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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine recht einfache und empfindliche Methode zur genauen Quantifizierung der Gallengangsdichte in der Mausleber. Diese Methode kann bei der Bestimmung der Auswirkungen von genetischen und ökologischen Modifikatoren und der Wirksamkeit potenzieller Therapien in Mausmodellen von Gallenerkrankungen helfen.

Zusammenfassung

Maus wird allgemein als Modellorganismus verwendet, um Gallenkrankheiten zu untersuchen. Um die Entwicklung und Funktion des Gallensystems zu bewerten, werden verschiedene Techniken verwendet, einschließlich Serumchemie, histologische Analyse und Immunostainierung für bestimmte Marker. Obwohl diese Techniken wichtige Informationen über das Gallensystem liefern können, stellen sie oft kein vollständiges Bild der Gallengang (BD) Entwicklungsfehler in der gesamten Leber dar. Dies ist zum Teil auf die robuste Fähigkeit der Mausleber zurückzuführen, die Galle auch bei Tieren mit erheblichen Beeinträchtigungen in der Gallenentwicklung zu entwässern. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von BDs vor, die jeder Portalvene (PV) zugeordnet sind, in Abschnitten, die alle Lappen mutierter/transgener Mäuse abdecken. Bei dieser Methode werden Lebern in einer stereotypen Weise montiert und geschnitten, um den Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen und experimentellen Bedingungen zu erleichtern. BDs werden mittels Lichtmikroskopie von Cytokeratin-gefärbten Cholangiocyten identifiziert und dann gezählt und durch die Gesamtzahl der im Leberbereich vorhandenen PVs dividiert. Als Beispiel zeigen wir, wie diese Methode klar zwischen Wildtypmäusen und einem Mausmodell des Alagille-Syndroms unterscheiden kann. Die hier vorgestellte Methode kann keine Techniken ersetzen, die die dreidimensionale Struktur des Gallenbaums visualisieren. Es bietet jedoch eine einfache und direkte Möglichkeit, die BD-Entwicklung und den Grad der kanalulären Reaktionsbildung bei Mäusen quantitativ zu bewerten.

Einleitung

Der Gallenbaum ist ein kritischer Teil der Säugetierleber, so dass der Durchgang der Galle von Hepatozyten in den Darm ermöglicht. Intrahepatische Gallengänge (BDs) werden durch Cholangiozyten gebildet, die sich von bipotenten Hepatoblasten durch Notch und TGF-Signalisierung1,2unterscheiden. Die richtige Spezifikation und Das Richtige Engagement von Cholangiocyten und deren Montage in ausgereifte BDs sind entscheidend für die Entwicklung des intrahepatischen Gallenbaums. Da die Leber während der Entwicklung oder bei der Organregeneration wächst, muss sich das Gallensystem entlang der Leber entwickeln, um eine ordnungsgemäße Gallendrainage zu gewährleisten. Darüber hinaus führen eine Reihe von syndromischen und nicht-syndromischen Erkrankungen zu einem Mangel an intrahepatischen BDs3. Darüber hinaus führen eine Reihe akuter und chronischer Lebererkrankungen zu sogenannten kanalulären Reaktionen in der Leber, die definiert sind als das Vorhandensein einer signifikanten Anzahl von Zellen, die Gallenmarker exprimieren, aber nicht notwendigerweise aus Gallenzellen oder Patent BDs4. Bei der Multisystem-Störung Alagille-Syndrom (ALGS), Haploinsuffizienz der Kerb Liganden gezackt1 (JAG1) führt zu schlechter BD-Bildung und Cholestase5,6. Unser Labor hat kürzlich gezeigt, dass eine zuvor generierte Jag1 heterozygote Mauslinie7 ein Tiermodell von BD-Mangel in ALGS8ist. In diesem Mausmodell von ALGS sind Cholangiozyten noch vorhanden. Sie verpflichten sich jedoch nicht zur Aufnahme in ausgereifte, patente BDs8. Daher erfordert die Analyse der Leber in einem Modell der BD-Knappheit mehr als das scheinbare Vorhandensein oder Fehlen von Cholangiocyten. Es ist wichtig, genau zu beurteilen, inwieweit reife BDs in der Leber vorhanden sind.

In der anatomischen Pathologie gibt es anerkannte quantitative Methoden zur Beurteilung, ob BD-Mangel existiert9. Zum Beispiel, Studien an ALGS bei menschlichen Patienten oft quantifizieren die BD zu Portal Vene (PV) Verhältnis durch die Analyse von mindestens 10 Portalgefäße pro Leberbiopsie9,10. Die Analyse der Form und des Gesamtvorhandenseins oder Fehlens von Patent-BDs, kombiniert mit Serumchemie, kann wertvolle Informationen über die BD-Entwicklung bei Mäusen11,12,13liefern. Jedoch, Mäuse können eine erhebliche Anzahl von BDs mit nur einem bescheidenen Anstieg des Serum Bilirubin-Spiegel8verlieren. Dementsprechend kann eine quantitative Methode, die die Anzahl der pro PV vorhandenen BDs bewertet, ein direkteres Maß für den Grad des BD-Mangels bei Mäusen liefern. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht quantifizierten wir die Anzahl der BDs pro PV über alle Leberlappen hinweg und berichteten von einem signifikanten Rückgang des BD-PV-Verhältnisses bei Jag1+/– Tieren8. Im Laufe unserer Analyse stellten wir fest, dass trotz der signifikanten Variation des Grades der Entzündungsreaktion und der Kanalreaktionen das BD-PV-Verhältnis nicht viel Variabilitätaufweist 8. Darüber hinaus konnte die Quantifizierung des BD-PV-Verhältnisses nachweisen, dass das Entfernen einer Kopie des Glykosyltransferase-Gens Poglut1 in Jag1+/– Tiere ihren BD-Mangel deutlich verbessern kann8. In einem Jag1+/+ Hintergrund führt der bedingte Verlust von Poglut1 in vaskulären glatten Muskelzellen zu einem progressiven Anstieg der BD-Zahlen, der bescheiden ist (20-30%) bei P7, wird aber bei Erwachsenendeutlich 8. Auch diese Technik erlaubte es uns zu zeigen, dass selbst bei P7 die Zunahme der BD-Dichte bei diesen Tieren statistisch signifikant ist. Bemerkenswert ist, dass die erhöhte BD-Dichte in diesem Genotyp im Alter von vier Monaten auch durch Harzgussanalyse validiert wurde. 8 Diese Beobachtungen und andere Berichte, die die BD-Dichte in verschiedenen ALGS-Mausmodellen14,15 maßen, veranlassten uns, diese Methode in unsere Gesamtstrategie zur Analyse von Gallendefekten in verschiedenen Mutanten zu integrieren. und transgene Mäuse.

Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die verwendet werden kann, um den Grad des BD-Mangels in Mausmodellen von Lebererkrankungen zu untersuchen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wird die Co-Färbung mit den Cholangiozytenmarkern Cytokeratin (CK) 8 und CK19 (im Folgenden Wide-Spektrum CK, wsCK) verwendet, um BDs und ungekauzte Cholangiozyten in der Mausleber zu visualisieren. Ein Antikörper gegen alpha-glattes Muskelaktin wird der Färbung zur Kennzeichnung von Gefäßen hinzugefügt. Die systematische Analyse des BD-PV-Verhältnisses in einem Abschnitt, der alle Leberlappen abdeckt, stellt sicher, dass für jeden Genotyp eine große Anzahl von Pv-VVs analysiert wird. Da unsere Methode auf der Quantifizierung von BDs und PVs in 2D-Bildern beruht, ist sie nicht geeignet, die Auswirkungen einer gegebenen Mutation auf die 3D-Struktur des Gallenbaums oder die Integrität der kleinen Gallenschläuche zu untersuchen. Dennoch bietet es eine einfache und objektive Strategie für die Ermittler, die Gallenentwicklung in der Maus zu bewerten.

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Protokoll

Alle Tiere wurden in einer Barrieretieranlage am Baylor College of Medicine gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und gemäß den genehmigten Tierprotokollen untergebracht.

1. Sammlung von Maus Lebergewebe

  1. Vorbereitung der Maus für die Leberernte
    1. Euthanisieren Sie die Maus mit Isofluran.
    2. Führen Sie zervikale Dislokation der Maus, um den Tod zu gewährleisten.
    3. Machen Sie einen Querschnitt etwa einen Zoll unter dem Rippenkäfig.
    4. Setzen Sie die gesamte ventrale Oberfläche der Leber aus.
  2. Sammlung der Mausleber
    1. Vorsichtig, mit einer kleinen Schere, durch schneiden die Bänder, die die Leber mit anderen Organen im Bauch verbinden.
    2. Schneiden Sie durch die gemeinsame BD, um die Leber aus dem Darm zu lösen.
    3. Entfernen Sie die Leber vorsichtig, indem Sie an der Gallenblase festhalten und sofort in ein 50 ml-Rohr, das zu drei Vierteln mit 4% Paraformaldehyd (PFA) gefüllt ist, aufstellen.

2. Fixierung und Einbettung der Leber in Paraffin

  1. fixierung
    1. Fixieren Sie das Lebergewebe für 48 h in 4% PFA bei 4 °C.
    2. Waschen Sie das Gewebe mit 70% EtOH für 1 h bei 4 °C.
    3. Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 95% EtOH für je 1 h bei 4 °C.
    4. Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 100% EtOH für je 1 h bei 4 °C.
  2. lichtung
    1. Waschen Sie das Lebergewebe mit Clearingmittel (Tabelle der Materialien) dreimal für jeweils 30 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die Leber sollte sich nach der dritten Wäsche starr anfühlen.
  3. Einbettung in Paraffin
    1. Legen Sie die Gewebekassette in einer Gewebeform in Paraffinwachs für 3 Waschungen, jeweils 30 min. Wachs sollte auf 60 °C vorgewärmt werden.
    2. Füllen Sie die Gewebeform mit Paraffinwachs auf drei Viertel Höhe und halten Sie auf einem Heizblock bei 60 °C.
    3. Legen Sie die Leber in die Form mit der ventralen Seite nach oben.
    4. Entfernen Sie die Form vorsichtig aus dem Heizblock.
    5. Legen Sie die Oberseite der Kassette auf die Form und krumnet mit heißem flüssigen Paraffin.
    6. Lassen Sie die Form und block über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen.
      HINWEIS: Gewebeblöcke können nun bei Raumtemperatur gelagert werden.

3. Schnitt von Lebergewebe

  1. Vorbereitung des Blocks für die Schnitte
    1. Legen Sie die Form für 5 min auf Eis, bevor Sie den Block aus der Form entfernen.
    2. Legen Sie den Block auf Eis mit einem Labor-Gewebepapier zwischen Block und Eis vorhanden.
    3. Halten Sie den Block auf Eis, wenn Sie nicht schneiden für die besten Gewebe-Slicing-Ergebnisse.
  2. Schnitt der Leberblöcke
    1. Mit einem Mikrotom, beginnen Sie durch die oberflächliche, dorsale Seite der Leber zu abschnitt. Die Abschnitte sollten 5 m betragen.
    2. Überprüfen Sie die oberflächlichen Abschnitte unter einem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht geschoren oder gefaltet werden.
    3. Nehmen Sie einen Abschnitt der Leber, der den Caudate-Lappen enthält.
      HINWEIS: Für einige Blöcke haben Sie die linken, medialen, rechten und caudate Lappen auf der gleichen Gewebescheibe.
    4. Für Blöcke, in denen nicht alle vier Lappen auf derselben Folie vorhanden sind, fahren Sie fort, bis der linke, mittlere und rechte Lappen auf derselben Folie vorhanden sind.

4. Immunhistochemie für wsCK und SMA

  1. Verarbeitung von Dias für die Immunhistochemie
    1. Wählen Sie eine Folie pro zu analysierendem Genotyp aus.
    2. Waschen Sie die Rutsche für 15 min in Xylol, 100% EtOH, 95% EtOH und schließlich 70% EtOH (3 x 5 min in jeder Lösung).
    3. Waschen Sie die Rutsche für 5 min in deionisierte M2O.
    4. Tauchen Sie die Rutsche in die Antigen-Retrieval-Lösung (Tris-basiert, hoher pH-Wert).
    5. Unter Druck in einem Schnellkochtopf 3 min bei 10 psi erhitzen.
    6. Lassen Sie die Rutsche auf Raumtemperatur abkühlen (ca. 35 min).
  2. Blockieren der Gewebeabschnitte
    1. Beschreiben Sie mithilfe eines Pap-Stifts die Abschnitte auf der Folie.
    2. Setzen Sie Phosphat-gepufferte Saline (PBS) + 0,1% Tween auf, um den Abschnitt zweimal, jeweils 5 min abzudecken.
    3. Machen Sie blockieren Puffer durch Mischen Normal Goat Serum (NGS) bei 1:50 in PBS + 0.3% Triton. Um genügend Puffer sowohl für die Blockierung als auch für die primäre Antikörperanwendung zu haben, sind 100 l pro Abschnitt ausreichend.
    4. Tragen Sie pro Abschnitt 100 L Blockierlösung auf.
    5. Inkubieren Sie die mit der Sperrlösung bedeckten Dias bei 4 °C für 1 h.
  3. Färbung für wsCK und SMA
    1. Verdünnung von Anti-CK8- und Anti-CK19-Antikörpern16 (Developmental Studies Hybridoma Bank, TROMA-I bzw. TROMA-III) 1:20 im Sperrpuffer, um für wsCK zu färben. Verdünnen Sie den Anti-SMA-Antikörper17 (Materialtabelle) im selben Puffer auf 1:200.
    2. Tragen Sie 100 l der verdünnten Antikörperlösung auf, die alle drei Antikörper enthält, auf jeden Abschnitt auftragen.
    3. Inkubieren Sie die mit der Antikörperlösung bedeckten Dias über Nacht bei 4 °C.
    4. Waschen Sie die Dias mit PBS + 0,1% Triton dreimal, jeweils 5 min.
    5. Verdünnung von Sekundärantikörpern (Anti-Ratte-Alexa488 und Anti-Maus-Cy5) 1:200 in PBS + 0,3% Triton.
    6. Tragen Sie 100 l der sekundären Antikörperlösung auf, die beide sekundären Antikörper enthält, auf die Dias auf.
    7. Bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
  4. DAPI Kernfärbung und -montage
    1. Waschen Sie die Dias dreimal, jeweils 5 min.
    2. Tragen Sie 100 L DAPI (1:3000) auf jeden Abschnitt für 10 min auf.
    3. Antifade Mounting Medium (Materialtabelle) auf die Dias auftragen und einen Glasdeckel auf die Gewebeabschnitte legen. Lassen Sie die Dias bei 4 °C über Nacht. Versiegeln Sie die Dias am nächsten Tag.
    4. Bewahren Sie die Dias bei 4 °C auf und zeigen Sie das Bild innerhalb von 1 Woche nach der Montage.

5. Bildgebung und Quantifizierung von BDs

  1. Bildgebende Leberabschnitte
    1. Blinden Sie sich vor der Bildgebung mit Hilfe eines Labormitglieds für den Genotyp der Probe. Stellen Sie sicher, dass alle Bildgebungsdateien neben einer Tier-/Probennummer keinen Genotyp oder andere spezifische Identifizierungsinformationen enthalten.
    2. Nehmen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop 20x Bilder mit 1x Zoom pro Abschnitt auf und stellen Sie sicher, dass jede PV in der Leber abgebildet wird. Schließen Sie die linken, medialen, rechten und caudate Lappen ein.
      HINWEIS: Wir finden in der Regel 60-90 Portal-Trakte pro Tier, abhängig von der Größe der Leber.
    3. Um die PVs zu identifizieren, suchen Sie nach der Färbung von SMA plus wsCK. Strukturen, die "SMA positiv sind, aber keine wsCK-Färbung haben, sind keine Portalstrukturen.
  2. Identifikation und Zählung von BDs
    1. Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle mit den folgenden Spalten: Tier-/Beispielnummer, Bildnummer, Anzahl der PVs und Anzahl der BDs.
    2. Wenn Sie jedes Bild durchgehen, identifizieren und erfassen Sie die Anzahl der PVs pro Bild.
    3. Identifizieren Sie Patent-BDs in jedem Bild durch das Vorhandensein von Cholangiocyten (wsCK+), die ein definierbares Lumen umgeben. Strukturen sollten durch Mesenchym von anderen wsCK+-Zellen getrennt sein.
    4. Zählen Sie jedes Patent BD und platzieren Sie in der gleichen Spalte wie die Bildnummer.
    5. Tun Sie dies für jedes Bild, das von einer PV aufgenommen wurde.
    6. Berechnen Sie die Summe aller PVs und aller BDs in der Leberprobe.
    7. Berechnen Sie das BD-PV-Verhältnis für die Leberprobe.

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Ergebnisse

Wir haben bereits Gallendefekte bei Jag1+/– Tieren dokumentiert, einem Mausmodell von ALGS8. Um das BD-PV-Verhältnis zu bestimmen, haben wir P30-Mausleber geschnitten und für CK8 und CK19 (wsCK) zusammen mit dem Gefäßmarker SMA mitgefärbt. Wir haben dann alle PVs in jedem der Leberlappen abgebildet. Wie in Abbildung 2Adargestellt, haben wir PVs als "SMA-befleckte Gefäße" definiert, die benachbarte wsCK-Färbung (Pfeil...

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Diskussion

Die Analyse der BD-Entwicklung und -Reparatur bei Mäusen ist ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Pathogenese und des Mechanismus cholestatischer Erkrankungen. Darüber hinaus hängt die Entwicklung neuer Therapien zum Teil von der Etablierung eines reproduzierbaren und vorzugsweise quantifizierbaren Phänotyps ab. Aktuelle Phänotypisierung in Mausmodellen beinhaltet in der Regel Serumchemie, Leberhistologie und Immunostainierung für zelltypspezifische Marker. Obwohl diese Techniken wertvolle Informationen ü...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 und R01 DK109982), einen Pilot/Feasibility Award des Texas Medical Center Digestive Disease Center unter NIH P30 DK56338 und einen Alagille Syndrome Accelerator Award von Die Medical Foundation.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Isothesia (Isoflurane)Henry Schein11695-6776-2
DesiccatorBel-Art16-800-552
10% PFAElectron Microscopy Sciences15712
50 mL tubeThermoScientific339653
70% EthanolDecon Laboratories2401
95% EthanolDecon Laboratories2801
100% EthanolDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4Lclearing agent
Omnisette Tissue CassetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002Parrafin
Tissue MoldFisher Scientific62528-32
MicrotomeMicromHM 325
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
XyleneFisher ScientificC8H10
Tris-Based Antigen RetrievalVector LaboratoriesH-3301
Pressure CookerInstant PotLux Mini
Mini Pap PenLife Technologies8877
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)J.T. BakerX251-07
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
Normal Goat SerumJackson Immunoresearch005-000-121
anti-CK8Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IAntibody Registry ID AB531826
anti-CK19Developmental Studies Hybridoma BankTROMA-IIIAntibody Registry ID AB2133570
anti-αSMASigma AldrichA2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488ThermoFisherA21208
anti-mouse-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 mm2 micro cover glassVWR Life Sciences48393 059
Fluorescence MicroscopeLeicaDMI6000 B
KimwipesKimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000Antifade Mounting Medium

Referenzen

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