. Applicare Antifade Mounting Medium (Tabella dei materiali) ai vetrini e posizionare una vetrina di vetro sopra le sezioni di tessuto. Lasciare i vetrini a 4 gradi durante la notte. Sigillare le diapositive il giorno successivo.
    4. Conservare le diapositive a 4 gradi centigradi e l'immagine entro 1 settimana dal montaggio.

5. Imaging e quantificazione dei BD

  1. Imaging sezioni epatiche
    1. Prima dell'imaging, accechi al genotipo del campione con l'aiuto di un membro del laboratorio. Assicurarsi che tutti i file di imaging siano privi di genotipo o altre informazioni di identificazione specifiche oltre a un numero animale/campione.
    2. Utilizzando un microscopio fluorescente, scatta 20x immagini a 1 volte lo zoom di ogni sezione e assicurati che ogni fotovoltaico attraverso il fegato sia immagine. Includere i lobi sinistro, mediale, destro e caudato.
      NOT: Di solito troviamo 60-90 tratti portale per animale a seconda delle dimensioni del fegato.
    3. Per identificare i PV, cercare la colorazione sMA più wsCK. Le strutture che sono positive per la SMA, ma che non dispongono di colorazione wsCK, non sono strutture del portale.
  2. Identificazione e conteggio dei BD
    1. Creare un foglio di calcolo con le seguenti colonne: Animale/Numero di esempio, Numero immagine, Numero di PV e Numero di BD.
    2. Passando attraverso ogni immagine, identificare e registrare il numero di PV per immagine.
    3. Identificare i BD brevettati in ogni immagine in base alla presenza di cholangiocytes (wsCK) che circondano un lume definibile. Le strutture devono essere distinte e separate da mesenchyme da altre celle wsCK.
    4. Contare ogni brevetto BD e posizionare nella stessa colonna del numero di immagine.
    5. Eseguire questa operazione per ogni immagine scattata da un PV.
    6. Calcolare la somma di tutti i PV e di tutti i BD nel campione del fegato.
    7. Calcolare il rapporto BD-PV per il campione di fegato.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

In precedenza abbiamo documentato i difetti biliari negli animali Jag1/– un modello murino di ALGS8. Per determinare il rapporto BD-PV, abbiamo sezionato i fegati di topo P30 e li abbiamo co-macchiati per CK8 e CK19 (wsCK) insieme al marcatore vascolare sMA. Abbiamo poi immaginato tutti i PV in ciascuno dei lobi epatici. Come illustrato nella Figura 2A, abbiamo definito i PV come vasi con colorazione sMA con colorazione wsCK...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

L'analisi dello sviluppo e della riparazione di BD nei topi è uno strumento importante per studiare la patogenesi e il meccanismo dei disturbi colestatici. Inoltre, lo sviluppo di nuove terapie dipende in parte dalla creazione di un fenotipo riproducibile e preferibilmente quantificabile. L'attuale fenotipizzazione nei modelli murini di solito coinvolge la chimica del siero, l'istologia del fegato e l'immunostaining per marcatori specifici di tipo cellulare. Sebbene queste tecniche generino informazioni preziose sulla s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono il sostegno del National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 e R01 DK109982), un Pilot/Feasibility Award del Texas Medical Center Digestive Disease Center sotto NIH P30 DK56338, e un Alagille Syndrome Accelerator Award da La Fondazione Medica.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Isothesia (Isoflurane)Henry Schein11695-6776-2
DesiccatorBel-Art16-800-552
10% PFAElectron Microscopy Sciences15712
50 mL tubeThermoScientific339653
70% EthanolDecon Laboratories2401
95% EthanolDecon Laboratories2801
100% EthanolDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4Lclearing agent
Omnisette Tissue CassetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002Parrafin
Tissue MoldFisher Scientific62528-32
MicrotomeMicromHM 325
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
XyleneFisher ScientificC8H10
Tris-Based Antigen RetrievalVector LaboratoriesH-3301
Pressure CookerInstant PotLux Mini
Mini Pap PenLife Technologies8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)J.T. BakerX251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
Normal Goat SerumJackson Immunoresearch005-000-121
anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IAntibody Registry ID AB531826
anti-CK19Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IIIAntibody Registry ID AB2133570
anti-αSMASigma AldrichA2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488ThermoFisherA21208
anti-mouse-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 mm2 micro cover glassVWR Life Sciences48393 059
Fluorescence MicroscopeLeicaDMI6000 B
KimwipesKimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000Antifade Mounting Medium

Riferimenti

  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
  3. Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
  4. Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
  5. Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235(1997).
  6. Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243(1997).
  7. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  8. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
  9. Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
  10. Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
  11. Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
  12. Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
  13. McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
  14. Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
  15. Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
  16. Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
  17. Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
  18. Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526(2010).
  19. Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
  20. Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
  21. Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
  22. Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
  23. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  24. Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
  25. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
  26. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272(2012).
  27. Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
  28. Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Biologia dello sviluppoNumero 146sviluppo epaticodotto biliarecitokeratinasegnalazione notchsindrome di AlagilleJag1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati